免疫细胞化学原理多媒体

第六章第六章 免疫细胞化学技术免疫细胞化学技术（免疫组化）（免疫组化）(immunocytochemistry)是利用免疫反应来定位组织和是利用免疫反应来定位组织和 细胞中特异大分子的一类技术细胞中特异大分子的一类技术 第一节第一节 免疫细胞化学原理免疫细胞化学原理 第二节第二节 免疫细胞化学方法免疫细胞化学方法 免疫细胞化学技术免疫细胞化学技术 一、免疫反应的特异性一、免疫反应的特异性 二、免疫细胞化学反应二、免疫细胞化学反应 三、抗原三、抗原 四、抗体四、抗体 五、标记物及其在光镜和电镜下可见性五、标记物及其在光镜和电镜下可见性第一节第一节 免疫细胞化学原理免疫细胞化学原理 免疫反应的特异性表现在：免疫反应的特异性表现在：抗原抗原作为一类结构复杂的大分子能刺激机体作为一类结构复杂的大分子能刺激机体 产生对其特异的抗体并与抗体发生反应产生对其特异的抗体并与抗体发生反应 抗体抗体针对某种抗原分子而产生的，特异地识针对某种抗原分子而产生的，特异地识 别该抗原并与其结合别该抗原并与其结合 一、免疫反应的特异性一、免疫反应的特异性 免疫细胞化学反应的原理免疫细胞化学反应的原理免疫细胞化学反应的原理免疫细胞化学反应的原理：把组织细胞中的特异分把组织细胞中的特异分把组织细胞中的特异分把组织细胞中的特异分 子作为抗原子作为抗原子作为抗原子作为抗原,用在显微镜下可用在显微镜下可用在显微镜下可用在显微镜下可 见的标记物标记特异抗体见的标记物标记特异抗体见的标记物标记特异抗体见的标记物标记特异抗体(或或或或 者标记抗原抗体复合物者标记抗原抗体复合物者标记抗原抗体复合物者标记抗原抗体复合物)使特使特使特使特 异的免疫化学反应具有可见异的免疫化学反应具有可见异的免疫化学反应具有可见异的免疫化学反应具有可见 性性性性,从而间接地显示抗原从而间接地显示抗原从而间接地显示抗原从而间接地显示抗原,达达达达 到在细胞或细胞器水平定位到在细胞或细胞器水平定位到在细胞或细胞器水平定位到在细胞或细胞器水平定位 特异分子的目的特异分子的目的特异分子的目的特异分子的目的 二、免疫细胞化学反应二、免疫细胞化学反应组织抗原组织抗原组织抗原组织抗原抗体抗体抗体抗体标记物标记物标记物标记物 标记抗体标记抗体标记抗体标记抗体1 1 1 1 荧光荧光荧光荧光2 2 2 2 酶酶酶酶3 3 3 3 亲和技术亲和技术亲和技术亲和技术4 4 4 4 金标金标金标金标抗原抗原抗原抗原 免疫细胞化学反应过程为：免疫细胞化学反应过程为：标记物标记物标记物标记物间接法间接法间接法间接法直接法直接法直接法直接法 两种免疫反应方法两种免疫反应方法 抗抗 原：原：凡能刺激机体产生抗体并能与凡能刺激机体产生抗体并能与 抗体特异结合的物质称为抗原抗体特异结合的物质称为抗原 抗原性：抗原性：物质所具有的这种特性称为抗原性物质所具有的这种特性称为抗原性 三、抗原三、抗原 细胞中具有抗原性的化学成分有：细胞中具有抗原性的化学成分有：蛋白质蛋白质 多肽多肽 脂蛋白脂蛋白 多糖多糖 脂多糖脂多糖 糖蛋白糖蛋白 核蛋白核蛋白 这些生物大分子都能用免疫细胞化学技术检测吗这些生物大分子都能用免疫细胞化学技术检测吗这些生物大分子都能用免疫细胞化学技术检测吗这些生物大分子都能用免疫细胞化学技术检测吗?从生物学功能来看都包括了哪些物质从生物学功能来看都包括了哪些物质从生物学功能来看都包括了哪些物质从生物学功能来看都包括了哪些物质?酶、酶、受体、受体、抗体、抗体、细胞外基质细胞外基质 激素、激素、细胞结构蛋白、病原体细胞结构蛋白、病原体等等具有抗原性的物质包括：具有抗原性的物质包括：四、抗体四、抗体 C CC CFcFcFabFabN NN NN NN NCCFabFabFabFab片段片段片段片段 具有抗体活性，决定某种抗体具有抗体活性，决定某种抗体具有抗体活性，决定某种抗体具有抗体活性，决定某种抗体 与抗原结合的能力和特异性与抗原结合的能力和特异性与抗原结合的能力和特异性与抗原结合的能力和特异性FcFcFcFc片段片段片段片段 决定该抗体本身作为抗原刺激决定该抗体本身作为抗原刺激决定该抗体本身作为抗原刺激决定该抗体本身作为抗原刺激 机体产生抗体的能力和特异性机体产生抗体的能力和特异性机体产生抗体的能力和特异性机体产生抗体的能力和特异性 决定其本身抗原性决定其本身抗原性决定其本身抗原性决定其本身抗原性抗体的结构抗体的结构 免疫细胞化学技术中所用的抗体有两种：免疫细胞化学技术中所用的抗体有两种：抗抗 血血 清清 多克隆抗体，是用提纯的抗原多克隆抗体，是用提纯的抗原 免疫动物后从动物血清制备得免疫动物后从动物血清制备得 到的到的 单克隆抗体单克隆抗体 是指由单个产生特异抗体的是指由单个产生特异抗体的 淋巴细胞分化增殖形成的淋巴细胞分化增殖形成的 