中医中药2005年版中国药典研讨

2005年版年版中国药典中国药典研讨研讨2讨讨论论内内容容热热原原检查检查法法 异常毒性异常毒性检查检查法法过过敏反敏反应检查应检查法法抗生素微生物检定法抗生素微生物检定法细细菌内毒素菌内毒素检查检查法法 3一、热原检查法一、热原检查法试验前的准备试验前的准备在作热原检查前在作热原检查前12日，日，供试用家兔应尽可能处于同一温度的环供试用家兔应尽可能处于同一温度的环境中，实验室和饲养室的温度相差不得境中，实验室和饲养室的温度相差不得大于大于5，实验室的温度应在，实验室的温度应在1725，在试验全部过程中，应注意室温变化不在试验全部过程中，应注意室温变化不得大于得大于3，避免噪音干扰。家兔在试验，避免噪音干扰。家兔在试验前至少前至少1小时开始停止给食并置于适宜的小时开始停止给食并置于适宜的装置中，直至试验完毕。装置中，直至试验完毕。4结果判断结果判断在初试在初试3只家兔中，体温升只家兔中，体温升高均低于高均低于0.6，并且，并且3只家兔体温升只家兔体温升高总和低于高总和低于1.4；或在复试的；或在复试的5只家只家兔中，体温升高兔中，体温升高0.6或或0.6以上的以上的兔数仅有兔数仅有1只，并且初试、复试合并只，并且初试、复试合并8只家兔的体温升高总和为只家兔的体温升高总和为3.5或或3.5以下，均认为供试品的热原检以下，均认为供试品的热原检查符合规定。查符合规定。5在初试在初试3只家兔中，体温升高只家兔中，体温升高0.6或或0.6以上的家兔超过以上的家兔超过1只；或在复试只；或在复试的的5只家兔中，体温升高只家兔中，体温升高0.6或或0.6以上的家兔超过以上的家兔超过1只；或在初试、只；或在初试、复试合并复试合并8只家兔的体温升高总和超只家兔的体温升高总和超过过3.5，均认为供试品的热原检查，均认为供试品的热原检查不符合规定。不符合规定。当家兔升温为负值时，均以当家兔升温为负值时，均以0.计。计。6二、二、异常毒性异常毒性检查检查法法无实质性修改内容无实质性修改内容注意：环境条件注意：环境条件动物来源动物来源该法有被减少的可能该法有被减少的可能7三、过敏反应检查法三、过敏反应检查法为新增方法为新增方法本法系将一定量的供试品溶液注入本法系将一定量的供试品溶液注入豚鼠体内，间隔一定时间后静脉注豚鼠体内，间隔一定时间后静脉注射供试品进行攻击，观察动物出现射供试品进行攻击，观察动物出现过敏反应的情况，以判定供试品是过敏反应的情况，以判定供试品是否引起动物全身过敏反应。否引起动物全身过敏反应。8供实验用豚鼠应健康合格，体重供实验用豚鼠应健康合格，体重250350g，雌鼠应无孕。在实验前和，雌鼠应无孕。在实验前和实验过程中，均应按正常饲养条件实验过程中，均应按正常饲养条件饲养。做过本实验的豚鼠不得重复饲养。做过本实验的豚鼠不得重复使用。使用。供试品溶液的配制供试品溶液的配制除另有规定外，除另有规定外，均按各品种项下规定的浓度配制成均按各品种项下规定的浓度配制成供试品溶液。供试品溶液。9检检查查法法除除另另有有规规定定外外，取取上上述述豚豚鼠鼠6只只，隔隔日日每每只只每每次次腹腹腔腔注注射射供供试试品品0.5ml，共共3次次，进进行行致致敏敏。然然后后将将其其均均分分为为2组组，每每组组3只只，分分别别在在首首次次注注射射后后第第14日日和和第第21日日，由由静静脉脉注注射射供供试试品品1ml进进行行攻攻击击。每每日日观观察察每每只只动动物物的的行行为为和和体体征征，首首次次致致敏敏和和攻攻击击前前测测定定和和记记录录每每只只动动物物的的体体重重。观观察察攻攻击击后后30分分钟钟内内，动动物物有有无无竖竖毛毛、呼呼吸吸困难、抽搐等过敏反应症状。困难、抽搐等过敏反应症状。10结果判定结果判定静静脉脉注注射射供供试试品品后后30分分钟钟内内，不不得得出出现现过过敏敏反反应应。如如有有竖竖毛毛、喷喷嚏嚏、干干呕呕、连连续续咳咳嗽嗽3声声和和呼呼吸吸困困难难等等现现象象中中的的2种种或或2种种以以上上，或或出出现现抽抽搐搐、休休克克、死死亡亡现现象象之之一一者者，判判供供试试品品不符合规定。不符合规定。