酶的发酵工程

第 二 章 酶 的 生 物 合 成 与 发 酵 生 产 提 取 分 离 法 微 生 物 细 胞 发 酵 产 酶 酶 的 生 产 方 法 生 物 合 成 法 植 物 细 胞 发 酵 产 酶 化 学 合 成 法 动 物 细 胞 发 酵 产 酶 第 一 节 酶 生 物 合 成 及 调 节一 、 酶 的 生 物 合 成 遗 传 信 息 传 递 的 中 心 法 则转录传递给RN A，再由RNA 蛋 白 质翻 译转 录 逆 转 录 复 制复 制 DNARNA （ 一 ） RNA的 生 物 合 成 -转 录 (transcription) 定 义 以 DNA为 模 板 ， 以 核 苷 三 磷 酸 为 底 物 ， 在RNA聚 合 酶 （ 转 录 酶 ） 的 作 用 下 ， 生 成 RNA分 子的 过 程 。. 转 录 模 板启 动 子 （ promotor) 终 止 子 (terminator)模 板 链 （ template strand）反 意 义 链 (antisense strand)编 码 链 (coding strand)有 意 义 链 (sense strand)5 53 3反 意 义 链 :指 导 转 录 作 用 的 一 条 DNA链有 意 义 链 :无 转 录 功 能 的 一 条 DNA链 . T C G A G T A CA G C T C A T GC G A G U A CG C A U RNA聚 合 酶有 意 义 链反 意 义 链 RNA PPi5 53GTP UTPCTP ATPUTPRNA在 DNA模 板 上 的 生 物 合 成335 RNA的 转 录 过 程 (三 步 )1.起 始2.延 长3.终 止 原 核 生 物 的 RNA聚 合 酶 (DDRP)E. coli的 RNA聚 合 酶 是 由 四 种 亚 基 组 成 的 五 聚 体（ 2 ） 核心酶（core enzyme） 全酶（holoenzyme） 起 始 因 子 RNA合 成 过 程起 始双 链 DNA局 部 解 开磷 酸 二 酯键 形 成 终 止 阶 段解 链 区 到 达基 因 终 点延 长 阶 段 5 3 RNA 启 动 子 （promotor) 终 止 子(terminator)5 RNA聚 合 酶5 35 355 3 离 开 RNA链 的 延 伸 图 解 3 5 RNA-DNA杂 交 螺 旋聚 合 酶 的 移 动 方 向新 生 RNA复 链 解 链有 义 链模 板 链 （ 反 义 链 ） 延 长 部 位 定 义 以 mRNA为 模 板 ， 以 氨 基 酸 为 底 物 ， 在 核 糖体 上 通 过 各 种 tRNA、 酶 和 辅 助 因 子 的 作 用 ， 合成 多 肽 链 的 过 程 。（ 二 ） 蛋 白 质 的 生 物 合 成 -翻 译 (translation) 酪 55 3AUGGUU UAC ACA酪 氨 酰 - tRNA反 密 码 mRNA密 码 与 反 密 码 的 碱 基 配 对 AUG ACA5 蛋 苏UGU GUU 3受 位(A位 )给 位(P位 )大 亚 基 小 亚 基 蛋 白 质 的 合 成 过 程 （ 大 肠 杆 菌 ）v 氨 基 酸 的 活 化v 肽 链 合 成 的 起 始v 肽 链 的 延 伸v 肽 链 合 成 的 终 止 与 释 放 氨 基 酸 的 活 化 与 转 运反 应 式 ：AA + tRNA + ATP 氨 酰 -tRNA合 成 酶氨 酰 -tRNA+AMP+PPi 对 于 E.coli而 言 ， 肽 链 合 成 时 的 第 一个 氨 基 酸 都 是 甲 酰 甲 硫 氨 酸 （ fMet） 。 在 核 糖 体 上 合 成 多 肽 （ 三 阶 段 ）1、 起 始 阶 段2、 延 伸 阶 段3、 终 止 阶 段 肽 链 合 成 的 起 始 阶 段1.mRNA与 小 亚 基 结 合 ： 形 成 30S-mRNA-IF3复 合 物2.AUG与 蛋 氨 酰 -tRNA结 合 ： 30S-mRNA-IF3 fMet-tRNA-IF2-GTP fMet-tRNA正 好 位 于 mRNA的 起 始 密 码 子 上 （ AUG） 。3.大 小 亚 基 结 合 IF1 30S起 始 复 合 物 AUG ACA5 3AUG ACA5 3UAC UACAUG ACA5 3小 亚 基 mRNA 蛋 氨 酰 tRNA GTP大 亚 基GDP+Pi受 位给 位 蛋 蛋肽 链 合 成 的 起 始 阶 段 肽 链 合 成 的 延 伸 阶 段1.