细胞克隆产生的抗细胞克隆产生的抗体体 1 1 免疫荧光技术免疫荧光技术 2 2 免疫酶技免疫酶技术术 3 3 免疫亲和技免疫亲和技术术 4 4 胶体金技胶体金技术术五、标记物及其在光镜和电镜下的可见性五、标记物及其在光镜和电镜下的可见性 标记物标记物标记物标记物 使抗体或抗原使抗体或抗原使抗体或抗原使抗体或抗原 抗体复合物在抗体复合物在抗体复合物在抗体复合物在 各种显微镜下各种显微镜下各种显微镜下各种显微镜下 可的物质可的物质可的物质可的物质 免疫荧光技术将免疫荧光技术将 荧光素作为标记物荧光素作为标记物 使组织细胞中形成的抗原抗体复合使组织细胞中形成的抗原抗体复合 物在物在荧光显微镜荧光显微镜下可见，从而显示下可见，从而显示 抗原物质的定位抗原物质的定位 （一）一）免疫荧光技术免疫荧光技术 .异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素 .四乙基罗达明四乙基罗达明四乙基罗达明四乙基罗达明 .四甲基异硫氰酸罗达明四甲基异硫氰酸罗达明四甲基异硫氰酸罗达明四甲基异硫氰酸罗达明 .藻红蛋白藻红蛋白藻红蛋白藻红蛋白 分子量不同分子量不同分子量不同分子量不同 最大吸收光谱不同最大吸收光谱不同最大吸收光谱不同最大吸收光谱不同 最大发射光谱不同最大发射光谱不同最大发射光谱不同最大发射光谱不同 与蛋白结合方式不同与蛋白结合方式不同与蛋白结合方式不同与蛋白结合方式不同 呈现不同的荧光：呈现不同的荧光：呈现不同的荧光：呈现不同的荧光：黄绿色荧光黄绿色荧光黄绿色荧光黄绿色荧光 橙色荧光橙色荧光橙色荧光橙色荧光 橙红色荧光橙红色荧光橙红色荧光橙红色荧光等等等等 荧光素荧光素 能产生荧光并能作为染料的一类化合物能产生荧光并能作为染料的一类化合物能产生荧光并能作为染料的一类化合物能产生荧光并能作为染料的一类化合物 荧荧 光光：在激发光（荧光显微镜提供）的照射下，能发出较激在激发光（荧光显微镜提供）的照射下，能发出较激在激发光（荧光显微镜提供）的照射下，能发出较激在激发光（荧光显微镜提供）的照射下，能发出较激发光波长更长的可见光并随照射停止而消失发光波长更长的可见光并随照射停止而消失发光波长更长的可见光并随照射停止而消失发光波长更长的可见光并随照射停止而消失 荧光荧光显微镜显微镜：荧光显微镜的光源提供各种荧光显微镜的光源提供各种荧光显微镜的光源提供各种荧光显微镜的光源提供各种激发光激发光激发光激发光，如，如，如，如 紫外光、蓝紫光（有不同的波长范围）紫外光、蓝紫光（有不同的波长范围）紫外光、蓝紫光（有不同的波长范围）紫外光、蓝紫光（有不同的波长范围）使受检标本内的荧光物质发光使受检标本内的荧光物质发光使受检标本内的荧光物质发光使受检标本内的荧光物质发光 是将是将酶作为标记酶作为标记物物使组织细胞中形使组织细胞中形成的抗原抗体复合物得到标记，再通过成的抗原抗体复合物得到标记，再通过酶细胞化学反应产生显微镜下可见的显酶细胞化学反应产生显微镜下可见的显色物质，间接显示抗原物质的定位色物质，间接显示抗原物质的定位 （二）（二）免疫酶技术免疫酶技术 1.1.反应产物定位准确，颜色对比清晰反应产物定位准确，颜色对比清晰 2.2.反应后标本材料可长期保存反应后标本材料可长期保存 3.3.能用于电镜观察能用于电镜观察免疫酶技术免疫酶技术优点：优点：酶酶酶酶抗原抗原抗原抗原一抗一抗一抗一抗二抗二抗二抗二抗酶标二抗酶标二抗酶标二抗酶标二抗酶酶酶酶抗酶抗体复合物抗酶抗体复合物抗酶抗体复合物抗酶抗体复合物抗酶抗体抗酶抗体抗酶抗体抗酶抗体酶标抗体法酶标抗体法酶标抗体法酶标抗体法抗酶抗体法抗酶抗体法抗酶抗体法抗酶抗体法 复合物法复合物法复合物法复合物法酶标记的三种形式酶标记的三种形式 用交联剂将酶与用交联剂将酶与用交联剂将酶与用交联剂将酶与抗体联接成酶标抗体抗体联接成酶标抗体抗体联接成酶标抗体抗体联接成酶标抗体用于直接法和间接法用于直接法和间接法用于直接法和间接法用于直接法和间接法 酶标抗体法酶标抗体法酶标抗体法酶标抗体法 用酶免疫动物获得抗酶抗体，用酶免疫动物获得抗酶抗体，用酶免疫动物获得抗酶抗体，用酶免疫动物获得抗酶抗体，通过二抗的桥梁作用把抗酶抗体连通过二抗的桥梁作用把抗酶抗体连通过二抗的桥梁作用把抗酶抗体连通过二抗的桥梁作用把抗酶抗体连接在一抗上接在一抗上接在一抗上接在一抗上,再加入酶及其底物，达再加入酶及其底物，达再加入酶及其底物，达再加入酶及其底物，达到用酶标记抗原抗体反应的效果到用酶标记抗原抗体反应的效果到用酶标记抗原抗体反应的效果到用酶标记抗原抗体反应的效果 