11四、四、抗生素微生物检定法本本法法系系在在适适宜宜条条件件下下，根根据据量量反反应应平平行行线线原原理理设设计计，通通过过检检测测抗抗生生素素对对微微生生物物的的抑抑制制作作用用，计计算算抗抗生生素素活性（效价）的方法。活性（效价）的方法。12抗生素微生物检定法抗生素微生物检定法包括两种方法，即管碟法和浊度法。包括两种方法，即管碟法和浊度法。测测定定结结果果经经计计算算所所得得的的效效价价，如如低低于于估估计计效效价价的的90或或高高于于估估计计效效价价的的110时时，应应调调整整其其估估计计效效价价，重重新试验。新试验。除除另另有有规规定定外外，本本法法的的可可信信限限率率不不得大于得大于5。13第一法第一法管碟法管碟法本本法法系系利利用用抗抗生生素素在在琼琼脂脂培培养养基基内内的的扩扩散散作作用用，比比较较标标准准品品与与供供试试品品两两者者对对接接种种的的试试验验菌菌产产生生抑抑菌菌圈圈的的大大小小，以以测测定定供供试试品品效效价价的的一一种种方方法法14第二法第二法浊度法浊度法本本法法系系利利用用抗抗生生素素在在液液体体培培养养基基中中对对试试验验菌菌生生长长的的抑抑制制作作用用，通通过过测测定定培培养养后后细细菌菌浊浊度度值值的的大大小小，比比较较标标准准品品与与供供试试品品对对试试验验菌菌生生长长抑抑制制的的程程度度，以以测测定定供供试试品品效效价的一种方法。价的一种方法。15菌悬液制备菌悬液制备金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌（Staphylococcusaureus）悬悬液液取取金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌CMCC（B）26003的的营营养养琼琼脂脂斜斜面面培培养养物物，接接种种于于营营养养琼琼脂脂斜斜面面上上，在在3537培培养养2022小小时时。临临用用时时，用用灭灭菌菌水水或或0.9%灭灭菌菌氯氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。化钠溶液将菌苔洗下，备用。16大肠杆菌（大肠杆菌（Escherichiacoli）悬）悬液液取大肠杆菌取大肠杆菌CMCC（B）44103的营养琼脂斜面培养物，的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在接种于营养琼脂斜面上，在3537培养培养2022小时。临用时，小时。临用时，用灭菌水将菌苔洗下，备用。用灭菌水将菌苔洗下，备用。17白色念珠菌（白色念珠菌（Candidaalbicans）悬）悬液液取白色念珠菌取白色念珠菌CMCC(F)98001的改的改良马丁琼脂斜面的新鲜培养物，接种良马丁琼脂斜面的新鲜培养物，接种于于10ml培养基培养基IX中，置中，置3537培培养养8小时，再用培养基小时，再用培养基IX稀释至适宜稀释至适宜浓度，备用浓度，备用18标准品溶液的制备标准品溶液的制备标准品的使用和保存，应照标准标准品的使用和保存，应照标准品说明书的规定。临用时照各品种品说明书的规定。临用时照各品种项下的规定进行稀释。项下的规定进行稀释。标准品的品种、分子式及理论计算标准品的品种、分子式及理论计算值见表值见表2。供试品溶液的制备供试品溶液的制备精密称（或量）精密称（或量）取供试品适量，照各品种项下规定取供试品适量，照各品种项下规定进行供试品溶液的配制。进行供试品溶液的配制。19含含试试验验菌菌液液体体培培养养基基的的制制备备临临用用前前，取取规规定定的的试试验验菌菌悬悬液液适适量量（3537培培养养34小小时时后后测测定定的的吸吸收收值值在在0.30.7之之间间，且且剂剂距距为为2的的相相邻邻剂剂量量间间的的吸吸光光度度差差值值不不小小于于0.1），加加入入到到各各规规定定的的液液体体培培养养基基中中，混混合合，使使在在试试验验条条件件下下能能得得到到满满意意的的剂量反应关系和适宜的测定浊度。剂量反应关系和适宜的测定浊度。已已接接种种试试验验菌菌的的液液体体培培养养基基应应立立即即使用。