复杂先心病TGA基因组学及其网络调控机制研究

复杂先心病（TGA）的基因组学及其网络调控机制研究钟 诗 龙 博 士 副 研 究 员广 东 省 人 民 医 院 医 学 研 究 中 心 、 广 东 省 心 血 管 病 研 究 所 病 因 与 致 病 机 制 不 明 确 ： 包 括 遗 传 与 环 境 因 素先 天 性 心 脏 病 在 活 产 婴 儿 中 的 发病 率 为 8-14.6严 重 影 响 威 胁 人 口 素 质 ， 给社 会 和 家 庭 带 来 极 大 负 担 尽管介入与手术能有效治疗先心病，但先心病的几个关键问题还没有解决1. 确 定 病 因 ， 有 效 预 防2. 实 现 早 期 诊 断 疾 病 、 明 确 疾 病 分 类3. 预 测 预 后 ， 进 行 个 体 化 干 预4. 阐 明 发 病 机 制 ， 发 现 治 疗 靶 标5. 随 着 理 论 与 技 术 的 发 展 ， 基 因 组 学 研 究 在 先 心 病 研究 中 扮 有 重 要 作 用 。 提 纲 基 因 组 学 的 分 子 生 物 学 基 础 ； 先 心 病 的 基 因 组 学 ：1. 染 色 体 变 异2. 单 基 因 突 变 ；3. 多 基 因 突 变 TGA的 基 因 组 学 及 其 网 络 调 控 机 制 研 究 简 介 提 纲 基 因 组 学 的 分 子 生 物 学 基 础 ； 常 见 先 心 病 的 基 因 组 学 ：1. 染 色 体 变 异2. 单 基 因 突 变 ；3. 多 基 因 突 变 TGA的 基 因 组 学 及 其 网 络 调 控 机 制 研 究 简 介 DNAmRNA(messenger)ncRNA ProteinRibosometranscription ProteinRNADNA ntranslatioiontranscripttranscription translation Epigenetics 先 心 病 的 分 子 生 物 学 基 础 ： 中 心 法 则 序 列 变 异 单 核 苷 酸 （ 突 变 、SNP和 indel）结 构 变 异1.微 星 、 拷 贝 数 变异 （ CNV）2.亚 染 色 体 组3.整 个 染 色 体 组 或基 因 组 提 纲 基 因 组 学 的 分 子 生 物 学 基 础 ； 常 见 先 心 病 的 基 因 组 学 ：1. 染 色 体 变 异2. 单 基 因 突 变 ；3. 多 基 因 突 变 TGA的 基 因 组 学 及 其 网 络 调 控 机 制 研 究 简 介 先 心 病 的 遗 传 学染 色 体 异 常 引 起 的 合 并 先 心 病 的 综 合 症13 三 体 1:15,00018 三 体 1:5,00021 三 体 (Down syndrome) 1:80022q11缺 失 ： 法 洛 四 联 症 、 DiGeorge 综 合 征其 他 较 少 见 的 染 色 体 缺 失 包 括 ： 9q34, 1q21.1, 16p11.2 and 17p11.2. Page 853 21 三体-唐氏综合症 产 前 诊 断绒 毛 膜 绒 毛 活 检10/40Miscarriage 1%Results :1 week 羊 膜 腔 穿 刺14/40Miscarriage 0.5%Results :3 weeks 用 高 通 量 测 序 法检 测 胎 儿 非 整 倍体 Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Dec 23;105(51):20458-63 BMJ. 2011 Jan 11;342:c7401 怀 孕 年 龄 35.4岁 ， 取 血 样 时 怀 孕 时 间 13周 又 1天 提 纲 基 因 组 学 的 分 子 生 物 学 基 础 ； 常 见 先 心 病 的 基 因 组 学 ：1. 染 色 体 变 异2. 单 基 因 突 变 ；3. 多 基 因 突 变 TGA的 基 因 组 学 及 其 网 络 调 控 机 制 研 究 简 介 先心病的遗传学 基 因 突 变 引 起 的 先 心 病基 因 综 合 征 心 脏 畸 形TBX1基 因 DiGeorge综 合 征 主 动 脉 离 断 、 永 存 动 脉 干 （ PTA） 、法 洛 四 联 症 （ TOF） 、 右 室 双 出 口和 大 动 脉 换 位TBX5基 因 Holt-Oram综 合 征 心 脏 畸 形 包 括 房 间 隔 缺 损 （ ASD） 、TOF和 房 室 传 导 阻 滞 等TFAP2 基 因 Char综 合 征 动 脉 导 管 未 闭PTPN11基 因 Noonan综 合 征 胸 部 畸 形 和 肺 动 脉 狭 窄 （ PS） NOTCH通 路 JAG1、NOTCH2基 因 突 变 Alagille综 合 征 动 脉 -肝 脏 发 育 不 良 、 肺 动 脉 流 出道 或 外 周 肺 动 脉 的 狭 窄 HOLT-ORAM综合征和TBX5基因 uHolt-Oram综 合 征 主 要 表 现 为 肢 体 和 心 脏 畸 形 ， 故 又 称为 心 -手 综 合 征u单 倍 体 TBX5基 因 可 导 致 Holt-Oram综 合 征 ， TBX5基因 突 变 也 是 人 类 首 个 在 心 脏 间 隔 缺 损 畸 形 中 找 到 的 单 基 因突 变 。