《霍乱弧菌检测》PPT课件

宁 波 市 疾 控 中 心 微 生 物 检 验 科杨 元 斌 霍 乱 弧 菌 （ V.cholera） 是 人 类 霍 乱 的 病 原体 ， 霍 乱 是 一 种 古 老 且 流 行 广 泛 的 烈 性 传染 病 之 一 。 曾 在 世 界 上 引 起 多 次 （ 7次 ） 大流 行 。 主 要 表 现 为 剧 烈 的 呕 吐 、 腹 泻 、 失 水 ， 死亡 率 甚 高 。 属 于 国 际 检 疫 的 烈 性 传 染 病 。 霍 乱 弧 菌 属 于 弧 菌 科 弧 菌 属 ， 革 兰 染 色 阴 性菌 体 短 小 ， 稍 弯 曲 ， 两 端 钝 圆 ， 长 1.52.0m,宽 0.3 0.4m 。菌 体 尾 端 有 鞭 毛 ， 运 动 极 为 活 泼 ， 在 暗 视 野显 微 镜 下 呈 流 星 样 运 动 ， 培 养 温 度 以 37 为最 适 宜 ， 在 碱 性 （ PH8.8 9.0） 肉 汤 或 蛋 白胨 培 养 基 上 易 于 生 长 。 革兰染色 鞭毛染色 根 据 O抗 原 的 特 异 性 ， 可 将 霍 乱 弧 菌 分 成 139个 血 清 群 。 根 据 是 否 与 O1抗 血 清 凝 集 分 两 大 群 ， O1群 霍 乱 弧 菌 ： 凡 能 与 O1群 抗 血 清 发 生 凝 集非 O1群 霍 乱 弧 菌 ： 凡 不 被 O1群 抗 血 清 凝 集 的 。 1、 古 典 生 物 型 （ 前 六 次 大 流 行 ）2、 E1 Tor 生 物 型 （ 第 7次 1961年 来 ） 。两 个 生 物 型 具 有 相 同 的 血 清 型 。 我 国 流 行 以El Tor霍 乱 弧 菌 为 主 。 O1群 霍 乱 弧 菌 的 血 清 分 型型 别 别 名 O抗 原 成 份原 型 稻 叶 型 （ Inaba） A、 C异 型 小 川 型 （ Ogawa） A、 B中 间 型 彦 岛 型（ Hikojima） A、 B、 C O139群 霍 乱 弧 菌 1992年 ， 在 印 度 印 度 马 德 拉 斯 、 泰 米 尔 纳德 发 生 的 霍 乱 疫 情 ， 分 离 到 的 菌 株 不 与 O1群 霍 乱 血 清 凝 集 ， 但 是 引 起 O1群 霍 乱 的 典型 症 状 。 引 起 WHO重 视 ， 定 为 O139群 霍乱 弧 菌 ， 被 认 为 下 一 次 霍 乱 大 流 行 主 角 。 O139的 生 物 学 特 征 ： 生 化 特 征 与 O1菌 基 本 相 同 。 含 有 与 O1群 霍 乱 弧 菌 相 同 毒 力 基 因 除 O抗 原 不 同 外 ， 其 它 性 状 均 与 EL-Tor生 物 型 相 似 。 毒 力 蛋 白 及 其 调 控 因 子 与 El-Tor霍 乱 具 有 高 度 同 源的 编 码 。 O139菌 可 以 产 生 荚 膜 与 O1群 霍 乱 无 交 叉 免 疫 力 环 境 适 应 能 力 强 耐 药 性 强 1、 粪 便 采 集（ 1） 采 样 应 在 发 病 早 期 ， 服 用 抗 菌 药 物 之前 完 成 ， 并 尽 快 送 到 检 验 室 。 粪 便 标 本 采集 方 法 如 下 ： 用 棉 拭 子 采 取 自 然 排 出 的 新鲜 大 便 ， 也 可 用 直 肠 棉 拭 或 采 便 管 由 肛 门插 入 直 肠 内 3cm-5cm处 采 取 ， 水 样 便 采 取1ml-3ml， 成 型 便 采 取 指 甲 大 小 的 粪 便 量 。 