使用。20药典浊度法设计表药典浊度法设计表庆大霉素庆大霉素金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌培培养养基基IIIpH值值7.0-7.2灭灭菌菌缓缓冲冲液液pH值值7.8抗抗生生素素浓浓度度范范围围0.15-1.0单单位位/ml培养条件培养条件35-3721检定法检定法标标准准曲曲线线法法：除除另另有有规规定定外外，取取适适宜宜的的大大小小厚厚度度均均匀匀的的已已灭灭菌菌试试管管，在在各各品品种种项项下下规规定定的的剂剂量量反反应应线线性性范范围围内内，以以线线性性浓浓度度范范围围的的中中间间值值作作为为中中间间浓浓度度，标标准准品品溶溶液液选选择择5个个剂剂量量，剂剂量量间间的的比比例例应应适适宜宜（通通常常为为1:1.25或或更更小小），供供试试品品根根据据估估计计效效价价或或标标示示量量溶溶液液选选择择中中间间剂剂量量，每每一一剂剂量量不不少少于于3个试管。个试管。22在在各各试试验验管管内内精精密密加加入入含含试试验验菌菌的的液液体体培培养养基基9.0ml，再再分分别别精精密密加加入入各各浓浓度度的的标标准准品品或或供供试试品品溶溶液液各各1.0ml，立立即即混混匀匀，按按随随机机区区组组分分配配将将各各管管在在规规定定条条件件下下培培养养至至适适宜宜测测量量的的浊浊度度值值（通通常常约约为为4小小时时），在在线线测测定定或或取取出出立立即即加加入入甲甲醛醛溶溶液液（13）0.5ml以以终终止止微微生生物物生生长长，在在530nm或或580nm波波长处测定各管的吸光度。长处测定各管的吸光度。23同同时时另另取取2支支试试管管各各加加入入药药品品稀稀释释剂剂1.0ml，再再分分别别加加入入含含试试验验菌菌的的液液体体培培养养基基9.0ml，其其中中一一支支试试管管与与上上述述各各管管同同法法操操作作作作为为细细菌菌生生长长情情况况的的阳阳性性对对照照，另另一一支支试试管管立立即即加加入入甲甲醛醛溶溶液液0.5ml，混混匀匀，作作为为吸吸光光度度测测定定的的空空白白液液。照照标标准准曲曲线线法进行可靠性检验和效价计算。法进行可靠性检验和效价计算。24效效价价的的计计算算求求出出各各剂剂量量点点的的吸吸收收度度平平均均值值，以以剂剂量量吸吸收收度度平平均均值值求求出出相相应的标准曲线线性方程应的标准曲线线性方程Y=bX+a其其中中Y为为吸吸收收度度平平均均值值，X为为抗抗生生素素浓浓度（或浓度的数学转换值）度（或浓度的数学转换值）供供试试品品的的效效价价计计算算供供试试品品吸吸收收度度的的平平均均值值，代代入入线线性性方方程程求求得得抗抗生生素素的的量量，再再乘乘于于供供试试品品的的稀稀释释度度，即即得得供供试试品品中抗生素的量。中抗生素的量。25二剂量法或三剂量法：二剂量法或三剂量法：除除另另有有规规定定外外，取取大大小小一一致致的的已已灭灭菌菌的的试试管管，在在各各品品种种项项下下规规定定的的剂剂量量反反应应线线性性范范围围内内，选选择择适适宜宜的的高高、（中中、）低低浓浓度度，分分别别精精密密加加入入各各浓浓度度的的标标准准品品和和供供试试品品溶溶液液各各1.0ml，二二剂剂量量的的剂剂距距为为2：1或或4：1，三三剂剂量量的的剂剂距距为为1：0.8。同同标标准准曲曲线线法法操操作作，每每一一浓浓度度组组不不少少于于4个个试试管管，按按随随机机区区组组分分配配将将各各试试管管在在规规定定条条件件下下培培养养。照照生生物物检检定定统统计计法法（附附录录XIV）中中的的（2.2）和和（3.3）法法进进行行可可靠靠性性测测验验及及效效价计算。价计算。2005年版中国药典细菌内毒素检查法简介 27中国药典中国药典2005版细菌内毒素版细菌内毒素检查法检查法方法方法1 凝胶法凝胶法 A、凝胶限量试验、凝胶限量试验 B、凝胶半定量试验、凝胶半定量试验 方法方法2 光度测定法光度测定法 A、浊度法、浊度法 B、显色基质法、显色基质法 。