由于产生抗酶抗体的动物与产由于产生抗酶抗体的动物与产由于产生抗酶抗体的动物与产由于产生抗酶抗体的动物与产生第一抗体的动物是同一种属，两生第一抗体的动物是同一种属，两生第一抗体的动物是同一种属，两生第一抗体的动物是同一种属，两种抗体具有相同的免疫源性，所以种抗体具有相同的免疫源性，所以种抗体具有相同的免疫源性，所以种抗体具有相同的免疫源性，所以在反应中本来针对一抗的二抗也能在反应中本来针对一抗的二抗也能在反应中本来针对一抗的二抗也能在反应中本来针对一抗的二抗也能与抗酶抗体结合与抗酶抗体结合与抗酶抗体结合与抗酶抗体结合抗酶抗体法或称酶桥法抗酶抗体法或称酶桥法抗酶抗体法或称酶桥法抗酶抗体法或称酶桥法 先获得抗酶抗体并将抗先获得抗酶抗体并将抗先获得抗酶抗体并将抗先获得抗酶抗体并将抗酶抗体与酶一起预先制成酶酶抗体与酶一起预先制成酶酶抗体与酶一起预先制成酶酶抗体与酶一起预先制成酶抗酶抗体复合物抗酶抗体复合物抗酶抗体复合物抗酶抗体复合物 在反应中，由二抗的桥在反应中，由二抗的桥在反应中，由二抗的桥在反应中，由二抗的桥梁作用把复合物与一抗连接梁作用把复合物与一抗连接梁作用把复合物与一抗连接梁作用把复合物与一抗连接在一起在一起在一起在一起 最后加入底物，从而达最后加入底物，从而达最后加入底物，从而达最后加入底物，从而达到用酶标记抗原抗体反应的到用酶标记抗原抗体反应的到用酶标记抗原抗体反应的到用酶标记抗原抗体反应的效果效果效果效果 优点优点优点优点:1:1:1:1、抗体活性高、抗体活性高、抗体活性高、抗体活性高 2 2 2 2、灵敏度高、灵敏度高、灵敏度高、灵敏度高酶抗酶抗体复合物法酶抗酶抗体复合物法酶抗酶抗体复合物法酶抗酶抗体复合物法常用的标记酶：常用的标记酶：1.1.1.1.辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶 2 2 2 2.碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶 常用的两种方法是：常用的两种方法是：常用的两种方法是：常用的两种方法是：（1 1 1 1）过氧化物酶标记抗体法）过氧化物酶标记抗体法）过氧化物酶标记抗体法）过氧化物酶标记抗体法 （2 2 2 2）过氧化物）过氧化物）过氧化物）过氧化物酶酶酶酶-抗抗抗抗过氧化物过氧化物过氧化物过氧化物酶复合物法酶复合物法酶复合物法酶复合物法 （Peroxidase-Antiperoxidase,PAPPeroxidase-Antiperoxidase,PAPPeroxidase-Antiperoxidase,PAPPeroxidase-Antiperoxidase,PAP）一抗与组织抗原特异结合一抗与组织抗原特异结合一抗与组织抗原特异结合一抗与组织抗原特异结合 二抗又将二抗又将二抗又将二抗又将PAPPAPPAPPAP复合物与第一抗体连接在一起复合物与第一抗体连接在一起复合物与第一抗体连接在一起复合物与第一抗体连接在一起 然后加入然后加入然后加入然后加入HRPHRPHRPHRP的天然底物的天然底物的天然底物的天然底物H H H H2 2 2 2 O O O O2 2 2 2 和捕捉底物和捕捉底物和捕捉底物和捕捉底物DABDABDABDAB 光镜光镜光镜光镜-棕黄色反应产物棕黄色反应产物棕黄色反应产物棕黄色反应产物(组织抗原的定位组织抗原的定位组织抗原的定位组织抗原的定位).辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶 （hoseradishperoxidase,HRPhoseradishperoxidase,HRP）.碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶（Alkalinephosphotase,AKPAlkalinephosphotase,AKP）碱性磷酸酶技术常用的两种方法：碱性磷酸酶技术常用的两种方法：碱性磷酸酶技术常用的两种方法：碱性磷酸酶技术常用的两种方法：(1)(1)碱性磷酸酶标记抗体碱性磷酸酶标记抗体碱性磷酸酶标记抗体碱性磷酸酶标记抗体 (2)(2)碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶复合物法（抗碱性磷酸酶复合物法（抗碱性磷酸酶复合物法（抗碱性磷酸酶复合物法（APAAPAPAAPAPAAPAPAAP）（A A A Alkaline lkaline lkaline lkaline p p p phosphotasehosphotasehosphotasehosphotaseA A A Antintintintia a a alkaline lkaline lkaline lkaline p p p phosphotasehosphotasehosphotasehosphotase）APAAP APAAP APAAP APAAP法的原理：法的原理：法的原理：法的原理：以碱性磷酸酶为标记物以碱性磷酸酶为标记物以碱性磷酸酶为标记物以碱性磷酸酶为标记物,再通过与其底物的细胞化再通过与其底物的细胞化再通过与其底物的细胞化再通过与其底物的细胞化学反应使抗原抗体反应可见学反应使抗原抗体反应可见学反应使抗原抗体反应可见学反应使抗原抗体反应可见 常用的底物是萘酚常用的底物是萘酚常用的底物是萘酚常用的底物是萘酚,偶联剂是固蓝、固红等偶联剂是固蓝、固红等偶联剂是固蓝、固红等偶联剂是固蓝、固红等 常用于标记的酶：常用于标记的酶：1.1.1.1.辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶 2 2 2 2.碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶 利用两种物质高度亲和力而互相结合定位特异分子利用两种物质高度亲和力而互相结合定位特异分子利用两种物质高度亲和力而互相结合定位特异分子利用两种物质高度亲和力而互相结合定位特异分子 亲和物质亲和物质亲和物质亲和物质 具有多价能力的物质，与亲和物质有高具有多价能力的物质，与亲和物质有高具有多价能力的物质，与亲和物质有高具有多价能力的物质，与亲和物质有高 度亲和力又能与抗体、蛋白质及各种标度亲和力又能与抗体、蛋白质及各种标度亲和力又能与抗体、蛋白质及各种标度亲和力又能与抗体、蛋白质及各种标 记物记物记物记物(荧光素、酶、胶体金等荧光素、酶、胶体金等荧光素、酶、胶体金等荧光素、酶、胶体金等)结合结合结合结合 最常用的亲和物质系统：最常用的亲和物质系统：最常用的亲和物质系统：最常用的亲和物质系统：1 1 1 1、生物素生物素生物素生物素（biotinbiotinbiotinbiotin）与）与）与）与亲和素亲和素亲和素亲和素（avidinavidinavidinavidin）两者结合能力为不可逆的两者结合能力为不可逆的两者结合能力为不可逆的两者结合能力为不可逆的 2 2 2 2、葡萄球菌葡萄球菌葡萄球菌葡萄球菌A A A A蛋白蛋白蛋白蛋白与与与与免疫球蛋白免疫球蛋白免疫球蛋白免疫球蛋白IgGIgGIgGIgG （三）（三）亲和细胞化学技术亲和细胞化学技术 (1)(1)(1)(1)标记亲和素生物素技术标记亲和素生物素技术 （Labeledavidinbiotin,LAB）(2)(2)(2)(2)桥式亲和素生物素技术桥式亲和素生物素技术 （Bridgedavidinbiotin,BAB）(3)(3)(3)(3)亲和素生物素亲和素生物素-酶复合物技术酶复合物技术 （Avidin-biotinperoxidasecomplexmethod，ABC）1.1.1.1.生物素系统标记技术的基本方法生物素系统标记技术的基本方法生物素化酶生物素化酶生物素化酶生物素化酶生物素化抗体生物素化抗体生物素化抗体生物素化抗体亲和素亲和素亲和素亲和素生物素生物素生物素生物素 酶复合物酶复合物酶复合物酶复合物生物素生物素生物素生物素亲和素亲和素亲和素亲和素 生物素与抗体共价偶联生物素与抗体共价偶联生物素与抗体共价偶联生物素与抗体共价偶联后加入与过氧化物酶（或后加入与过氧化物酶（或后加入与过氧化物酶（或后加入与过氧化物酶（或荧光素）结合的亲和素荧光素）结合的亲和素荧光素）结合的亲和素荧光素）结合的亲和素 利用生物素亲和素之利用生物素亲和素之利用生物素亲和素之利用生物素亲和素之间的结合，间接显示组织间的结合，间接显示组织间的结合，间接显示组织间的结合，间接显示组织细胞中的抗原细胞中的抗原细胞中的抗原细胞中的抗原 标记亲和素生物素法标记亲和素生物素法标记亲和素生物素法标记亲和素生物素法 利用亲和素为桥梁利用亲和素为桥梁 连接生物素化的抗连接生物素化的抗 体和生物素化的酶体和生物素化的酶桥式亲和素生物素法桥式亲和素生物素法桥式亲和素生物素法桥式亲和素生物素法 亲和素生物素亲和素生物素亲和素生物素亲和素生物素-酶复合物技术酶复合物技术酶复合物技术酶复合物技术 亲和素与生物素偶联的亲和素与生物素偶联的亲和素与生物素偶联的亲和素与生物素偶联的过氧化物酶组合成亲和素过氧化物酶组合成亲和素过氧化物酶组合成亲和素过氧化物酶组合成亲和素生物素生物素生物素生物素酶复合物酶复合物 特异性抗体（一抗）特异性抗体（一抗）特异性抗体（一抗）特异性抗体（一抗）先与组织细胞中的抗原结合，先与组织细胞中的抗原结合，先与组织细胞中的抗原结合，先与组织细胞中的抗原结合，生物素化抗体（二抗）生物素化抗体（二抗）生物素化抗体（二抗）生物素化抗体（二抗）再与一抗结合再与一抗结合再与一抗结合再与一抗结合 复合物与生物素化抗复合物与生物素化抗复合物与生物素化抗复合物与生物素化抗体结合体结合体结合体结合 葡萄球菌葡萄球菌A A蛋蛋 (StaphylocalproteinA,SPA)(StaphylocalproteinA,SPA)是金黄色葡萄球菌细胞壁含有的一种蛋白是金黄色葡萄球菌细胞壁含有的一种蛋白 简称为简称为A A蛋白或蛋白蛋白或蛋白A A SPASPA能与人及多种哺乳动物血清中能与人及多种哺乳动物血清中IgGIgG呈呈 非特异性结合又能与标记物结合非特异性结合又能与标记物结合 经标记的经标记的SPASPASPASPA可代替相应标记的二抗可代替相应标记的二抗2.2.