病 人 的 呕 吐 物 ， 沾 染 粪 便 的 衣 服 和 用 具 ，也 可 作 为 检 材 。 （ 2） 送 检 剧 烈 腹 泻 病 人 的 水 样 便 含 有 大量 病 菌 ， 直 接 分 离 培 养 不 难 检 出 阳 性 。 不能 立 即 检 查 的 ， 要 接 种 于 培 养 基 内 ， 尽 快送 往 检 验 室 。 送 检 标 本 可 放 入 （ PH8.6-9.0）碱 性 蛋 白 胨 水 ， 也 可 放 入 文 腊 二 氏 保 存液 或 插 入 Cary-Blair二 氏 半 固 体 保 存 培 养基 中 。 水 体 的 采 样 一 般 要 求 用 灭 菌 的 500ml 水 样瓶 采 集 相 对 静 止 的 30cm 以 内 ） 500ml，加 盖 密 封 后 在 室 温 表 层 水 。 取 水 点 的 选 择应 结 合 流 行 病 学 调 查 等 资 料 确 定 ， 同 时 ，采 样 时 应 选 择 在 水 流 平 稳 或 静 止 处 吸 取 。非 疫 情 状 态 下 的 监 测 采 样 时 间 一 般 在 清 晨时 ， 此 时 水 体 未 受 人 群 活 动 等 因 素 影 响 。每 个 采 样 点 中 采 样 位 置 应 相 距 数 米 、 采 集不 少 于 2 瓶 做 为 平 行 检 测 。 （ 20-25 ）下 送 实 验 室 检 测 。 水 生 动 物 的 采 样 通 常 选 取 活 的 或 新 鲜 的 水 生 动物 为 采 集 对 象 ， 有 时 也 应 考 虑 冰 冻 的 水 生 动 物 ， 以 无 菌 操 作 采集 合 适 的 部 位 ， 如 鳃 部 和 /或 肠 内 容 物 等 ， 置 采 样 瓶 （ 管 ） 或 食 品 采 样 袋 密 封 ，在 常 温 下 送 检 。 有 条 件 的 采 样 点 可 将 水 生 动 物 整 体 采 回 实 验 室 再 进 行 相 关 处 置 。同 时 ， 要 求 以 无 菌 棉 签 涂 抹 五 只 （ 条 ） 以 上 的某 类 水 生 动 物 体 表 、 鳃 及 /或 肛 门 ， 置 碱 性 蛋白 胨 水 送 检 ， 每 管 碱 性 蛋 白 胨 水 作 一 份 样 品 看待 。 先 以 碱 性 蛋 白 胨 水 （ pH 8.6） 作 为 增 菌 液 ； 再 用 强 选 择 性 分 离 培 养 基 使 用 庆 大 霉 素 培养 基 或 TCBS 培 养 基 或 4号 培 养 基 ； 弱 选 择 性 培 养 基 使 用 碱 性 琼 脂 或 碱 性 胆 盐 。 应 注 意 不 同 厂 商 以 及 不 同 批 号 培 养 基 的 质量 ， 每 批 培 养 基 在 使 用 前 必 须 进 行 质 量 检测 。 检 样 经 碱 性 胨 水 37 ， 8-12h 增 菌 后 ， 每份 样 品 分 别 接 种 一 个 9cm 直 径 的 庆 大 霉 素 琼 脂或 TCBS 琼 脂 平 板 和 一 个 碱 性 琼 脂 平 板 进 行 划线 分 离 培 养 。 同 时 ， 以 无 菌 吸 管 吸 取 0.2-0.5ml 增 菌 液 接种 到 新 的 碱 性 蛋 白 胨 水 中 ， 进 行 二 次 增 菌 培 养后 ， 再 如 上 述 步 骤 进 行 划 线 分 离 培 养 。 