细菌内毒素检查方法1 基本概念基本概念和发展和发展2 凝胶限量试验 3 鲎试剂灵敏度复核鲎试剂灵敏度复核4 干扰试验干扰试验5 凝胶半定量试验6 光度测定法291基本概念和发展1.1 热原的分类热原的分类1.2 热原的检测方法热原的检测方法1.3 细菌内毒素检测（细菌内毒素检测（BET）1.4 BET技术的应用与发展技术的应用与发展1.30热原的分类热原的分类外源性热原外源性热原内源性热原内源性热原1.131外源性热原外源性热原内毒素热原内毒素热原革兰氏阴性细菌细胞壁的组分，脂多糖革兰氏阴性细菌细胞壁的组分，脂多糖(LPS)非内毒素热原非内毒素热原除内毒素外的热原（病毒、细菌、真菌、除内毒素外的热原（病毒、细菌、真菌、抗体抗体-抗原复合物、细胞分裂素）抗原复合物、细胞分裂素）脂磷壁酸脂磷壁酸(Lipoteichoic)，一种来源于革兰，一种来源于革兰氏阳性细菌的热原氏阳性细菌的热原1.132内源性热原内源性热原细胞分裂素：细胞分裂素：IL-1,IL-2,IL-6,IL-8产生细胞分裂素的物质：产生细胞分裂素的物质：外单核细胞及嗜中性细胞外单核细胞及嗜中性细胞固定组织巨嗜细胞固定组织巨嗜细胞胞状和腹膜巨嗜细胞胞状和腹膜巨嗜细胞发热机理：细胞分裂素刺激前下丘脑发热机理：细胞分裂素刺激前下丘脑1.133热原的主要检查方法热原的主要检查方法体内热原检查法体内热原检查法兔温法兔温法(PT)是一是一种体内的、全热原的检查方法。种体内的、全热原的检查方法。1942年年USP 12版第一次收载该法。版第一次收载该法。各国药典至今仍然使用该法。各国药典至今仍然使用该法。1.234体外热原检查法（体外热原检查法（IPT）是一种体外的利用人血细胞反应的外是一种体外的利用人血细胞反应的外源性热原检查法。源性热原检查法。尚未有药典收载该法，但欧洲药典将尚未有药典收载该法，但欧洲药典将会在会在2005年率先收载该法。年率先收载该法。IPT有取代有取代PT的趋势。的趋势。1.2.235细菌内毒素检查法（细菌内毒素检查法（BET）细菌内毒素检查法细菌内毒素检查法使用鲎试剂检测细菌内毒素的方法使用鲎试剂检测细菌内毒素的方法1.2.336历史回顾历史回顾鲎试剂的发明与鲎试剂的发明与BET的应用的应用1956年，美国科学家年，美国科学家F.Bang发表论文发表论文鲎的一种细菌性疾病鲎的一种细菌性疾病，阐述了细，阐述了细菌内毒素使鲎血凝固的现象，从此拉菌内毒素使鲎血凝固的现象，从此拉开了开了BET研究与应用的帷幕。研究与应用的帷幕。1.337BET技术的应用与发展的趋势与特点技术的应用与发展的趋势与特点BET取代取代PT成为必然的趋势成为必然的趋势1980年的年的USPXX版收载版收载BET法，但法，但未规定任何品种应用；未规定任何品种应用；1999年年USPXXIV版规定版规定670种药品作种药品作BET项，仅约项，仅约20种药品保留种药品保留PT项。项。1.4381993年年CP1990版增补本收载版增补本收载BET法，同样未涉及任何品种使用；法，同样未涉及任何品种使用；CP2000年版有年版有69个品种规定作个品种规定作BET项。项。CP2005年版有年版有112种药品规定种药品规定作作BET项。项。其它国家药典对药品的其它国家药典对药品的BET项，同项，同样经历了从无到有，从少到多的过样经历了从无到有，从少到多的过程。程。BET取代取代PT是已成为必然的趋是已成为必然的趋势。势。39 2005年版药典年版药典BET法将基本与法将基本与“BET国际协调方案国际协调方案”一致。一致。顺应全球国际医药贸易一体顺应全球国际医药贸易一体化的需要，从化的需要，从2001年年1月起，美国月起，美国药典（药典（USP），欧洲药典（），欧洲药典（EP）以及日本药局方（以及日本药局方（JP）开始执行）开始执行统一的统一的BET法，即法，即“BET国际协调国际协调方案方案”。40l细菌内毒素与热原的关系细菌内毒素与热原的关系l热原（热原（Progen）指临床上能使哺乳类动物产生）指临床上能使哺乳类动物产生热原反应的物质。关于热原的定义在学术上还热原反应的物质。关于热原的定义在学术上还有争论。有争论。