实验五小麦萌发前后淀粉酶活力的

实 验 五 小 麦 萌 发 前 后 淀 粉酶 活 力 的 比 较 一 、 实 验 目 的n 1 学 习 测 定 淀 粉 酶 活 力 的 方 法 。n 2 了 解 小 麦 萌 发 前 后 淀 粉 酶 活 力 的 变 化 。 二 、 实 验 原 理n 休 眠 种 子 中 主 要 含 有 -淀 粉 酶 ， 而 -淀粉 酶 是 在 萌 发 过 程 中 形 成 的 。 种 子 萌 发时 ， 淀 粉 酶 活 性 随 萌 发 时 间 迅 速 增 加 ，将 淀 粉 分 解 成 小 分 子 糖 类 ， 供 幼 苗 生 长 。n -淀 粉 酶 水 解 非 还 原 端 的 第 二 个 -1,4-糖 苷 键 ， 水 解 产 物 为 麦 芽 糖 。 u淀 粉 的 水 解 产 物 麦 芽 糖 有 还 原 性 能 与 3， 5-二硝 基 水 杨 酸 试 剂 反 应 ， 使 其 还 原 生 成 红 色 3-氨基 -5-硝 基 水 杨 酸 。u在 一 定 范 围 内 ， 其 颜 色 深 浅 与 淀 粉 酶 水 解 产 物的 浓 度 成 正 比 ， 可 用 麦 芽 糖 （ 或 葡 萄 糖 ） 浓 度表 示 ， 用 比 色 法 测 定 淀 粉 生 成 的 还 原 糖 的 量 ，以 单 位 重 量 样 品 在 一 定 时 间 内 生 成 的 麦 芽 糖 的量 表 示 酶 活 力 。 三 、 试 剂 n 1.0.1 标 准 麦 芽 糖 溶 液 20毫 升 ： 精 确 称 量100毫 克 麦 芽 糖 ， 用 少 量 水 溶 解 后 ， 移 入100ml容 量 瓶 中 ， 加 蒸 馏 水 至 刻 度 。n 2 pH6.9， 0.02摩 尔 L磷 酸 缓 冲 液 100毫升n 3 1 淀 粉 溶 液 100毫 升 ： 1克 可 溶 性 淀 粉 溶于 100毫 升 0.02摩 尔 L磷 酸 缓 冲 液 ， 其 中 含有 0.006摩 尔 L氯 化 钠 。 n 4 1 3,5-二 硝 基 水 杨 酸 试 剂 :1g3,5-二 硝 基 水 杨 酸 溶 于 20毫 升 2摩 尔 L的 氢氧 化 钠 溶 液 和 50毫 升 水 中 ； 再 加 人 30克酒 石 酸 钾 钠 ， 定 容 至 100毫 升 。 若 溶 液混 浊 ， 可 过 滤 。n 5 1 氯 化 钠 溶 液 300毫 升n 6 海 砂 5克 四 、 操 作 步 骤n 1 种 子 发 芽 ：n 小 麦 种 子 浸 泡 2.5h后 ， 放 人 25 恒 温 箱 内 或在 室 温 下 发 芽 。 n 2 酶 液 提 取 ：n 取 发 芽 第 三 天 或 第 四 天 的 幼 苗 15株 ， 放 人乳 钵 内 ， 加 适 量 石 英 砂 ， 加 1 氯 化 钠 溶 液 10毫 升 ， 用 力 磨 碎 。 在 室 温 下 放 置 20分 钟 ， 搅拌 几 次 。 将 提 取 液 离 心 （ 1500转 min） 67分 钟 。 将 上 清 液 倒 人 量 筒 ， 测 定 酶 提 取 液 的总 体 积 。 进 行 酶 活 力 测 定 时 ， 将 酶 提 取 液 用Ph6.9的 磷 酸 缓 冲 液 稀 释 10倍 。n 取 干 燥 种 子 15粒 作 为 对 照 （ 提 取 步 骤 同 上 ） 。 n 3 酶 活 力 测 定 ：n （ 1） 取 25毫 升 刻 度 试 管 4支 。 编 号 。 按 下 表 要 求 加 人 各 试 剂（ 各 试 剂 须 25 预 热 10分 钟 ） 。1（ 干 种 子 ） 2（ 湿 种 子 ） 3（ 标 准 管 ） 4（ 空 白 管 ）酶 液 0.5 0.5 - -标 准 麦 芽糖 溶 液 - - 0.5 -淀 粉 溶 液 1 1 1 1蒸 馏 水 - - - 0.5 n 将 各 管 混 匀 ， 放 在 25 ， 水 浴 中 保 温 3分 钟 后 ， 立 即 向 各 管 中 加 人 1 3， 5-二硝 基 水 杨 酸 溶 液 2毫 升 。 （ ？ ）n （ 2） 取 出 各 试 管 ， 放 人 沸 水 浴 中 加 热 5分 钟 。 冷 至 室 温 ， 加 水 稀 释 至 25毫 升 。将 各 管 充 分 混 匀 。n （ 3） 用 空 白 管 作 对 照 ； 在 500nm处 测定 各 管 的 光 吸 收 值 ， 记 录 结 果 。 n 4 计 算n 本 实 验 规 定 ： 25 时 3min内 水 解 淀 粉 释 放 1mg麦 芽 糖 所 需 的 酶 量为 1个 酶 活 力 单 位 （ U） 。n 根 据 溶 液 的 浓 度 与 光 吸 收 值 成 正 比 的 关 系 ， 即 ： A标 准 A未 知 C标准 C未 知n C（ 酶 液 管 浓 度 ） A酶 C标 准 A标 准n 则 15粒 种 子 或 幼 苗 的 总 活 力 单 位 =C酶 N酶 V酶 n N为 酶 液 的 稀 释 倍 数n V为 提 取 酶 液 的 总 体 积