进 位 :氨 基 酰 -tRNA进 入 受 位 ;2.转 肽 :形 成 肽 键 ,在 转 肽 酶 作 用 下 ,给 位 与 受 位 结 合 ;3.移 位 :核 蛋 白 体 向 3 端 移 动 一 个 密 码 子 的 位 置 ,空 出 受 位 ,不 断 地 进 位 、 转 肽 、 移 位 ,使 肽 链 延 长 。 AUG ACA5 3UAC蛋 苏UGU AUG ACA5 UAC蛋 苏UGUGUUAUG ACA5 UAC蛋 苏UGUGUUAUG ACA5 蛋 苏UGU GUU 33 3GTP GDP+PiGDP+Pi GTP起 始 复 合 体 进 位转 肽移 位 Mg+K+ 肽 链 合 成 的 终 止 阶 段1.出 现 终 止 密 码 并 与 终 止 因 子 结 合 ;2.肽 键 水 解 ,多 肽 释 放 ;3.tRNA,mRNA,大 小 亚 基 解 离 . AUG UAA5 UAC AUG UAA5 UAC3 3终 终AUG UAA5 UAC 3终5 3 UAC终 肽 链 二 、 酶 生 物 合 成 的 调 节定 义 ： 通 过 调 节 酶 合 成 的 量 来 控 制 微 生 物代 谢 速 度 的 调 节 机 制 ， 是 在 基 因 转 录 水 平 上进 行 的 。意 义 ： 通 过 阻 止 酶 的 过 量 合 成 ， 节 约 生 物合 成 的 原 料 和 能 量 。 操 纵 子 基 因 表 达 的 协 同 单 位操 纵 子 结 构 基 因 （ 编 码 蛋 白 质 , structural gene, S）控 制 部 位 操 纵 基 因 （ operator gene, O）启 动 子 （ promotor gene, P）Jacob and Monod的 基 因 操 纵 子 调 节 系 统 示 意 图 调 节 基 因 启 动 基 因 操 纵 基 因 结 构 基 因 DNA 转 录 （ -） RNA聚 合 酶 （ +） 转 录 翻 译 mRNA 翻 译 阻 遏 蛋 白 蛋 白 质 诱 导 剂 控 制 区 信 息 区操 纵 子 调 节 基 因 (regulator gene)： 可 产 生 一 种 组 成 型 调 节 蛋 白 (regulatory protein) （ 一 种 变 构 蛋 白 ） ， 通 过 与 效 应物 (effector) （ 包 括 诱 导 物 和 辅 阻 遏 物 ）的 特 异 结 合 而 发 生 变 构 作 用 ， 从 而 改 变 它 与操 纵 基 因 的 结 合 力 。 调 节 基 因 常 位 于 调 控 区 的 上 游 。 R P O S D N A CRP-cA M P复 合 物 CRP+cA M P cAMP-CRP复 合 物 的 作 用 示 意 图 启 动 基 因 （ promotor gene） （ 启 动 子 ） ： 有 两 个 位 点 ： （ 1） RNA聚 合 酶 的 结 合 位 点（ 2） cAMP-CAP的 结 合 位 点 。CAP： 分 解 代 谢 产 物 基 因 活 化 蛋 白 （ catabolite gene activator protein） ， 又 称 环 腺 苷 酸 受 体 蛋 白 (cAMP receptor protein， CRP） 。 只 有 cAMP-CRP复 合 物 结 合 到 启 动 子 的 位 点 上 ， RNA聚 合 酶 才 能 结 合 到 其 在 启 动 子 的 位 点 上 ， 酶 的 合 成 才能 开 始 。 操 纵 基 因 （ Operater gene） : 位 于 启 动 基 因 和 结 构 基 因 之 间 的 一 段 碱基 顺 序 ， 能 特 异 性 地 与 调 节 基 因 产 生 的 变 构蛋 白 结 合 ， 操 纵 酶 合 成 的 时 机 与 速 度 。结 构 基 因 （ Structural gene） : 决 定 某 一 多 肽 的 DNA模 板 ， 与 酶 有 各 自的 对 应 关 系 ， 其 中 的 遗 传 信 息 可 转 录 为 mRNA，再 翻 译 为 蛋 白 质 。 (二 ) 酶 合 成 调 节 的 类 型 1.诱 导 (induction) 组 成 酶 ： 细 胞 固 有 的 酶 类 。 