l细菌内毒素（细菌内毒素（Endotoxin）革兰氏阴性细菌细）革兰氏阴性细菌细胞壁的构成成分，具有多种生物活性，其化学胞壁的构成成分，具有多种生物活性，其化学结构是脂多糖（结构是脂多糖（LPS）。）。l热原与内毒素的关系在学术上仍有争论，但热原与内毒素的关系在学术上仍有争论，但在在GMP的条件下，在药检的范畴里，内毒素是的条件下，在药检的范畴里，内毒素是主要的热原物质，可以说无内毒素就无热原，主要的热原物质，可以说无内毒素就无热原，控制内毒素就控制热原控制内毒素就控制热原。细菌内毒素细菌内毒素41内毒素的分子结构沙门氏菌内毒素分子的结构示意图CDBACDBAGlcGalGlcHepHepkDoGlcNGalHepHepPPkDokDoGlcNPPEtNPAraNReRdRbRanO-特异侧链核心区类脂A内毒素的分子结构：内毒素的分子结构：43内毒素的生物活性l致热性；致热性；l致死性；致死性；l引起血液白细胞中的粒细胞下降；引起血液白细胞中的粒细胞下降；l产生产生“施瓦兹夏施瓦兹夏”现象；现象；l激活凝血系统；激活凝血系统；l血压下降；血压下降；l诱导机体对内毒素的耐受性；诱导机体对内毒素的耐受性；l引起淋巴细胞的有丝分裂；引起淋巴细胞的有丝分裂；l诱导抗感染的非特异性；诱导抗感染的非特异性；l杀死肿瘤细胞；杀死肿瘤细胞；l与鲎试剂反应；与鲎试剂反应；l标准内毒素与环境内毒素标准内毒素与环境内毒素1)标准内毒素标准内毒素1)指经人工提取精制并经生物效价测定的细指经人工提取精制并经生物效价测定的细菌内毒素，作为细菌内毒素检查的参考品或菌内毒素，作为细菌内毒素检查的参考品或对照品。对照品。国际标准品（国际标准品（IS）参考标准品参考标准品（RSE）国家标准品（国家标准品（NS）标准内毒素标准内毒素工作标准品工作标准品（CSE）452)环境内毒素（环境内毒素（EET）天然产生的内毒素，普遍存在于水、空气天然产生的内毒素，普遍存在于水、空气和各种原料中，成分除了脂多糖外还含有较和各种原料中，成分除了脂多糖外还含有较多的蛋白质、多糖和其它杂质。多的蛋白质、多糖和其它杂质。3)精制内毒素与环境内毒素的差异精制内毒素与环境内毒素的差异组组成成：精制内毒素：精制内毒素脂、多糖，具有脂、多糖，具有两极活性；两极活性；环境内毒素环境内毒素脂、多糖、蛋白脂、多糖、蛋白质和杂质，两质和杂质，两极活性不明显极活性不明显致热性致热性：精制内毒素：精制内毒素致热性强；致热性强；环境内毒素环境内毒素致热性较弱致热性较弱46l细菌内毒素标准品的稀释细菌内毒素标准品的稀释lCP2005年版规定内毒素标准品溶解后年版规定内毒素标准品溶解后要在旋涡混合器上混合要在旋涡混合器上混合15分钟，以后分钟，以后的每一步稀释前要至少混合的每一步稀释前要至少混合30秒，其秒，其他国家药典也有类似要求；他国家药典也有类似要求；l具有两极活性的内毒素分子在水中呈现具有两极活性的内毒素分子在水中呈现不均匀分布；不均匀分布；l不按要求进行旋涡混合会使所稀释的不按要求进行旋涡混合会使所稀释的内毒素效价偏低，造成灵敏度标示偏内毒素效价偏低，造成灵敏度标示偏高、阳性对照不凝等不正确的实验结高、阳性对照不凝等不正确的实验结果。果。4849鲎试剂l认识：一种海洋无脊椎动物，蓝色的血液。认识：一种海洋无脊椎动物，蓝色的血液。l种类以及分布：种类以及分布：美洲鲎：北美洲东岸海域美洲鲎：北美洲东岸海域中国鲎：中国东南沿海中国鲎：中国东南沿海南方鲎：泰国和马来群岛海域南方鲎：泰国和马来群岛海域圆尾鲎：东南亚西部海域圆尾鲎：东南亚西部海域l鲎的保护：鲎的保护：由于生长慢，捕杀恶劣，资源频临灭绝，我们由于生长慢，捕杀恶劣，资源频临灭绝，我们公司一般在采鲎血后，又将其及时放归大海，公司一般在采鲎血后，又将其及时放归大海，这样并不影响鲎的生存。这样并不影响鲎的生存。鲎鲎四亿年前就存在的古老的海洋生物四亿年前就存在的古老的海洋生物50这就是鲎515253鲎试剂：鲎血液变形细胞裂解物冷冻鲎试剂：鲎血液变形细胞裂解物冷冻干燥制备而成干燥制备而成鲎试剂的种类：依据鲎的种类分：鲎试剂的种类：依据鲎的种类分：美洲鲎试剂（美洲鲎试剂（LAL）中国鲎试剂（中国鲎试剂（TAL）圆尾鲎试剂（圆尾鲎试剂（CAL）依据检查方法分：依据检查方法分：凝胶法鲎试剂和定量法鲎试剂凝胶法鲎试剂和定量法鲎试剂5455鲎试剂的主要质量指标鲎试剂的主要质量指标灵敏度：表示在细菌内毒素检查法灵敏度：表示在细菌内毒素检查法规定的条件下，能检测出标准内毒规定的条件下，能检测出标准内毒素水溶液中最低内毒素浓度。