葡萄球菌葡萄球菌A A蛋白与蛋白与IgGIgG系统系统亲和素亲和素亲和素亲和素（四）（四）免疫胶体金技术免疫胶体金技术 免疫胶体金技术是以光镜和电镜下都免疫胶体金技术是以光镜和电镜下都可见的胶体金作为抗体或蛋白的标记物，可见的胶体金作为抗体或蛋白的标记物，间接显示组织细胞中特异分子的技术间接显示组织细胞中特异分子的技术 胶体金颗粒大小一般在胶体金颗粒大小一般在胶体金颗粒大小一般在胶体金颗粒大小一般在5-60nm5-60nm5-60nm5-60nm 胶体金颗粒表面带负电荷，蛋白质表胶体金颗粒表面带负电荷，蛋白质表面带正电荷，蛋白质在等电点或偏碱时被面带正电荷，蛋白质在等电点或偏碱时被吸附于金颗粒表面吸附于金颗粒表面,形成一个蛋白层阻止形成一个蛋白层阻止了金颗粒的相互接触，使免疫金处于稳定了金颗粒的相互接触，使免疫金处于稳定状态状态胶体金对蛋白质的标记胶体金对蛋白质的标记:胶体金胶体金胶体金胶体金A A蛋白蛋白蛋白蛋白 1.1.1.1.免疫金法免疫金法免疫金法免疫金法 (Immunogold staining IGS)(Immunogold staining IGS)(Immunogold staining IGS)(Immunogold staining IGS)2.2.2.2.免疫金银法免疫金银法免疫金银法免疫金银法 （Immunogold silver staining,IGSS)Immunogold silver staining,IGSS)Immunogold silver staining,IGSS)Immunogold silver staining,IGSS)3.3.3.3.彩色免疫金银法彩色免疫金银法彩色免疫金银法彩色免疫金银法 （Coloured IGSS,CIGSSColoured IGSS,CIGSSColoured IGSS,CIGSSColoured IGSS,CIGSS）免疫胶体金技术常用方法免疫胶体金技术常用方法免疫胶体金技术常用方法免疫胶体金技术常用方法免疫金法免疫金法 一抗与抗原结合一抗与抗原结合一抗与抗原结合一抗与抗原结合 金标抗体或金标金标抗体或金标金标抗体或金标金标抗体或金标A A A A蛋作为二蛋作为二蛋作为二蛋作为二 抗与抗原抗体复合物结合抗与抗原抗体复合物结合抗与抗原抗体复合物结合抗与抗原抗体复合物结合 抗原抗体反应部位在光镜抗原抗体反应部位在光镜抗原抗体反应部位在光镜抗原抗体反应部位在光镜 下呈现红色，在电镜下呈下呈现红色，在电镜下呈下呈现红色，在电镜下呈下呈现红色，在电镜下呈 高电子密度高电子密度高电子密度高电子密度 1 1 1 1、采用不同大小的金颗粒采用不同大小的金颗粒(通常通常5-20nm)5-20nm)标记不同抗体或标记不同抗体或A A蛋白，达到蛋白，达到双重双重甚至甚至多多 重重标记定位多种抗原的目的标记定位多种抗原的目的 2 2 2 2、金颗粒便于计数，可对反应作金颗粒便于计数，可对反应作定量分析定量分析 3 3 3 3、可用于透射、扫描电镜和冷冻蚀刻标本可用于透射、扫描电镜和冷冻蚀刻标本 可将结果与光镜免疫金技术结果进行对可将结果与光镜免疫金技术结果进行对照照 免疫交体金体金免疫交体金体金优点：优点：免疫细胞化学技术是在原位检测细胞中抗原免疫细胞化学技术是在原位检测细胞中抗原 基本过程基本过程:抗原固定抗原固定 抗原与抗体结合反应抗原与抗体结合反应 标记系统反应标记系统反应 第二节第二节 免疫细胞化学方法免疫细胞化学方法 一、样品制备一、样品制备 二、抗体准备二、抗体准备 三、基本实验过程三、基本实验过程 四、一些关键问题四、一些关键问题 固定固定固定固定 光镜光镜光镜光镜 醛类固定醛类固定醛类固定醛类固定,常规石蜡包埋和切片常规石蜡包埋和切片常规石蜡包埋和切片常规石蜡包埋和切片 (冷冻切片冷冻切片冷冻切片冷冻切片化学固定化学固定化学固定化学固定免疫细胞化学反应免疫细胞化学反应免疫细胞化学反应免疫细胞化学反应)电镜电镜电镜电镜 4 4 4 4多聚甲醛为首选固定剂多聚甲醛为首选固定剂多聚甲醛为首选固定剂多聚甲醛为首选固定剂 (多聚甲醛混合多聚甲醛混合多聚甲醛混合多聚甲醛混合0.05-0.5%0.05-0.5%0.05-0.5%0.05-0.5%戊二醛戊二醛戊二醛戊二醛)包埋前技术包埋前技术包埋前技术包埋前技术 