实验八不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳

实 验 分 组 （ 每 人 做 一 管 ， 每 组 配 一 份 胶 ）认 清 试 剂 （ 试 剂 和 吸 管 对 号 、 量 器 的 使 用 ）封 管分 离 胶 配 制 与 灌 胶 （ 浓 度 为 6%， 化 学 聚 合 ， A1C2H2G5， 每 组 总体 积 为 10ml， 灌 胶 高 度 为 7-8cm）封 正 丁 醇 3mm（ 手 法 、 高 度 、 15min左 右 出 现 折 光 线 时 可 进 行下 一 步 操 作 ）1.1分 离 胶 的 配 制 1.2浓 缩 胶 的 配 制 1.3安 装 、 加 样 、 电 泳 2.1电 泳 的 概 念 2.2电 泳 的 基 本 原 理 2.3电 泳 分 离 蛋 白 质 的 原 理 2.4实 验 室 中 常 用 到 的 电 泳 方 法 （ 以 介 质 分 类 ） 3.1聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 原 理 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 (polyacrylamide gel electrophoresis，简 称 PAGE)是 以 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 作 为 支 持 介 质 的 一 种 常 用 电 泳 技 术 。 1、 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 由 单 体 丙 烯 酰 胺 和 甲 基 双 丙 烯 酰 胺 聚 合 而 形 成的 三 维 网 状 结 构 ， 聚 合 过 程 由 自 由 基 催 化 完 成 。 2、 催 化 聚 合 的 常 用 方 法 有 两 种 ： 化 学 聚 合 法 和 光 聚 合 法 。 (1)在 化 学 聚 合 过 程 中 ， 以 过 硫 酸 铵 （ AP） 为 催 化 剂 ， 以 四 甲 基 乙二 胺 （ TEMED） 为 加 速 剂 , TEMED催 化 AP产 生 自 由 基 ； (2)在 光 聚 合 过 程 中 ， 以 核 黄 素 为 催 化 剂 ， 光 催 化 核 黄 素 产 生 自 由基 。 自 由 基 引 发 丙 烯 酰 胺 单 体 聚 合 ， 同 时 甲 基 双 丙 烯 酰 胺 与 丙 烯酰 胺 链 间 产 生 甲 基 键 交 联 ， 从 而 形 成 三 维 网 状 结 构 。 3.2聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 的 特 性(1)在 一 定 浓 度 时 ， 凝 胶 透 明 ， 有 弹 性 ， 机 械 性 能 好 ；(2)化 学 性 能 稳 定 ， 与 被 分 离 物 不 起 化 学 反 应 ， 在 很 多 溶 剂 中不 溶 ；(3)对 pH和 温 度 变 化 较 稳 定 ；(4)几 乎 无 吸 附 和 电 渗 作 用 ， 只 要 Acr纯 度 高 ， 操 作 条 件 一 致 ，则 样 品 分 离 重 复 性 好 ；(5)样 品 不 易 扩 散 ， 且 用 量 少 ， 其 灵 敏 度 可 达 10-6g(6)凝 胶 孔 径 可 调 节 ， 根 据 被 分 离 物 的 分 子 量 选 择 合 适 的 浓 度 ，通 过 改 变 单 体 及 交 联 剂 的 浓 度 调 节 凝 胶 的 孔 径 ；(7)分 辨 率 高 ， 尤 其 在 不 连 续 凝 胶 电 泳 中 ， 集 浓 缩 、 分 子 筛 和电 荷 效 应 为 一 体 。 因 而 较 醋 酸 纤 维 薄 膜 电 泳 、 琼 脂 糖 电 泳 等 有 更 高 的 分 辨 率 。 3.3聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 的 分 类1. 根 据 其 有 无 浓 缩 效 应 ， 分 为 ：（ 1） 连 续 系 统 连 续 系 统 电 泳 体 系 中 缓 冲 液 pH值 及 凝 胶 浓 度 相 同 ， 带电 颗 粒 在 电 场 作 用 下 ， 主 要 靠 电 荷 和 分 子 筛 效 应 （ 2） 不 连 续 系 统 不 连 续 系 统 中 由 于 缓 冲 液 离 子 成 分 ， pH， 凝 胶 浓度 及 电 位 梯 度 的 不 连 续 性 ， 带 电 颗 粒 在 电 场 中 泳 动 不 仅 有 电 荷 效 应 ，分 子 筛 效 应 ， 还 具 有 浓 缩 效 应 ， 因 而 其 分 离 条 带 清 晰 度 及 分 辨 率 均 较前 者 佳 。 