以素水溶液中最低内毒素浓度。以EU/ml为单位，灵敏度的标示值用为单位，灵敏度的标示值用字母字母“”表示。表示。自身凝集自身凝集缓冲能力缓冲能力干燥失重干燥失重无菌无菌56细菌内毒素检查用水细菌内毒素检查用水凝凝胶胶法法细细菌菌内内毒毒素素检检查查用用水水系系指指内内毒毒素素含含量量小小于于0.015EU/ml的的灭菌注射用水。灭菌注射用水。定定量量测测定定用用的的细细菌菌内内毒毒素素检检查查用用水水，其其内内毒毒素素的的含含量量应应小小于于0.005EU/ml。C因子因子活化的活化的C因子因子内毒素内毒素活化的活化的B因子因子B因子因子凝固酶凝固酶凝固酶原凝固酶原凝固蛋白（凝胶）凝固蛋白（凝胶）凝固蛋白原凝固蛋白原(1,3)(1,3)-D-葡聚糖或葡聚糖或LAL-RM活化的活化的G因子因子（旁路反应）（旁路反应）G因子因子二价阳离子二价阳离子凝胶法鲎试剂与内毒素的反应机理复杂的酶促反应过程 凝胶限量法实验设计编号编号内毒素浓度内毒素浓度/配制内配制内毒素的溶液毒素的溶液平行管数平行管数A无无/供试品溶液供试品溶液2B2/供试品溶液供试品溶液2C2/检查用水检查用水2D无无/检查用水检查用水2凝胶限量试验设计2000版药典版药典溶液溶液平行管数平行管数NPC2NC1PC1PPC1试验有效性：试验有效性：NC为阴性，为阴性，PC和和PPC均为阳性。均为阳性。2005修改版修改版溶液溶液平行管数平行管数NPC2NC2PC2PPC2试验有效性：试验有效性：NC均为阴均为阴性，性，PC和和PPC均为阳性。均为阳性。60药药品品的的细细菌菌内内毒毒素素限限值值：一一般般标标准准上上已已经经给给出出。如如0.25EU/ml0.25EU/ml，0.5EU/ml0.5EU/ml，0.01EU/mg0.01EU/mg等。等。如如：注注 射射 用用 头头 孢孢 拉拉 定定L=0.20EU/mgL=0.20EU/mg，注注射射用用头头孢孢曲曲松松钠钠L=0.20EU/mg.L=0.20EU/mg.611 1实验器材和准备工作实验器材和准备工作 鲎鲎试试剂剂（注注意意选选择择规规格格和和灵灵敏敏度度）：例例：选选用用装装量量为为0.1ml/0.1ml/支支，灵灵敏敏度度为为 0.25EU/ml0.25EU/ml的鲎试剂。的鲎试剂。细细菌菌内内毒毒素素检检查查用用水水：专专用用水水，内内毒毒素素含量小于含量小于0.015EU/ml0.015EU/ml。细细菌菌内内毒毒素素工工作作标标准准品品：10-500EU/10-500EU/支支，中国药品行物制品检定所生产。中国药品行物制品检定所生产。622 2样样品品供供试试液液的的制制备备：样样品品数数量量：取取样样品品用用细细菌菌内内毒毒素素检检查查用用水水（特特殊殊要要求求的的另另作作规规定定）溶溶解解并并稀稀释释。供试液制备：在供试液制备：在无菌条件下无菌条件下进行进行.液液体体类类：取取供供试试品品直直接接稀稀释释：根根据据供供 试试 品品 的的 内内 毒毒 素素 限限 值值（如如L=0.5EU/ml)L=0.5EU/ml)和和所所用用鲎鲎试试剂剂的的灵灵敏敏度度（如如=0.25EU/ml)=0.25EU/ml)进进行行，稀稀释倍数释倍数=L/=L/=2=263粉末类粉末类：原料和注射用粉针：原料和注射用粉针根根 据据 供供 试试 品品 的的 内内 毒毒 素素 限限 值值（如如L=0.20EU/mg)L=0.20EU/mg)和和所所用用鲎鲎试试剂剂的的灵灵敏敏度度（如（如=0.25EU/ml)=0.25EU/ml)进行。进行。