免疫细胞化学反应在未经免疫细胞化学反应在未经免疫细胞化学反应在未经免疫细胞化学反应在未经 包埋的组织片上进行包埋的组织片上进行包埋的组织片上进行包埋的组织片上进行 包埋后技术包埋后技术包埋后技术包埋后技术 免疫细胞化学反应在超薄免疫细胞化学反应在超薄免疫细胞化学反应在超薄免疫细胞化学反应在超薄 切片上进行切片上进行切片上进行切片上进行 一、样品制备一、样品制备一、样品制备一、样品制备 抗体制备：特异抗体主要从购买获得抗体制备：特异抗体主要从购买获得抗体制备：特异抗体主要从购买获得抗体制备：特异抗体主要从购买获得 (也可自行制备特异抗血清甚至单克隆抗体也可自行制备特异抗血清甚至单克隆抗体也可自行制备特异抗血清甚至单克隆抗体也可自行制备特异抗血清甚至单克隆抗体)抗体标记抗体标记抗体标记抗体标记:直接法直接法直接法直接法 对每种一抗进行标记，很少用对每种一抗进行标记，很少用对每种一抗进行标记，很少用对每种一抗进行标记，很少用 间接法间接法间接法间接法 对二抗进行标记对二抗进行标记对二抗进行标记对二抗进行标记 (标记二抗使用十分普遍标记二抗使用十分普遍标记二抗使用十分普遍标记二抗使用十分普遍)标记抗体的方法：标记抗体的方法：标记抗体的方法：标记抗体的方法：1.1.1.1.荧光素标记抗体方法荧光素标记抗体方法荧光素标记抗体方法荧光素标记抗体方法 2.2.2.2.酶标记抗体酶标记抗体酶标记抗体酶标记抗体 3.3.3.3.生物素化抗体生物素化抗体生物素化抗体生物素化抗体 4.4.4.4.胶体金标记抗体或胶体金标记抗体或胶体金标记抗体或胶体金标记抗体或A A A A蛋白蛋白蛋白蛋白 二、抗体准备二、抗体准备 免疫细胞化学方法有免疫细胞化学方法有免疫细胞化学方法有免疫细胞化学方法有:直接法、间接法直接法、间接法直接法、间接法直接法、间接法 间接法中有间接法中有间接法中有间接法中有:二抗、三抗或复合物二抗、三抗或复合物二抗、三抗或复合物二抗、三抗或复合物 标记系统有标记系统有标记系统有标记系统有:荧光素、酶、亲和素荧光素、酶、亲和素荧光素、酶、亲和素荧光素、酶、亲和素 胶体金胶体金胶体金胶体金 观察方法有观察方法有观察方法有观察方法有:荧光显微镜、普通光镜、电镜荧光显微镜、普通光镜、电镜荧光显微镜、普通光镜、电镜荧光显微镜、普通光镜、电镜三、基本实验过程三、基本实验过程三、基本实验过程三、基本实验过程 切片切片切片切片,丙酮固定，石蜡切片丙酮固定，石蜡切片丙酮固定，石蜡切片丙酮固定，石蜡切片脱蜡脱蜡脱蜡脱蜡复水复水复水复水 1%H1%H2 2OO22/甲醇甲醇甲醇甲醇阻断阻断阻断阻断内源性过氧化物酶内源性过氧化物酶内源性过氧化物酶内源性过氧化物酶 正常羊血清正常羊血清正常羊血清正常羊血清(二抗的正常血清二抗的正常血清二抗的正常血清二抗的正常血清)1:201:20室温室温室温室温封闭封闭封闭封闭 适当稀释适当稀释适当稀释适当稀释一抗一抗一抗一抗(兔抗体兔抗体兔抗体兔抗体)孵育孵育孵育孵育 适当稀释适当稀释适当稀释适当稀释二抗二抗二抗二抗(羊抗体羊抗体羊抗体羊抗体)孵育孵育孵育孵育 适当稀释兔适当稀释兔适当稀释兔适当稀释兔PAPPAPPAPPAP复合物复合物复合物复合物孵育孵育孵育孵育 0.04%DAB+0.03%H0.04%DAB+0.03%H2 2OO2 2 显色显色显色显色，充分水洗终止反应，充分水洗终止反应，充分水洗终止反应，充分水洗终止反应 苏木素衬染苏木素衬染苏木素衬染苏木素衬染,封片封片封片封片 光镜观察光镜观察光镜观察光镜观察棕褐色阳性棕褐色阳性棕褐色阳性棕褐色阳性反应沉淀物反应沉淀物反应沉淀物反应沉淀物 过氧化物酶抗过氧化物酶复合物法（过氧化物酶抗过氧化物酶复合物法（过氧化物酶抗过氧化物酶复合物法（过氧化物酶抗过氧化物酶复合物法（PAPPAPPAPPAP法）法）法）法）80nm80nm左右厚度超薄切片置于镍网上左右厚度超薄切片置于镍网上左右厚度超薄切片置于镍网上左右厚度超薄切片置于镍网上 1-10%H1-10%H2 2OO2 2蚀刻蚀刻蚀刻蚀刻 1%BSA1%BSA室温封闭室温封闭室温封闭室温封闭 适当稀释一抗孵育室温适当稀释一抗孵育室温适当稀释一抗孵育室温适当稀释一抗孵育室温 1%BSA1%BSA室温封闭室温封闭室温封闭室温封闭 适当稀释的适当稀释的适当稀释的适当稀释的10-20nm10-20nm金标金标金标金标A A A A 含含含含2%2%戊二醛戊二醛戊二醛戊二醛/3%3%3%3%多聚甲醛固定多聚甲醛固定多聚甲醛固定多聚甲醛固定 铀、铅染色铀、铅染色铀、铅染色铀、铅染色 电镜观察高电子密度的金颗粒电镜观察高电子密度的金颗粒电镜观察高电子密度的金颗粒电镜观察高电子密度的金颗粒 