诱 导 酶 ： 是 细 胞 为 适 应 外 来 底 物 或 其 结 构 类 似 物 而 临 时 合 成 的 一 类 酶 。 2.阻 遏 (repression) 分 解 代 谢 物 阻 遏 (catabolite repression) 反 馈 阻 遏 (feedback repression) 酶 合 成 诱 导 的 现 象 ： 已 知 分 解 利 用 乳 糖 的 酶 有 ： -半 乳 糖 苷 酶 ； -半 乳 糖 苷 透 过 酶 ； 硫 代 半 乳 糖 苷 转 乙 酰 酶 。实 验 ： （ 1） 大 肠 杆 菌 生 长 在 葡 萄 糖 培 养 基 上 时 ， 细 胞内 无 上 述 三 种 酶 合 成 ； （ 2） 大 肠 杆 菌 生 长 在 乳 糖 培 养 基 上 时 ， 细 胞 内 有上 述 三 种 酶 合 成 ； （ 3） 表 明 菌 体 生 物 合 成 的 经 济 原 则 ： 需 要 时 才 合 成 。 调 节基 因 操 纵基 因 乳 糖 结 构 基 因P LacZ LacY LacamRNA 阻 遏 蛋 白（ 有 活 性 ） 基 因 关 闭启动子 OR P LacZ LacY Laca调 节基 因 操 纵基 因 乳 糖 结 构 基 因启动子 OR mRNAZ mRNAY mRNAa 阻 遏 蛋 白（ 无 活 性 ） 基 因 表达mRNA A、 乳 糖 操 纵 子 的 结 构B、 乳 糖 酶 的 诱 导 乳 糖 阻 遏 蛋 白（ 有 活 性 ） 诱导 2.末 端 产 物 阻 遏 由 某 代 谢 途 径 末 端 产 物 的 过 量 累 积 引 起 的 阻 遏 。 酶 合 成 阻 遏 的 现 象 ： 实 验 ： （ 1） 大 肠 杆 菌 生 长 在 无 机 盐 和 葡 萄 糖 的 培 养 基 上 时 ， 检 测 到 细 胞 内 有 色 氨 酸 合 成 酶 的 存 在 ； （ 2） 在 上 述 培 养 基 中 加 入 色 氨 酸 ， 检 测 发 现 细 胞 内 色氨 酸 合 成 酶 的 活 性 降 低 ， 直 至 消 失 。 （ 3） 表 明 色 氨 酸 的 存 在 阻 止 了 色 氨 酸 合 成 酶 的 合 成 ，体 现 了 菌 体 生 长 的 经 济 原 则 :不 需 要 就 不 合 成 。 色 氨 酸 操 纵 子 酶 的 阻 遏调 节 基 因 操 纵 基 因 结 构 基 因mRNA酶 蛋 白阻 遏 蛋 白 不 能 与 操 纵 基 因 结 合 ，结 构 基 因 表 达 调 节 基 因 操 纵 基 因 结 构 基 因辅 阻 遏 物代 谢 产 物 与 阻 遏 蛋 白 结合 ， 使 之 构 象 发 生 变 化与 操 纵 基 因 结 合 ， 结 构基因 不 能 表 达 酶的诱导和阻遏操纵子模型 B.有 活 性 阻 遏 蛋 白 加 诱 导 剂A.有 活 性 阻 遏 蛋 白C.无 活 性 阻 遏 蛋 白 D.无 活 性 阻 遏 蛋 白 加 辅 阻 遏 剂 操 纵 基 因启 动 基 因调 节 基 因 结 构 基 因 阻 遏 蛋 白(有 活 性 ) 阻 遏 蛋 白 阻 挡 操 纵 基 因结 构 基 因 不 表 达诱 导 物 诱 导 物 与 阻 遏 蛋 白 结 合 ,使 阻 遏 蛋 白 不 能 起到 阻 挡 操 纵 基 因 的 作 用 ,结 构 基 因 可 以 表 达酶 蛋 白mRNA 阻 遏 蛋 白 不 能 跟 操 纵 基 因 结 合 , 结 构 基 因 可 以 表 达阻 遏 蛋 白 (无 活 性 ) 酶 蛋 白mRNA代 谢 产 物 与 阻 遏 蛋 白 结 合 ,从 而 使 阻 遏 蛋白 能 够 阻 挡 操 纵 基 因 ,结 构 基 因 不 表 达代 谢 产 物 调 控 方 式 阻 遏 蛋 白 添 加 物 与 操 纵 基因 结 合 阻 遏 效 应 举 例酶 的 诱 导 有 活 性 不 转 录 ，继 而 不 翻 译诱 导 物 转 录 ，继 而 翻 译 乳 糖 操纵 子酶 的 阻 遏 无 活 性 阻 遏 物 不 转 录 ，继 而 不 翻 译 色 氨 酸操 纵 子酶 合 成 的 诱 导 与 阻 遏 操 纵 子 模 型 调 控 作 用 对 比 3.分 解 代 谢 物 阻 遏n 指 细 胞 内 同 时 有 两 种 分 解 底 物 （ 碳 源 或 氮源 ） 存 在 时 ， 利 用 快 的 那 种 分 解 底 物 会 阻遏 利 用 慢 的 底 物 的 有 关 酶 合 成 的 现 象 。