特 别 强 调 所 有 环 境 样 品 的 增 菌 分 离 培 养 步 骤 必须 包 括 上 述 二 次 增 菌 和 强 、 弱 双 平 板 分 离 。 TCBS上 出 现 黄 色 菌 落 ， 4号 琼 脂 或 庆 大 霉素 平 板 上 出 现 灰 褐 色 中 心 的 菌 落 ， 均 为 可疑 菌 落 ， 应 使 用 O1群 和 O139群 霍 乱 弧 菌的 多 价 和 单 价 抗 血 清 进 行 玻 片 凝 集 试 验 ，结 合 菌 落 特 征 和 菌 体 形 态 ， 作 出 初 步 报 告 。 分 别 从 庆 大 霉 素 琼 脂 或 TCBS 琼 脂 、 碱 性 琼 脂平 板 上 各 挑 取 5 个 以 上 的 （ 少 于 5 个 的 全 部 挑取 ） 疑 似 菌 落 接 种 于 营 养 琼 脂 斜 面 置37 18-24h 纯 培 养 （ 即 每 份 样 品 至 少 从 4 个 分 离 平 板 上 获 得 约 20 株 可 疑 菌 落 菌 株 ） ，取 斜 面 纯 培 养 物 进 行 O1 群 及 O139 群 霍 乱诊 断 血 清 玻 片 凝 集 试 验 ， 血 清 凝 集 阳 性 的 菌 株继 续 相 关 的 系 统 鉴 定 并 报 告 结 果 。 必 须 注 意 同一 样 品 中 O1、 O139群 霍 乱 弧 菌 可 能 同 时 存在 ， 有 必 要 对 所 有 选 出 的 菌 株 都 进 行 凝 集 试 验 ，以 免 遗 漏 。 用 于 霍 乱 弧 菌 的 鉴 定 试 验 有 ： 霍 乱 红 试 验 :霍 乱 弧 菌的 两 种 生 物 型 均 呈 阳 性 反 应 ， 但 是 ， 本 反 应 并 非 霍 乱 弧菌 特 有 ， 许 多 能 分 解 色 氨 酸 和 还 原 硝 酸 盐 的 细 菌 ， 均 能产 生 阳 性 反 应 ； 糖 发 酵 试 验 :霍 乱 弧 菌 分 解 葡 萄 糖 、蔗 糖 、 甘 露 醇 产 酸 不 产 气 ， 不 发 酵 阿 拉 伯 糖 ； 粘 丝 试验 :弧 菌 属 细 菌 除 副 溶 血 弧 菌 部 分 菌 株 外 ， 均 有 此 反 应 ； O/129敏 感 试 验 ： 参 照 药 敏 试 验 方 法 进 行 。 将O/129 10 g和 150 g的 纸 片 贴 在 接 种 有 待 测 菌 的琼 脂 平 板 上 ， 35 孵 育 18 24h后 ， 纸 片 周 围 出 现 任何 大 小 的 抑 菌 环 均 为 敏 感 ； O1群 和 非 O1群 霍 乱 弧 菌 均敏 感 ， 但 已 有 对 O/129耐 药 的 菌 株 出 现 ； O139群 对O/129耐 药 ， 用 此 试 验 作 鉴 定 时 需 特 别 谨 慎 ， 需 结 合其 他 试 验 结 果 加 以 综 合 考 虑 ； 耐 盐 试 验 :霍 乱 弧 菌 可在 不 含 氯 化 钠 和 含 有 6 氯 化 钠 培 养 基 中 生 长 ， 氯 化 钠浓 度 高 于 6 则 不 生 长 。 标 本 增 菌 培 养碱 性 蛋 白 胨 水 分 离 培 养 （ TCBS、 碱 性 平 板 ） 生 化 鉴 定 分 型血 清 学 鉴 定确 诊 报 告初 步 报 告 快 速 诊 断 直 接 涂 片 动 力 、 制 动 试 验 谢 谢 大 家 ！