电镜包埋后胶体金细胞化学反应电镜包埋后胶体金细胞化学反应电镜包埋后胶体金细胞化学反应电镜包埋后胶体金细胞化学反应 (一一一一)样品固定：抗原和结构的保存样品固定：抗原和结构的保存样品固定：抗原和结构的保存样品固定：抗原和结构的保存 (二二二二)抗体、标记物以及方法选择：抗体、标记物以及方法选择：抗体、标记物以及方法选择：抗体、标记物以及方法选择：单抗、多抗单抗、多抗单抗、多抗单抗、多抗 种属关系种属关系种属关系种属关系 (三三三三)通透处理：蛋白酶、表面活性剂通透处理：蛋白酶、表面活性剂通透处理：蛋白酶、表面活性剂通透处理：蛋白酶、表面活性剂 (四四四四)对照设定：阴性、阳性、自身对照对照设定：阴性、阳性、自身对照对照设定：阴性、阳性、自身对照对照设定：阴性、阳性、自身对照 (五五五五)非特异反应的鉴别和抑制：封闭、稀释非特异反应的鉴别和抑制：封闭、稀释非特异反应的鉴别和抑制：封闭、稀释非特异反应的鉴别和抑制：封闭、稀释 阻断阻断阻断阻断 四、一些关键问题四、一些关键问题四、一些关键问题四、一些关键问题第六章第六章重点重点 一、免疫细胞化学反应原理一、免疫细胞化学反应原理一、免疫细胞化学反应原理一、免疫细胞化学反应原理 把组织细胞中的特异分子作为抗原把组织细胞中的特异分子作为抗原把组织细胞中的特异分子作为抗原把组织细胞中的特异分子作为抗原,用在显微镜下的用在显微镜下的用在显微镜下的用在显微镜下的可见标记物可见标记物可见标记物可见标记物(或标记抗原抗体复合物或标记抗原抗体复合物或标记抗原抗体复合物或标记抗原抗体复合物)标记特异抗体标记特异抗体标记特异抗体标记特异抗体,使特使特使特使特异的免疫化学反应具有可见性异的免疫化学反应具有可见性异的免疫化学反应具有可见性异的免疫化学反应具有可见性 从而间接地显示抗原从而间接地显示抗原从而间接地显示抗原从而间接地显示抗原,达到在细胞或细胞器水平定位特达到在细胞或细胞器水平定位特达到在细胞或细胞器水平定位特达到在细胞或细胞器水平定位特异分子的目的异分子的目的异分子的目的异分子的目的 二、简述免疫细胞化学的直接法和间接法二、简述免疫细胞化学的直接法和间接法二、简述免疫细胞化学的直接法和间接法二、简述免疫细胞化学的直接法和间接法 直接法直接法直接法直接法：组织抗原直接与标记的特异抗体反应：组织抗原直接与标记的特异抗体反应：组织抗原直接与标记的特异抗体反应：组织抗原直接与标记的特异抗体反应 间接法间接法间接法间接法：抗原与未标记的特异抗体（一抗）反应抗原与未标记的特异抗体（一抗）反应抗原与未标记的特异抗体（一抗）反应抗原与未标记的特异抗体（一抗）反应 一抗再作为抗原与标记的第二抗体反应一抗再作为抗原与标记的第二抗体反应一抗再作为抗原与标记的第二抗体反应一抗再作为抗原与标记的第二抗体反应 三、何谓标记物，包括哪几种？三、何谓标记物，包括哪几种？三、何谓标记物，包括哪几种？三、何谓标记物，包括哪几种？标记物：使抗体或抗原抗体复合物在各种显微标记物：使抗体或抗原抗体复合物在各种显微标记物：使抗体或抗原抗体复合物在各种显微标记物：使抗体或抗原抗体复合物在各种显微 镜下可见的物质镜下可见的物质镜下可见的物质镜下可见的物质 包括：包括：包括：包括：1 1 1 1、免疫荧光技术免疫荧光技术免疫荧光技术免疫荧光技术 2 2 2 2、免疫酶技术免疫酶技术免疫酶技术免疫酶技术 3 3 3 3 免疫亲和技术免疫亲和技术免疫亲和技术免疫亲和技术 4 4 4 4、胶体金技术胶体金技术胶体金技术胶体金技术五、五、五、五、简述简述简述简述PAPPAP法法法法（P Peroxidase-eroxidase-A Antintip peroxidase,PAPeroxidase,PAP）过氧化物酶过氧化物酶过氧化物酶过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物法抗过氧化物酶复合物法抗过氧化物酶复合物法抗过氧化物酶复合物法 一抗与组织抗原特异结合一抗与组织抗原特异结合一抗与组织抗原特异结合一抗与组织抗原特异结合 二抗又将二抗又将二抗又将二抗又将PAPPAPPAPPAP复合物与一抗连接在一起复合物与一抗连接在一起复合物与一抗连接在一起复合物与一抗连接在一起 然后加入然后加入然后加入然后加入HRPHRPHRPHRP的天然底物的天然底物的天然底物的天然底物H H H H2 2 2 2 O O O O2 2 2 2 和捕捉底物和捕捉底物和捕捉底物和捕捉底物DABDABDABDAB 光镜光镜光镜光镜-棕黄色反应产物棕黄色反应产物棕黄色反应产物棕黄色反应产物(组织抗原的定位组织抗原的定位组织抗原的定位组织抗原的定位)电镜电镜电镜电镜-与锇酸反应，呈与锇酸反应，呈与锇酸反应，呈与锇酸反应，呈高电子密度锇黑高电子密度锇黑高电子密度锇黑高电子密度锇黑（超微结构（超微结构（超微结构（超微结构 定位抗原）定位抗原）定位抗原）定位抗原）9、静夜四无邻，荒居旧业贫。