n 分 解 代 谢 物 的 阻 遏 作 用 ， 并 非 由 于 快 速 利用 的 甲 碳 源 本 身 直 接 作 用 的 结 果 ， 而 是 通过 甲 碳 源 （ 或 氮 源 等 ） 在 其 分 解 过 程 中 所产 生 的 中 间 代 谢 物 所 引 起 的 阻 遏 作 用 。 分 解 代 谢 物 阻 遏 现 象 ： 实 验 ： 细 菌 在 含 有 葡 萄 糖 和 乳 糖 的 培 养 基 上 生 长 ， 优先 利 用 葡 萄 糖 。 待 葡 萄 糖 耗 尽 后 才 开 始 利 用 乳 糖 ， 产生 了 两 个 对 数 生 长 期 中 间 隔 开 一 个 生 长 延 滞 期 的 “ 二次 生 长 现 象 ” (diauxie或 biphasic growth） 。 0 2 4 6 8020 4060 80 细胞浓度(OD) 时 间 (h) 这 一 现 象 又 称 葡 萄 糖 效 应 ，产 生 的 原 因 是 由 于 葡 萄 糖 降 解物 阻 遏 了 分 解 乳 糖 酶 系 的 合 成 。此 调 节 基 因 的 产 物 是 环 腺 苷 酸受 体 蛋 白 （ CRP） ,亦 称 降 解 物基 因 活 化 蛋 白 （ CAP） 。 分 解 代 谢 物 阻 遏R LacZ LacY LacamRNA mRNAZ mRNAY mRNAa 基 因 表达CAP基 因 结 构 基 因TCAP OCAP结合 部 位 RNA聚 合 酶 TcAMP -CAP P 葡 萄 糖分 解 代谢 产 物腺 苷 酸环 化 酶磷 酸 二 酯酶ATPcAMP5-AMP 抑 制激 活葡 萄 糖 降 解 物 与 cAMP的 关 系cAMPCAP： 降 解 物 基 因 活 化 蛋 白 （ catabolic gene activation protein）降 低 cAMP浓 度使 CAP呈 失 活 状 态 三 、 提 高 酶 产 量 的 策 略（ 一 ） 菌 种 选 育 （ 一 劳 永 逸 ） 1.诱 变 育 种 (1) 使 诱 导 型 变 为 组 成 型 选 育 组 成 型 突 变 株(2)使 阻 遏 型 变 为 去 阻 遏 型 选 育 营 养 缺 陷 型 突 变 株解 除 反 馈 阻 遏 选 育 结 构 类 似 物 抗 性 突 变 株解 除 分 解 代 谢 物 阻 遏 选 育 抗 分 解 代 谢 阻 遏 突 变 株 2. 基 因 工 程 育 种 （ 二 ） 条 件 控 制1. 添 加 诱 导 物 酶 的 底 物 类 似 物 最 有 效 。2. 降 低 阻 遏 物 浓 度 除 去 终 产 物产 物 阻 遏 添 加 阻 止 产 物 形 成 的 抑 制 剂 避 免 使 用 葡 萄 糖分 解 代 谢 物 阻 遏 避 免 培 养 基 过 于 丰 富 添 加 一 定 量 的 cAMP 3.添 加 表 面 活 性 剂 离 子 型 对 细 胞 有 毒 害 作 用表 面 活 性 剂 Tween 80 非 离 子 型 增 加 细 胞 通 透 性 TritonX 1004. 添 加 产 酶 促 进 剂 第 二 节 酶 发 酵 动 力 学 一 、 细 胞 生 长 动 力 学 在 分 批 培 养 (batch culture)过 程 中 ， 细 胞生 长 一 般 要 经 历 延 迟 期 、 指 数 生 长 期 、 减 速 期 、静 止 期 和 衰 亡 期 5个 阶 段 。 EDCBAO细 胞浓度 (g/L ) 培 养 时 间 (h ) 细 胞 生 长 曲 线 O-A 延 迟 期 A-B指 数 生 长 期 B-C减 速 期 C-D 静 止 期 D-E 衰 亡 期 营 养 物 浓 度 （ 生 长 限 制 基 质 浓 度 ） 和 生 长 速 率之 间 的 动 力 学 关 系 ： Monod模 型n :比 生 长 速 率 （ 1/h） （ specific growth rate）n max： 最 大 比 生 长 速 率 （ 1/h）n S： 营 养 物 浓 度 （ 生 长 限 制 基 质 浓 度 ） 克 /Ln Ks： 莫 诺 德 常 数 或 饱 和 常 数 或 营 养 物 利 用 常 数 克 /L，或 mol/L SK SXdtdX sm 1 二 、 产 酶 动 力 学 （ 一 ） 酶 生 物 合 成 的 模 式 根 据 酶 的 合 成 与 细 胞 生 长 之 间 的 关 系 ， 可 将 酶的 生 物 合 成 分 为 3种 模 式 ， 即 ： 同 步 合 成 型 生 长 偶 联 型 中 期 合 成 型 部 分 生 长 偶 联 型 延 续 合 成 型 非 生 长 偶 联 型 滞 后 合 成 型 1. 