取取一一定定量量的的粉粉末末（如如50mg50mg以以活活性性计计加加水水2ml=25mg/ml,L=5EU/ml2ml=25mg/ml,L=5EU/ml）稀稀 释释 倍倍 数数=L/=L/=20=20粉针剂：可直接按标示量（如粉针剂：可直接按标示量（如1g/1g/瓶）瓶）稀释，加水稀释，加水5ml 5ml L=0.20EU/mg*1000mg/5ml=40EU/mlL=0.20EU/mg*1000mg/5ml=40EU/ml稀稀释倍数释倍数=L/=L/=160=160643细细菌菌内内毒毒素素工工作作标标准准品品的的稀稀释释：举举例例内内毒毒素素规规格格为为70EU/70EU/支支，批批号号2001-32001-3，生生产产单单位：位：中国药品生物制品检定所。取取一一支支内内毒毒素素，用用砂砂轮轮片片割割开开安安瓿瓿曲曲颈颈上上端端，（尽尽量量保保留留较较长长的的安安瓿瓿颈颈），加加入入1ml1ml无无热热原原水水（以以下下简简称称水水），用用胶胶布布在在洒洒精精灯灯上上烧烧灼灼后后封封口口。置置旋旋涡涡混混合合器器上上混混合合1515分分种种，此此时时的的内内毒毒素素浓浓度度为为70EU/ml,70EU/ml,再再稀稀释释1010倍倍为为7EU/ml7EU/ml，再再稀稀释释7 7倍倍为为1EU/ml,1EU/ml,再再稀稀释释2 2倍倍为为0.5EU/ml.即即得得。最最终终内内毒毒素素的的浓浓 度度 为为 鲎鲎 试试 剂剂 灵灵 敏敏 度度 的的 两两 倍倍，(0.125EU/ml(0.125EU/ml2=0.25EU/ml2=0.25EU/ml）。）。65664具体操作：取鲎试剂取鲎试剂8支支（灵敏度为灵敏度为0.25EU/ml,装量装量为为0.1ml/支支），），打开安瓿，各加打开安瓿，各加0.1ml水复水复溶解，放置溶解，放置5分钟，（实验分配如下分钟，（实验分配如下：2支支为样品管，为样品管，2支支为阴性对照管为阴性对照管，2支支为阳性为阳性对照管，对照管，2支支为样品阳性对照管）。样品为样品阳性对照管）。样品管管 再分别加入样品再分别加入样品供试液供试液0.1ml，阴性对阴性对照管再加照管再加0.1ml水水，阳性对照管再加入内阳性对照管再加入内毒素液毒素液（浓度为（浓度为2 即 0.5EU/ml）0.1ml。轻轻振摇，用胶布封口，置轻轻振摇，用胶布封口，置37水浴保持水浴保持60分钟分钟，轻轻取出，轻轻取出，翻转翻转180度，度，观察凝胶观察凝胶情况。情况。67685、结果观察凡凡凝凝胶胶坚坚硬硬，不不变变形形、不不流流动动、不不滑滑脱脱者者为为阳阳性性（记记作作+）；凡凡无无凝凝胶胶形形成成、或或虽虽有有凝凝胶胶但但凝凝胶胶变变形形、流流动动、滑滑脱脱者者为为阴阴性性（记作（记作-）。69705结果判断阴阴性性管管为为（-）；阳阳性性管管为为（+），说说明明实实验验成成功功，样样品品检检查查结结果果如如何何则则看看2支支样样品品管管。凡凡样样品品管管两两支支均均为为（-），则则样样品品检检查查符符合合规规定定；如如两两支支样样品品管管中中有有任任何何一一管管出出现现（+），则则样品检查样品检查不符合规定不符合规定。71三、鲎试剂的灵敏度复核鲎试剂的灵敏度复核：鲎鲎试试剂剂灵灵敏敏度度复复核核试试验验当当使使用用新新批批号号的的鲎鲎试试剂剂或或试试验验条条件件发发生生了了任任何何可可能能影影响响检检验验结结果果的的改改变变时时，应应进进行行鲎鲎试剂灵敏度复核试验。试剂灵敏度复核试验。72鲎试剂的灵敏度复核设计鲎试剂的灵敏度复核设计编编号号 内毒素浓度内毒素浓度/配配 制液制液稀释用稀释用液液 稀释稀释倍数倍数 内浓内浓度度度度 管管数数 12/检查用水检查用水/检查水检查水1242214340.54480.2545无无/检查用水检查用水-2731、目目的的是是复复核核鲎鲎试试剂剂的的灵灵敏敏度度是是否否符符合合要要求求。（是是否否与与其其标标示示的的灵灵敏敏度度相相符符合合）。取取待待复复鲎鲎试试剂剂20支支(灵灵 敏敏 度度 为为 0.25EU/ml)，各各 加加 水水0.1ml溶溶解解备备用用；用用内内毒毒素素工工作作标标准品来复核。内毒素稀释如下：准品来复核。