9月-239月-23Tuesday,September 19,202310、雨中黄叶树，灯下白头人。14:30:1614:30:1614:309/19/2023 2:30:16 PM11、以我独沈久，愧君相见频。9月-2314:30:1614:30Sep-2319-Sep-2312、故人江海别，几度隔山川。14:30:1614:30:1614:30Tuesday,September 19,202313、乍见翻疑梦，相悲各问年。9月-239月-2314:30:1614:30:16September 19,202314、他乡生白发，旧国见青山。19 九月 20232:30:16 下午14:30:169月-2315、比不了得就不比，得不到的就不要。九月 232:30 下午9月-2314:30September 19,202316、行动出成果，工作出财富。2023/9/19 14:30:1614:30:1619 September 202317、做前，能够环视四周；做时，你只能或者最好沿着以脚为起点的射线向前。2:30:16 下午2:30 下午14:30:169月-239、没有失败，只有暂时停止成功！。9月-239月-23Tuesday,September 19,202310、很多事情努力了未必有结果，但是不努力却什么改变也没有。14:30:1614:30:1614:309/19/2023 2:30:16 PM11、成功就是日复一日那一点点小小努力的积累。9月-2314:30:1614:30Sep-2319-Sep-2312、世间成事，不求其绝对圆满，留一份不足，可得无限完美。14:30:1614:30:1614:30Tuesday,September 19,202313、不知香积寺，数里入云峰。9月-239月-2314:30:1614:30:16September 19,202314、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。19 九月 20232:30:16 下午14:30:169月-2315、楚塞三湘接，荆门九派通。九月 232:30 下午9月-2314:30September 19,202316、少年十五二十时，步行夺得胡马骑。2023/9/19 14:30:1614:30:1619 September 202317、空山新雨后，天气晚来秋。2:30:16 下午2:30 下午14:30:169月-239、杨柳散和风，青山澹吾虑。9月-239月-23Tuesday,September 19,202310、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。14:30:1614:30:1614:309/19/2023 2:30:16 PM11、越是没有本领的就越加自命不凡。9月-2314:30:1614:30Sep-2319-Sep-2312、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。14:30:1614:30:1614:30Tuesday,September 19,202313、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。9月-239月-2314:30:1614:30:16September 19,202314、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。19 九月 20232:30:16 下午14:30:169月-2315、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。九月 232:30 下午9月-2314:30September 19,202316、业余生活要有意义，不要越轨。2023/9/19 14:30:1614:30:1619 September 202317、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。2:30:16 下午2:30 下午14:30:169月-23MOMODAPOWERPOINTLorem ipsum dolor sit amet,consectetur adipiscing elit.Fusce id urna blandit,eleifend nulla ac,fringilla purus.Nulla iaculis tempor felis ut cursus.感感 谢谢 您您 的的 下下 载载 观观 看看专家告诉