DNA的粗提取与鉴定 实验报告课件.ppt

DNA在 在 NaCl溶 液 浓 度 低 于0.14 mol/L时 ， DNA的 溶解 度 随 NaCl溶 液 浓 度 的增 加 而 逐 渐 降 低 ； 在0.14 mol/L时 ， DNA溶 解度 最 小 ； 当 NaCl溶 液 浓度 继 续 增 加 时 ， DNA的 溶解 度 又 逐 渐 增 大 。当 氯 化 钠 的 物 质 的 量 浓度 为 2 mol L时 ， DNA的 溶 解 度 最 大 ， 浓 度 为 0 14 mol L时 ， DNA的溶 解 度 最 低 。 利 用 这 一原 理 ， 可 以 使 DNA在 盐 溶液 中 溶 解 或 析 出 。 DNA的 鉴 定 DNA 的粗提取与鉴定 实 验 原 理 DNA在 不 同 浓 度 NaCl溶 液 中 溶 解 度 不 同DNA与 其 他 细 胞 成 分 在 酒 精 中 溶 解 度 不 同DNA和 蛋 白 质 对 酶 、 高 温 和 洗 涤 剂 耐 受 性 不 同DNA与 二 苯 胺 呈 现 蓝 色 反 应DNA粗 提 取 选 择 适 宜 材 料 破 碎 细 胞DNA的 溶 解 和 析 出DNA的 纯 化鉴 定 DNA 与 二 苯 胺 混 合 ， 沸 水 浴 ， 呈 现 蓝 色 反 应 方 法 步 骤 加 入 物 质 目 的 1.制 备 鸡 血 细 胞 液 柠 檬 酸 钠 溶 液 2.提 取 鸡 血 细 胞 细 胞 核 物 质 20 m1蒸 馏 水 3.溶 解 细 胞 核 内 的 DNA 2 mo1 L 的 NaCl 溶 液 40 mL 4.析 出 含 DNA的 黏 稠 物 蒸 馏 水 5.滤 取 含 DNA的 黏 稠 物 6.将 DNA的 黏 稠 物 再 溶 解 2 mol L的 NaCl溶 液 20 mL 7.过 滤 含 DNA的 NaCl溶 液 8.提 取 含 有 杂 质 较 少 的 DNA 冷 却 的 95 的 酒 精 50 mL A:(1)向 试 管 中 加 入 2mol L的 NaCl溶 液 5mL (2)加 入 DNA (3)4 mL二 苯 胺 试 剂 9.DNA的 鉴 定 B:(1)向 试 管 中 加 入 2mol L 的 NaCl溶 液 5mL (2)4 mL二 苯 胺 试 剂 加 入 柠 檬 酸 钠 溶 液 的 目 的 是 防 止 血 凝 固 加 速 血 细 胞 破 裂 溶 解 DNA 使 2mol/L的 NaCl溶 液 稀 释 至 0.14mol/L使 得 DNA最 大 限 度 地 释 出 使 含 DNA的 黏 稠 物 被 留 在 纱 布 上 使 含 DNA的 黏 稠 物 尽 可 能 多 的 溶 解 于 溶 液 中 除 去 含 DNA的 滤 液 中 的 杂 质 提 取 DNA A出 现 蓝 色 B无 变 化 DNA的 粗 提 取 与 鉴 定一 、 实 验 原 理 1.血 细 胞 在 蒸 馏 水 中 会 渗 透 吸 水 过 度 而 导 致 细 胞 膜 和 细胞 核 膜 的 破 裂 。 利 用 此 特 性 可 得 到 含 有 DNA的 溶 液 。2.DNA在 氯 化 钠 溶 液 中 的 溶 解 度 ， 是 随 着 氯 化 钠 的 浓 度的 变 化 而 改 变 的 。 DNA在 物 质 的 量 浓 度 为 0.14 mol L的 氯 化 钠 溶 液 中 的 溶 解 度 最 低 ， 利 用 这 一 原 理 ， 可 以 使溶 解 在 氯 化 钠 溶 液 中 的 DNA析 出 。 3.DNA不 溶 于 酒 精 溶 液 ， 但 细 胞 中 的 某 些 物 质 则 可 以 溶于 酒 精 。 利 用 这 一 原 理 ， 可 以 进 一 步 提 取 出 含 杂 质 较 少的 DNA。 4.DNA遇 二 苯 胺 （ 沸 水 浴 ） 会 变 成 蓝 色 ， 因 此 ， 二 苯 胺可 以 作 为 鉴 定 DNA的 试 剂 。 二 、 方 法 与 过 程 1.制 鸡 血 细 胞 液 （ 活 鸡 鲜 血 经 分 离 或 沉 淀 获 得 ）0.1g/mL柠 檬 酸 钠 100mL活 鸡 鲜 血 180mL 500mL烧 杯 中 ， 玻 棒 搅 拌 ，离 心 、 分 离 或 静 置 沉 淀 。2.提 取 DNA 取 血 细 胞 5-10mL 20mL蒸 馏 水 ， 用 玻 棒 沿 一 个 方 向快 速 搅 拌 。 纱 布 过 滤 ： 滤 液 中 含 DNA和 其 他 核 物 质 ， 如 蛋 白 质 。 原 理 ： 血 细 胞 的 细 胞 膜 、 核 摸 吸 水 胀 破 ， 玻 璃 棒 快 速搅 拌 ， 机 械 加 速 血 细 胞 破 裂 。 .提 取 血 细 胞 核 物 质 ： .