生 长 偶 联 型 （ 又 称 同 步 合 成 型 ） 酶 的 生 物 合 成 与 细 胞 生 长 同 步 。特 点 ： 酶 的 合 成 可 以 诱 导 ， 但 不 受 分 解 代 谢 物 阻 遏和 反 应 产 物 阻 遏 。 当 去 除 诱 导 物 、 细 胞 进 入 平 衡 期 后 ， 酶 的 合 成立 即 停 止 ， 表 明 这 类 酶 所 对 应 的 mRNA很 不 稳 定 。 a 酶 细 胞 细胞或酶浓 度 时 间 生 长 偶 联 型 中 的 特 殊 形 式 中 期 合 成 型 酶 的 合 成 在 细 胞 生 长 一 段 时 间 后 才 开 始 ， 而 在 细胞 生 长 进 入 平 衡 期 以 后 ， 酶 的 合 成 也 随 着 停 止 。特 点 ： 酶 的 合 成 受 产 物 的 反 馈 阻 遏 或 分 解 代 谢 物 阻 遏 。 所 对 应 的 mRNA是 不 稳 定 的 。 0 2 4 6 8 100.00.10.20.30.4 0.5 细 胞 浓 度 酶 浓 度细胞浓度 (OD 500) 酶浓度(U/mL) 时 间 (h) 枯 草 杆 菌 碱 性 磷 酸 酶 合 成 曲 线 2.部 分 生 长 偶 联 型 （ 又 称 延 续 合 成 型 ） 酶 的 合 成 在 细 胞 的 生 长 阶 段 开 始 ， 在 细 胞 生 长 进入 平 衡 期 后 ， 酶 还 可 以 延 续 合 成 较 长 一 段 时 间 。特 点 ： 可 受 诱 导 ， 一 般 不 受 分 解 代 谢 物 和 产 物 阻 遏 。 所 对 应 的 mRNA相 当 稳 定 。 b酶 细 胞 细胞 或酶浓度 时 间 0 40 80 12002040 60 细胞浓度 酶浓度酶浓度(单位/ml) 时间 (h) 0.012.525.037.550.0 细胞浓度(g/L) 黑 曲 霉 聚 半 乳 糖 醛 酸 酶 合 成 曲 线 3. 非 生 长 偶 联 型 （ 又 称 滞 后 合 成 型 ） 只 有 当 细 胞 生 长 进 入 平 衡 期 以 后 ， 酶 才 开 始 合 成并 大 量 积 累 。 许 多 水 解 酶 的 生 物 合 成 都 属 于 这 一 类 型 。特 点 ： 受 分 解 代 谢 物 的 阻 遏 作 用 。 所 对 应 的 mRNA稳 定 性 高 。 c酶细 胞细胞或酶浓度 时 间 0 20 40 60 80010203040 50 酶 浓 度 细 胞 浓 度细胞浓度 (g/L) 时 间 (h) 01020304050 酶浓度 (U) 黑 曲 霉 酸 性 蛋 白 酶 合 成 曲 线 总 结 ： 影 响 酶 生 物 合 成 模 式 的 主 要 因 素 高 ： 可 在 细 胞 停 止 生 长 后 继 1） mRNA的 稳 定 性 续 合 成 酶 差 ： 随 着 细 胞 停 止 生 长 而 终 止 酶 的 合 成 2） 培 养 基 中 阻 遏 物 的 存 在 不 受 阻 遏 ： 随 着 细 胞 的 生 长 而 开 始 酶 的 合 成 。 受 阻 遏 ： 细 胞 生 长 一 段 时 间 或 平 衡 期 后 ， 酶 才 开 始 合 成 。 酶 生 产 中 最 理 想 的 合 成 模 式 ：延 续 合 成 型 ： 发 酵 过 程 中 没 有 生 长 期 和 产 酶 期 的 明 显差 别 。 细 胞 开 始 生 长 就 有 酶 的 产 生 ， 直 至 细 胞 生 长 进入 平 衡 期 后 ， 酶 还 可 以 继 续 生 成 一 段 时 间 。 对 于 ：同 步 合 成 型 ： 提 高 对 应 的 mRNA的 稳 定 性 ， 如 降 低 发 酵 温 度 。滞 后 合 成 型 ： 尽 量 减 少 甚 至 解 除 分 解 代 谢 物 阻 遏 ， 使 酶 的 合 成 提 早 开 始 。中 期 合 成 型 ： 要 在 提 高 mRNA稳 定 性 以 及 解 除 阻 遏 两 方 面 努 力 。 (二 ) 产 酶 动 力 学一 般 产 酶 动 力 学 方 程 可 表 达 为 ： XdtdE 式 中 X 细 胞 浓 度 (g /L) 细 胞 比 生 长 速 率 (h-1) 生 长 偶 联 的 比 产 酶 系 数 (IU/g) 非 生 长 偶 联 的 比 产 酶 速 率 (IU/(gh) E 酶 浓 度 (IU/L) t 时 间 (h) 生 长 偶 联 型 XdtdE 部 分 生 长 偶 联 型 XXdtdE 非 生 长 偶 联 型 XdtdE 第 三 节 微 生 物 发 酵 产 酶 一 、 产 酶 微 生 物 的 分 离 和 选 育 1.优 良 产 酶 菌 种 应 具 备 的 条 件 （ 1） 酶 产 量 高 （ 2） 易 培 养 （ 生 长 速 率 高 、 营 养 要 求 低 ） （ 3） 遗 传 性 能 稳 定 ， 不 易 退 化 （ 4） 易 分 离 提 纯 （ 5） 安 全 可 靠 （ 不 是 致 病 菌 ） 2.常 用 的 产 酶 微 生 物Escherichia coli Pseudomonas Bacillus subtilis Micrococcus Streptococcus StreptomycesAspergillus nigerAspergillus oryzae MonascusPenicilliumTrichoderma Rhizopus Mucor Absidia Saccharomyces cerevisiae Candida 3. 产 酶 微 生 物 的 分 离 和 筛 选 1)样 品 的 采 集 :从 富 含 该 酶 作 用 底 物 的 场 所 采 集 样 品 2)富 集 培 养 : 投 其 所 好 ， 取 其 所 抗 3)分 离 获 得 微 生 物 的 纯 培 养 （ pure culture） 。 4)初 筛 ： 选 出 产 酶 菌 种 ， 以 多 为 主 。 5)复 筛 ： 选 出 产 酶 水 平 相 对 较 高 的 菌 株 ， 以 质 为 主 。 -淀 粉 酶 的 筛 选 蛋 白 酶 产 生 菌 的 获 得 方 法应用含酪蛋白的培养基 4.产 酶 微 生 物 优 良 菌 种 的 选 育 诱 变 育 种 原 生 质 体 融 合 育 种 基 因 工 程 育 种 二 .微 生 物 发 酵 产 酶 方 法 1.固 体 培 养 :特 别 适 合 于 霉 菌 培 养 2.液 体 培 养 :目 前 酶 发 酵 生 产 的 主 要 方 式 3.固 定 化 细 胞 :需 要 特 殊 的 固 定 化 细 胞 反 应 器 三 .微 生 物 酶 的 类 型 1.胞 外 酶 ： 大 多 是 水 解 酶 （ 如 淀 粉 酶 、 蛋 白 酶 、 纤 维 素 酶 、 果 胶 酶 ） ， 是 微 生 物 为 了 利 用 环 境 中 的大 分 子 而 释 放 到 细 胞 外 的 ， 即 使 胞 外 浓 度 很 高 ， 胞内 也 能 维 持 较 低 水 平 ， 受 到 的 调 节 控 制 少 。 2.胞 内 酶 ： 指 合 成 后 仍 留 在 细 胞 内 发 挥 作 用 的 酶 ，酶 活 性 和 浓 度 受 到 中 间 产 物 和 终 产 物 的 调 控 。 试 管 菌 种 培 养 茄 瓶 菌 种 培 养 摇 瓶 菌 种 培 养 孢 子 （ 菌 体 ） 悬 液 制 备 种 子 罐 菌 种 培 养 发 酵 罐 发 酵 发 酵 液 预 处 理 酶 的 分 离 纯 化 精 制 酶 发 酵 生 产 的 一 般 工 艺 流 程 第 四 节 动 、 植 物 细 胞 培 养 产 酶 与 微 生 物 细 胞 相 比 ， 动 物 细 胞和 植 物 细 胞 具 有 各 自 不 同 的 特 性 ，需 采 用 各 自 不 同 的 培 养 工 艺 。 动 物 细 胞 模 式 图 植 物 细 胞 结 构 植 物 、 动 物 、 微 生 物 细 胞 的 特 性 比 较细 胞 种 类 植 物 细 胞 微 生 物 细 胞 动 物 细 胞细 胞 大 小 /um 200 300 1 10 10 100倍 增 时 间 /h 12 0.3-6 15营 养 要 求 简 单 简 单 复 杂光 照 要 求 大 多 数 要 求 不 要 求 不 要 求对 剪 切 力 敏 感 大 多 数 不 敏 感 非 常 敏 感主 要 产 物 色 素 、 药 物 、香 精 、 酶 等 醇 、 有 机 酸 、 氨基 酸 、 抗 生 素 、核 苷 酸 、 酶 等 疫 苗 、 激 素 、单 克 隆 抗 体 、酶 等 三 者 之 间 的 差 异 主 要 有 ：植 物 细 胞 动 物 细 胞 微 生 物 细 胞 。