uTBX5基 因 的 错 义 突 变 导 致 心 脏 或 肢 体 的 畸 形 则 取 决 于其 突 变 的 位 点 单 基 因 先 心 病 的 遗 传 模 式有 一 些 显 示 出 明 显 的 孟 德 尔 遗 传 模 型 ；有 的 显 性 遗 传 、 有 的 隐 性 遗 传 、 有 的 伴 性 遗 传 ；有 一 些 是 为 一 个 基 因 的 结 构 或 功 能 的 改 变 ， 即 “ 单 基 因突 变 ” ；估 计 这 种 遗 传 缺 陷 占 8% ；但 是 大 部 分 的 先 心 病 是 多 基 因 突 变 的 结 果 。 提 纲 基 因 组 学 的 分 子 生 物 学 基 础 ； 常 见 先 心 病 的 基 因 组 学 ：1. 染 色 体 变 异2. 单 基 因 突 变3. 多 基 因 突 变 TGA的 基 因 组 学 及 其 网 络 调 控 机 制 研 究 简 介 与遗传性心脏疾病相关的致病基因突变肥 厚 性 心 肌 病 扩 张 性 心 肌 病 致 心 律 失 常 性 右室 心 肌 病 长 QT综 合 症 Brugada综 合 征基 因 发 生 % 基 因 发 生 % 基 因 发 生 % 基 因 发 生 % 基 因 发 生 % MYH7 1220% LMNA 26% PKP2 1143% KCNQ1 3035% SCN5A 2025%MYBPC3 2028% MYH7 47% DSG2 726% KCNH2 2530% GPD1LTNNT2 25% MYBPC3 37% DSP 616% SCN5A 510% CACNA1CTNNI3 13% TNNT2 14% DSC2 KCNE1 1% CACNB2TPM1 13% SCN5A 23% JUP KCNE2 1% SCN1BMYL2 13% LDB3 13% RYR2 ANK2 KCNE3 ACTC1 1% PLN 13% TGFB3 KCNJ2 SCN3BMYL3 1% ACTN2 4% TMEM43 CACNA1CGLA 1% VCL 3% DES CAV3LAMP2 1% SGCD 3% SCN4BPRKAG2 1% CSRP3 2% AKAP9TNNC1 DES 2% SNTA1MYH6 TNNI3 1%MYO6 TPM1 1%TTN ACTC1 1%CSRP3 TCAP 1%MYOZ2 ABCC9 1%VCL CTF1 1%TCAP TNNC1 ACTN2 MYH6 致 病 基 因 突 变 的 发 现 有 助 于 基 因 诊 断如 对 有 肥 厚 性 心 肌 病 的 母 亲 进 行 基 因 检 测 ， 可 以 预 测其 子 女 的 风 险 。但 是 如 何 决 策 ? 基 因 突 变 用 于 诊 断 与 预 测对 遗 传 性 心 血 管 病 家 庭 进 行 遗 传 学 检 测 的 决 策 树 Caleshu C et al. Heart 2010;96:1669-1675 检 测 先 心 病 患 者致 病 突 变 可 能 致 病 突 变 未 知 功 能 突 变 阴 性 或 良 性 突 变检 测 没 有 发 病 家 族 成 员阳 性 结 果 遗 传 咨 询临 床 监 护 阴 性 结 果无 危 险无 需 进 一步 检 测 基因诊断检测：益处与风险益 处 风 险基 因 诊 断 检 测 可 以 : 确 定 胎 儿 或 个 体 是 否 处 于 遗 传疾 病 的 风 险 当 胎 儿 处 于 风 险 是 ，可 以 是 父母 和 医 生 考 虑 尽 早 作 出 产 前 诊断 性 选 择 。 检 测 结 果 也 可 以 : 使 个 人 和 家 人 难 于 决 断 ； 可 能 负 面 影 响 家 庭 稳 定 性 和 个人 关 系 基 因 突 变 用 于 预 测 预 后 ：双基因突变对肥厚性心肌病模型小鼠生 存 的 影 响 有 2个 致 病 基 因 突 变 的 个 体 比 只 含 1个 突变 的 家 族 性 肥 厚 性 心 肌 病 病 人 更 易 发生 严 重 的 心 衰Circulation. 