2. 根 据 蛋 白 质 样 品 变 性 与 否 ， 分 为 ：（ 1） 变 性 电 泳 也 就 是 SDS-PAGE， 蛋 白 质 失 去 二 三 级 结 构 ；（ 2） 非 变 性 电 泳 蛋 白 质 能 够 保 持 完 整 状 态 ， 并 依 据 蛋 白 质 的 分 子量 大 小 、 蛋 白 质 的 形 状 及 其 所 附 带 的 电 荷 量 而 逐 渐 呈 梯 度 分 开 。3.根 据 电 泳 槽 体 系 的 类 型 ， 分 为 ： （ 1） 圆 盘 电 泳（ 2） 板 状 电 泳 两 者 电 泳 原 理 完 全 相 同 。 SDS-PAGE仅 根 据 蛋 白 质 亚 基 分 子 量 的 不 同 就 可 以 分 开 蛋 白 质 。 该 技 术最 初 由 shapiro于 1967年 建 立 ， 他 们 发 现 在 样 品 介 质 和 丙 烯 酰 胺 凝 胶 中 加入 离 子 去 污 剂 和 强 还 原 剂 后 ， 蛋 白 质 亚 基 的 电 泳 迁 移 率 主 要 取 决 于 亚 基 分子 量 的 大 小 （ 可 以 忽 略 电 荷 因 素 ） ， 其 原 理 在 于 ：1.去 电 荷 ： 由 于 SDS（ 十 二 烷 基 硫 酸 钠 ） 产 生 的 十 二 烷 基 硫 酸 根 带 负 电 ，使 各 种 蛋 白 质 -SDS复 合 物 都 带 上 相 同 密 度 的 负 电 荷 ， 它 的 量 大 大 超 过 了 蛋白 质 分 子 原 的 电 荷 量 ， 因 而 掩 盖 了 不 同 种 蛋 白 质 间 原 有 的 电 荷 差 别 ； 2.破 坏 结 构 ： SDS能 断 裂 分 子 内 和 分 子 间 的 氢 键 ， 使 分 子 去 折 叠 ， 破 坏 蛋白 分 子 的 二 、 三 级 结 构 。 如 果 蛋 白 质 是 由 不 同 的 亚 基 组 成 的 ， 它 在 电 泳 中可 能 会 形 成 分 别 对 应 于 各 个 亚 基 的 几 条 带 ； 3.统 一 构 象 ： SDS与 蛋 白 质 结 合 后 ， 还 可 引 起 构 象 改 变 ， 蛋 白 质 -SDS复 合物 形 成 近 似 “ 雪 茄 烟 ” 形 的 长 椭 圆 棒 ， 不 同 蛋 白 质 的 SDS复 合 物 的 短 轴 长 度 都 一 样 ， 约 为 18A； 这 样 的 蛋 白 质 -SDS复 合 物 ， 在 凝 胶 中 的 迁 移 率 ， 不 再 受 蛋 白 质 原 来 的电 荷 和 形 状 的 影 响 ， 而 取 决 于 分 子 量 的 大 小 。 SDS-PAGE的 原 理 4.1 不 连 续 PAGE的 原 理 4.2不 连 续 体 系 的 组 份 不 连 续 体 系 由 浓 缩 胶 、 分 离 胶 及 电 极 缓 冲 液 所 组 成 。1. 浓 缩 胶 是 由 核 黄 素 催 化 聚 合 而 成 的 大 孔 胶 ， 凝 胶 缓 冲 液 为pH6.7的 Tris-HC1。2. 分 离 胶 是 由 AP催 化 聚 合 而 成 的 小 孔 胶 ， 凝 胶 缓 冲 液 为 pH8.9 Tris-HC1。3. 电 极 缓 冲 液 是 pH8.3 Tris-甘 氨 酸 缓 冲 液 。 2种 孔 径 的 凝 胶 、 2种 缓 冲 体 系 、 3种 pH值 使 不 连 续 体 系 形 成了 凝 胶 孔 径 、 pH值 、 缓 冲 液 离 子 成 分 的 不 连 续 性 ， 这 是 样 品 浓缩 的 主 要 因 素 。 4.3样 品 浓 缩 效 应1.凝 胶 孔 径 不 连 续 性 ；2.缓 冲 体 系 离 子 成 分 及 pH值 的 不 连 续 性 ；v 在 pH6.7的 凝 胶 缓 冲 体 系 中 前 导 离 子 或 快 离 子 ： HC1解 离 出 的 氯 根 (C1-) 尾 随 离 子 (trailing ion)或 慢 离 子 ： 甘 氨 酸 根 mclclmppmGG(Cl代 表 氯 根 ， P代 表 蛋 白 质 ， G代 表 甘 氨酸 根 )有 效 迁 移 率 =m， m为 迁 移 率 ， 为 解 离 度 )v 当 进 入 pH8.9的 分 离 胶 时 ， 甘 氨 酸 解 离 度 增 加 ， 其 有 效 迁 移率 超 过 蛋 白 质 ；3.电 位 梯 度 的 不 连 续 性 。 G ly- Pro- Cl-G ly-Pro-Cl-Cl- Cl- Cl-Pro- Pro- Pro-G ly- G ly-G ly- 五 、 实 验 结 果 的 分 析 5.1 相 关 理 论 5.2 结 果 示 意 图