动 物 细 胞 、 植 物 细 胞 的 生 产 周 期 比 微 生 物 长 。植 物 细 胞 和 微 生 物 细 胞 的 营 养 要 求 较 简 单 。植 物 细 胞 的 生 长 以 及 次 级 代 谢 物 的 生 产 要 求 一 定 的光 照 。植 物 细 胞 和 动 物 细 胞 对 剪 切 力 敏 感 。植 物 、 微 生 物 和 动 物 细 胞 的 主 要 目 的 产 物 各 不 相 同 。 一 、 植 物 细 胞 培 养 产 酶 1.植 物 细 胞 培 养 的 特 点 2.培 养 基 特 点 应 用 最 广 的 是 MS培 养 基 和 LS培 养 基 MS培 养 基 是 1962年 由 Murashinge和 Skoog为 烟 草 细 胞 培 养 而 设 计 的 培 养 基 。 LS培 养 基 是在 其 基 础 上 演 变 而 来 的 。 3.培 养 方 法 ： 悬 浮 细 胞 培 养 细 胞 株 的 建 立 ； 外 植 体 与 愈 伤 组 织 扩 大 培 养 ； 大 罐 培 养 ； 外 植 体 ： 从 植 株 取 出 ， 经 过 预 处 理 后 ， 用 于 植 物 组织 培 养 的 植 物 组 织 （ 包 括 根 、 茎 、 叶 、 芽 、 花 、果 实 、 种 子 等 ） 的 片 段 或 小 块 。愈 伤 组 织 ： 将 上 述 外 植 体 植 入 诱 导 培 养 基 中 ， 于 25左 右 培 养 一 段 时 间 ， 从 外 植 体 的 切 口 部 位 长 出小 细 胞 团 。 水 稻 的 外 植 体 （ 幼胚 ） 和 愈 伤 组 织外 植 体 愈 伤 组 织 4. 培 养 条 件 的 影 响 与 控 制（ 1） 温 度（ 2） pH（ 3） 通 气 与 搅 拌（ 4） 光 照 的 控 制（ 5） 前 体 的 添 加 （ 饲 喂 ）（ 6） 诱 导 子 （ elicitors） 的 应 用 5.植 物 细 胞 培 养 产 酶 实 例 以 大 蒜 细 胞 培 养 生 产 超 氧 化 物 歧 化 酶 （ SOD） 为 例(1)大 蒜 愈 伤 组 织 的 诱 导 选 取 结 实 、 饱 满 、 无 病 虫 害 的 大 蒜 蒜 瓣 ，去 除 外 皮 ， 先 用 70%乙 醇 消 毒 20s， 再 用 0.1%升汞 消 毒 10min， 然 后 无 菌 水 漂 洗 3次 。 在 无 菌 条 件 下 ， 切 成 0.5cm3的 小 块 ， 植 入含 有 3mg/L 2,4-D和 1.2mg/L 6-BA 的 半 固 体 MS培 养 基 中 ， 在 25 ， 600lux， 12h/d光 照 条 件下 培 养 18d， 诱 导 得 到 愈 伤 组 织 ， 每 18天 继 代一 次 。 (2)大 蒜 悬 浮 细 胞 培 养 将 上 述 在 半 固 体 MS培 养 基 上 培 养 18d的 愈伤 组 织 ， 在 无 菌 条 件 下 转 入 含 有 3mg/L 2,4-D和 1.2mg/L 6-BA （ 苄 基 腺 嘌 呤 ） 的 液 体 MS培 养 基 中 ， 加 入 灭 菌 的 玻 璃 珠 ， 25 ，600lux， 12h/d光 照 条 件 下 震 荡 培 养 18d， 使愈 伤 组 织 分 散 成 为 小 细 胞 团 或 单 细 胞 。 然 后 在 无 菌 条 件 下 ， 经 过 筛 网 将 小 细 胞团 或 单 细 胞 转 入 含 有 3mg/L 2,4-D和 1.2mg/L 6-BA 的 液 体 MS培 养 基 中 ， 25 ,600lux，12h/d光 照 条 件 下 震 荡 培 养 18d。 (3)酶 的 分 离 纯 化 细 胞 培 养 完 成 后 ， 收 集 细 胞 ， 经 过 细 胞破 碎 、 提 取 、 分 离 得 到 超 氧 化 物 歧 化 酶 。 二 、 动 物 细 胞 培 养 产 酶 1.动 物 细 胞 培 养 的 特 点细 胞 生 长 速 度 慢 。 （ 需 添 加 抗 生 素 ）细 胞 体 积 大 ， 无 细 胞 壁 保 护 ， 对 剪 切 力 敏 感 。反 应 过 程 成 本 高 ， 产 品 价 格 贵 。细 胞 具 有 锚 地 依 赖 性 。原 代 细 胞 一 般 繁 殖 50代 。 2.培 养 基 天 然 培 养 基 合 成 培 养 基 无 血 清 培 养 基 无 血 清 培 养 基 的 优 点 ： 提 高 了 细 胞 培 养 的 可 重 复 性 ， 避 免 了 血 清 批 次 之 间 差 异 的影 响 。 