溶 解 核 内 的 DNA： 滤 液 2mol/L的 NaCl溶 液 40mL， 玻 棒 沿 一 个 方 向轻 缓 搅 拌 。 .析 出 含 DNA的 粘 稠 物 ： .滤 取 含 DNA的 粘 稠 物 ： . DNA粘 稠 物 的 再 溶 解 ： 在 上 述 溶 液 中 缓 缓 加 入 蒸 馏 水 ， 并 沿 一 个 方 向 轻轻 搅 拌 ， 出 现 丝 状 物 ； 当 丝 状 物 不 在 增 加 时 ， 停 止 加水 （ 此 时 NaCl溶 液 的 浓 度 相 当 于 0.14mol/L） 。 用 多 层 纱 布 过 滤 ， 含 DNA的 粘 稠 物 留 在 纱 布 上 。 20mL 2mol/L的 NaCl溶 液步 骤 含 DNA的 粘 稠 物 在 20mL烧 杯 中 轻 缓 搅 拌3min， 使 尽 可 能 多 的DNA溶 解 在 NaCl溶 液 。 .过 滤 含 有 DNA的 NaCl溶 液 ： 用 放 有 两 层 纱 布 的 漏 斗 过 滤 步 骤 所 得 的 溶 液 ，滤 液 中 含 有 DNA。 .提 取 含 有 杂 质 较 少 的 DNA： 步 骤 所 得 的 滤 液 体 积 分 数 为 95%的 冷 却 酒 精50mL， 用 玻 棒 沿 一 个 方 向 轻 缓 搅 拌 ， 溶 液 中 （ 析 出 ）出 现 乳 白 色 丝 状 物 ， 用 玻 棒 将 丝 状 物 卷 起 ， 并 用 滤 纸吸 取 上 面 的 水 分 。3.DNA的 鉴 定 ： 加 入 二 苯 胺 试 剂 4mL， 用 玻 棒 搅 拌 使 DNA溶 解 ，沸 水 浴 5min， 观 察 溶 液 是 否 出 现 蓝 色 。1.共 有 “ 三 次 过 滤 ， 两 次 析 出 ， 七 次 搅 拌 ”2.加 入 “ 两 次 蒸 馏 水 ， 三 次 NaCl溶 液 ， 一 次 酒 精 ”三 、 实 验 小 结 练 习1、 请 解 释 提 取 DNA的 实 验 操 作 中 主 要 的 步 骤 的 目 的 。 答 ： 提 取 DNA的 第 一 步 是 材 料 的 选 取 ， 其 目 的是 一 定 要 选 取 DNA含 量 较 高 的 生 物 材 料 ， 否 则 会由 于 实 验 过 程 中 或 多 或 少 的 损 失 而 造 成 检 测 的 困 难 ；第 二 步 是 DNA的 释 放 和 溶 解 ， 这 一 步 是 实 验 成 功与 否 的 关 键 ， 要 尽 可 能 使 细 胞 内 的 DNA全 部 溶 解 ；第 三 步 是 DNA的 纯 化 ， 即 根 据 DNA的 溶 解 特 性 、对 酶 及 高 温 的 耐 受 性 的 不 同 等 特 性 ， 最 大 限 度 地 将DNA与 杂 质 分 开 ； 最 后 一 步 是 对 DNA进 行 鉴 定 ，这 是 对 整 个 实 验 的 结 果 的 检 测 。 2、 你 认 为 从 细 胞 中 提 取 某 种 特 定 的 蛋 白 质与 提 取 DNA一 样 容 易 吗 ？答 ： 提 取 蛋 白 质 比 提 取 DNA的 难 度 大 。 这是 因 为 ， 与 DNA相 比 ， 蛋 白 质 对 温 度 、 盐浓 度 、 pH 等 条 件 要 敏 感 得 多 ， 很 容 易 失 活 ；并 且 蛋 白 质 的 空 间 结 构 多 种 多 样 ， 理 化 性质 各 不 相 同 ， 使 得 蛋 白 质 的 提 取 没 有 一 种统 一 的 方 法 ， 只 能 根 据 特 定 蛋 白 质 的 特 性摸 索 提 取 的 条 件 ， 设 计 特 定 的 方 法 。 2.实 验 中 NaCl的 物 质 的 量 浓 度 为 2 mol L和0.14 mol L对 DNA有 何 影 响 ?1.在 DNA的 粗 提 取 实 验 过 程 中 ， 两 次 向 烧 杯中 加 入 蒸 馏 水 的 作 用 是 ( )。A.稀 释 血 液 、 冲 洗 样 品B.使 血 细 胞 破 裂 、 降 低 NaCl浓 度 使 DNA析 出C.使 血 细 胞 破 裂 、 增 大 DNA溶 解 量 D.使 血 细 胞 破 裂 、 提 取 含 杂 质 较 少 的 DNAB答 ： 前 者 是 溶 解 DNA， 后 者 是 使 DNA析 出 3.DNA遇 二 苯 胺 (沸 水 浴 )会 染 成 ( ) A.砖 红 色 B.橘 黄 色 C.紫 色 D.蓝 色4.提 取 鸡 血 中 的 DNA时 ， 为 什 么 要 除 去 血 液中 的 上 清 液 ?答 ： DNA的 提 取 ， 关 键 是 对 杂 质 的 去 除 ， 由 于上 清 液 是 血 液 中 的 血 浆 部 分 ， 不 含 DNA， 所 以要 除 去 上 清 液 (含 有 蛋 白 质 )。 D