2008;117:1820-1831肥 厚 性 心 肌 病 模 型 小 鼠 目 前 已 知 的 基 因 突 变 仅 能 部 分 解 释 先 心 病 发 病 率 ：以 肥 厚 性 心 肌 病 为 例 对 80个 不 相 关 的 先 症 者 进 行 7个 HCM 基 因 (b-MHC, MyBP-C, cTnT, cTnI, ACTC, MYL2, and MYL3) 作 基 因 突 变 检 测 在 23个 先 症 者 中 检 测 到 26个 基 因 突 变 ， 发 生 率 为 (29%) 以 往 的 研 究 主 要 集 中 在 候 选 的 信 号 通 路 或 基 因 在 全 基 因 组 范 围 全 面 发 现 新 的 先 心 病 的 致 病 基 因 突 变 ，阐 明 其 遗 传 传 递 规 律 ， 并 系 统 地 揭 示 其 致 病 机 制 成 为 目前 全 世 界 研 究 重 点 。 J Med Genet 2005;42:e59 提 纲 基 因 组 学 的 分 子 生 物 学 基 础 ； 常 见 先 心 病 的 基 因 组 学 ：1. 染 色 体 变 异2. 单 基 因 突 变3. 多 基 因 突 变 TGA的 基 因 组 学 及 其 网 络 调 控 机 制 研 究 简 介 外 显 子 组 测 序 发 现 完 全 性 大 动 脉 转 位 （ TGA） 的致 病 基 因 突 变 及 其 致 病 机 制 研 究 TGA流行病学 TGA是 新 生 儿 期 最 常 见 的 紫 绀 型 先 天 性 心 脏 病 ， 发病 率 为 0.2-0.3， 约 占 先 天 性 心 脏 病 总 数 的 5 -7 ， 男 女 患 病 之 比 为 2-4： 1。 若 不 治 疗 ， 约 90 的患 者 在 1岁 内 死 亡 。 TGA严 重 影 响 威 胁 人 口 素 质 ， 给 社 会 和 家 庭 带 来 极大 负 担 。 在 病 理 上 ：大 动 脉 转 位 时 ， 主 动 脉 瓣 下 圆 锥 发 达 ， 未 被 吸 收 ， 主 动 脉 位于 左 前 上 方 ；肺 动 脉 瓣 下 圆 锥 萎 缩 ， 肺 动 脉 位 于 作 后 下 方 。 发 病 原 因 及 其 发 病 机 制 目 前 还 不 清 楚 。 以 往 的 研 究 主 要 集 中 在 与 体 轴 形 成 有 关 的 信 号 通 路或 基 因 发 现 了 一 些 TGA致 病 基 因 变 异 ： CFC1、 GDF1、NODAL等 NODAL信号通路与左右体轴形成有关 TGA的致病基因突变基 因 位 置 突 变 类 型CFC1 exon 4 splice donor site IVS4DS DUPGDF1 exon 3 CYS227TERFOXH1 exon 1 Pro21SerNODAL exon 2 9-BP INSERTION/24-BP DELETION, NT700 Donor splice site of intron 2 IVS2DS, G-A, +1 exon 3 IVS2-1GCMED13L exon 6 752A-GGLU251GLY exon 25 5615G-A、 ARG1872HIS exon 28 6068A-GASP2023GLYZIC3 exon 2 1741A-T, LYS-TER exon 1 763T-G,TRP255GLY exon 1 GLY17CYSNKX2.5 exon 2 VAL150ILE 这 些 突 变 不 足 以 解 释 TGA的 高 发 病 率 ；尤 其 在 中 国 人 中 ：我 们 在 28个 TGA患 者 及 10个 家 系 成 员 中 没 有 检 测 到 这些 突 变 科学问题1. 能 否 在 全 外 显 子 组 范 围 找 到 引 起 TGA的 致 病 基 因 突变 ？2. 它 们 在 父 代 与 子 代 之 间 的 传 递 规 律 如 何 ？ 明 确 其 传递 规 律 将 为 早 期 诊 断 提 供 TGA分 子 预 警 的 标 记 。3. 通 过 系 统 生 物 学 的 方 法 识 别 基 因 组 中 关 键 节 点 基 因及 其 网 络 ， 对 于 致 病 基 因 突 变 的 机 制 研 究 具 有 方 向性 指 导 作 用 。 4. 高 糖 对 致 病 基 因 突 变 有 没 有 协 同 作 用 ？ 全基因组外显子测序（EXOME SEQUENCING） 外 显 子 组 测 序 是 一 种 新 型 的 基 因 组 分 析 技 术 ， 只 需 针对 外 显 子 区 域 的 DNA即 可 ， 能 够 发 现 位 于 编 码 区 的SNPs和 小 的 InDels。 