减 少 了 由 血 清 带 来 的 病 毒 、 真 菌 如 支 原 体 等 微 生 物 污 染 的危 险 。 供 应 充 足 稳 定 。 细 胞 产 品 易 于 优 化 。 避 免 了 血 清 中 某 些 因 素 对 细 胞 的 毒 性 。 减 少 了 血 清 中 蛋 白 对 某 些 生 物 测 定 的 干 扰 。 3.培 养 方 法 (1)悬 浮 培 养 (suspension culture)(2)贴 壁 培 养 (anchorage-dependent culture)(3)贴 壁 悬 浮 培 养 (pseudo-suspension culture) 微 载 体 培 养 (microcarrier culture) 包 埋 (entrapment)和 微 囊 (microencapsulation)培 养 结 团 培 养 (aggregate culture) n 悬 浮 培 养 让 细 胞 自 由 的 悬 浮 于 培 养 基 内 生 长繁 殖 的 培 养 方 法 。 优 点 ： 操 作 简 单 ， 培 养 条 件 均 一 ， 保质 供 氧 好 ， 容 易 扩 大 培 养 规 模 。 但 对 于大 多 数 具 有 锚 地 依 赖 性 的 动 物 细 胞 ， 不能 采 用 悬 浮 培 养 方 式 。 n 贴 壁 培 养 让 细 胞 贴 附 在 某 种 基 质 上 生 长 繁 殖 的培 养 方 式 。 优 点 与 悬 浮 培 养 正 好 相 反 。 缺 点 ： 操 作 麻 烦 ， 需 要 合 适 的 贴 附 材料 和 足 够 的 面 积 ， 培 养 条 件 不 易 均 一 ，保 质 和 供 氧 较 差 。 n 贴 壁 悬 浮 培 养n 又 称 假 悬 浮 培 养 ， 将 悬 浮 培 养 和 贴 壁 培养 巧 妙 结 合 的 培 养 方 法 ， 包 括 ： n a、 微 载 体 培 养 (microcarrier culture)n 将 葡 聚 糖 等 微 小 颗 粒 加 入 到 培 养 基 ， 动物 细 胞 可 贴 附 在 颗 粒 表 面 生 长 。n 特 点 ： 贴 附 面 积 大 ， 供 细 胞 贴 附 生 长 繁殖 ； 载 体 体 积 小 ， 比 重 轻 ， 可 悬 浮 在 培养 基 内 。 n b、 包 埋 (entrapment)和 微 囊(microencapsulation)培 养 与 微 载 体 的 不 同 之 处 ： 细 胞 不 是 贴 附 在 载体 表 面 ， 而 是 被 包 埋 或 包 裹 在 凝 胶 载 体 内 。 优 点 ： 保 护 细 胞 免 受 剪 切 力 的 损 害 ； 实 现动 物 细 胞 高 密 度 大 规 模 培 养 ； 有 利 于 下 游 产物 纯 化 。n c、 结 团 培 养 (aggregate culture) 利 用 细 胞 本 身 作 为 基 质 ， 相 互 贴 附 后 ， 再用 悬 浮 法 培 养 。 优 点 ： 操 作 简 便 ， 节 省 了 用 微 载 体 的 成 本 。 4.培 养 条 件 的 影 响 与 控 制（ 1） 温 度 ： 一 般 控 制 在 36.5 .（ 2） pH值 ： 一 般 控 制 在 7.0-7.6的 微 碱 性 范 围 内 。（ 3） 渗 透 压 : 应 与 细 胞 内 渗 透 压 相 同 。（ 4） 溶 解 氧 ： 根 据 情 况 随 时 调 节 。 思 考 题 ：1. 简 述 转 录 与 翻 译 过 程 。2. 用 操 纵 子 模 型 解 释 酶 的 诱 导 与 阻 遏 机 制 （ 末 端 产 物 、分 解 代 谢 产 物 ）3. 根 据 酶 生 物 合 成 的 调 节 类 型 及 机 制 说 明 如 何 提 高 酶的 产 量 。4. 酶 生 物 合 成 的 模 式 及 影 响 因 素 。5. 优 良 产 酶 微 生 物 菌 种 的 获 得 途 径 及 各 自 特 点 （ 自 己整 理 ） 。6. 比 较 动 物 植 物 和 微 生 物 在 细 胞 结 构 、 培 养 基 和 培 养方 式 上 的 不 同 。7. 一 些 概 念 的 区 别 ： 操 纵 子 与 操 纵 基 因 、 诱 导 酶 与组 成 酶 、 胞 内 酶 与 胞 外 酶 、 外 植 体 与 愈 伤 组 织 、 初 筛与 复 筛