因 此 与 全 基 因 组 重 测 序 相 比 ，外 显 子 组 测 序 更 加 简 便 、 经 济 、 高 效 ， 已 成 为 现 阶 段基 因 测 序 工 作 的 重 心 权重基因共表达网络分析 权 重 基 因 共 表 达 网 络 分 析 是 一 种 用 于 解 析 分 子 作 用 机制 和 网 络 关 系 的 系 统 生 物 学 方 法 。 它 充 分 利 用 基 因 表 达 的 内 在 信 息 ， 把 高 度 关 联 的 转 录子 聚 类 成 一 族 ， 称 作 一 个 模 块 (module)， 然 后 识 别与 临 床 相 关 的 模 块 ， 最 后 用 模 块 内 连 通 性（ intramodular connectivity） 和 基 因 重 要 性（ gene significance） 识 别 信 号 通 路 上 关 键 调 控 基 因（ Hub genes） 。 网 络 构 建Tools: Pearson correlation, Soft thresholdingRationale: make use of interaction patterns between genes模 块 识 别Tools: TOM, Hierarchical clusteringRationale: module- (pathway-) based analysis找 到 模 块 代 表 性 基 因Tools: eigengene (1 st Principal Component)Rationale: Condense each module into one profile进 一 步 分 析模 块 相 关 性 ， 模 块 重 要 性 、 析 因 分 析 等 . 第 一 部 分 ： 全 基 因 组 外 显 子 测 序 寻 找 TGA的 致 病 错 义 基 因 突 变1.筛 选 阶 段 完 全 性 大 动 脉 转 位 患 者 (12例 )Agilent 全 外 显 子 捕 获 Solexa测 序 生 物 信 息 学 分 析注 释 和 统 计 分 析 、 排 除 非 基 因 、 内 含 子 、 同义 突 变 、 已 知 SNP 潜 在 致 病 突 变 Sanger测 序排 除 没 有 验 证 的 潜 在 致 病 突 变 TGA患 者150例 包 括 核 心 家 系50个 健 康 志 愿 者500例基 因 型 与 表 型 是 否发 生 共 分 离 验 证 潜 在 致 病突 变 2. 验 证 阶 段 TGA主 动 脉 瓣 下 圆锥 组 织 权 重 基 因 共 表 达 网 络 分 析TGA肺 动 脉 瓣 下 圆锥 组 织 TGA肺 动 脉 瓣 下 圆 锥 与 干 下 型肺 动 脉 瓣 下 圆 锥 的 差 异 模 块干 下 型 患 者 的 肺 动 脉瓣 下 圆 锥 组 织 TGA的 关 键 信 号 通 路 及 关 键 节点 基 因TGA主 动 脉 瓣 下 圆 锥 与 干 下 型肺 动 脉 瓣 下 圆 锥 的 差 异 模 块TGA的 差 异 模 块 1. 权 重 基 因 共 表 达 网 络 分 析 识 别 TGA的 关 键 信 号 通 路 及 关 键 节点 基 因 ，第 二 部 分 ： 致 病 错 义 基 因 突 变 的 分 子 机 制 野 生 型 致 病 基 因P19细 胞 功 能Nodal信 号 应 答突 变 型 致 病 基 因基 因 突 变 的 功 能 及 其分 子 机 制致 病 基 因 与 NODAL信 号 通 路 基 因 细 胞 定位 与 表 达 高 糖2. 致 病 错 义 基 因 突 变 通 过 TGA关 键 节 点 对 NODAL信 号 通 路的 调 控 机 制 预期结果1. 在 全 基 因 组 外 显 子 组 范 围 发 现 TGA致 病 错 义 基 因 突变 发 现 发 现 ；2. 阐 明 致 病 错 义 基 因 突 变 在 父 母 代 与 子 代 之 间 的 传 递规 律 ， 为 早 期 诊 断 提 供 分 子 遗 传 预 警 的 标 记 。3. 通 过 权 重 基 因 共 表 达 网 络 分 析 识 别 TGA的 关 键 信 号通 路 及 关 键 节 点 基 因 。4. 阐 明 致 病 错 义 基 因 突 变 对 细 胞 功 能 的 影 响 ， 揭 示 致病 基 因 通 过 TGA关 键 节 点 对 NODAL信 号 通 路 作 用的 分 子 机 制 ， 并 阐 明 阐 明 环 境 因 素 如 高 糖 对 致 病 错义 基 因 突 变 作 用 效 果 的 协 同 作 用 。 谢 谢