内毒素稀释如下：742、内毒素的溶解稀释：内毒素的溶解稀释：取内毒素取内毒素1支（例支（例如其规格为如其规格为70EU/支），先加支），先加1ml水，混水，混合合15分钟（浓度为分钟（浓度为70EU/ml），），稀释稀释10倍（倍（7EU/ml）,再稀释再稀释7倍（倍（1EU/ml）,再稀释再稀释2倍（倍（0.5EU/ml）,再稀释再稀释2倍（倍（0.25EU/ml）,再稀释再稀释2倍（倍（0.125EU/ml）,再稀释再稀释2倍（倍（0.0625EU/ml）,7576773、具本操作：、具本操作：取待复鲎试剂取待复鲎试剂18支；并取浓度为鲎试支；并取浓度为鲎试剂灵敏度的：剂灵敏度的：2 、0.5、0.250.25四个内毒素浓度系列，即内毒素浓度四个内毒素浓度系列，即内毒素浓度为为0.50.5、0.250.25、0.1250.125、0.0625EU/0.0625EU/ml的的四个系列，每个系列各取鲎试剂四个系列，每个系列各取鲎试剂4支，支，各加对应浓度的内毒素各加对应浓度的内毒素0.1ml,另另2支鲎支鲎试剂各加水试剂各加水0.1ml作为阴性对照。封口，作为阴性对照。封口，37度度60分钟。观察结果，计算灵敏度分钟。观察结果，计算灵敏度复核值。复核值。7879阴性为阴性为-，2倍系列全为倍系列全为+，0.25倍系列全为倍系列全为-，复核实验成功。，复核实验成功。800.25倍系列不全为倍系列不全为-，复核实验也不成功。，复核实验也不成功。814、灵敏度复核值CC计算C C=lg=lg-1-1(X/4)(X/4)X X为反应终点内毒素浓度的对数值为反应终点内毒素浓度的对数值C C应为标示灵敏度应为标示灵敏度的的0.5-20.5-2倍倍（即（即0.5 -2),0.5 -2),认为该试剂灵认为该试剂灵敏度符合规定，但使用时仍以标示敏度符合规定，但使用时仍以标示灵敏度为准。灵敏度为准。82C C=lg=lg-1-1(X/4)=lg(X/4)=lg-1-1（lg0.25+lg0.25+lg0.25+lg0.25+lg0.25+lg0.25)/4=lg0.25+lg0.25)/4=lglg-1(-0.602)-1(-0.602)=10=10-0.6020.602=0.25EU/ml=0.25EU/ml（0.125-0.50EU/ml)0.125-0.50EU/ml)83C C=lg=lg-1-1（lg0.125+lg0.125+lg0.25+lg0.25)/4lg0.125+lg0.125+lg0.25+lg0.25)/4=lglg-1(-0.752)=10-1(-0.752)=10-0.7520.752=0.177EU/ml=0.177EU/ml（0.125-0.50EU/ml)0.125-0.50EU/ml)84C C=0.50EU/ml(0.125-0.5)=0.50EU/ml(0.125-0.5)85C C=lg=lg-1-1（lg0.25+lg0.5+lg0.25+lg0.25)/4lg0.25+lg0.5+lg0.25+lg0.25)/4=lglg-1(-0.527)=10-1(-0.527)=10-0.5270.527=0.297EU/ml=0.297EU/ml（0.125-0.50EU/ml)0.125-0.50EU/ml)86四、干扰试验什么时候做干扰试验？什么时候做干扰试验？当当进进行行新新药药的的内内毒毒素素检检查查试试验验前前，或或无无内内毒毒素素检检查查项项的的品品种种建建立立内内毒毒素检查法时，须进行干扰试验。素检查法时，须进行干扰试验。当当鲎鲎试试剂剂、供供试试品品的的配配方方、生生产产工工艺艺改改变变或或试试验验环环境境中中发发生生了了任任何何有有可可能能影影响响试试验验结结果果的的变变化化时时，须须重重新进行干扰试验。新进行干扰试验。871、目目的的：是是为为了了排排除除样样品品可可能能存存在在的的对对鲎鲎试试剂剂凝凝胶胶反反应应的的增增强强或或抑抑制制作作用。用。2、干干扰扰试试验验的的方方法法：就就是是在在供供试试品品存存在在的的情情况况下下，测测定定鲎鲎试试剂剂的的灵灵敏敏度度是是否否符符合合规规定定，来来判判断断供供试试品品是是否否存存在在干干扰扰的的一一种种方方法法。即即如如灵灵敏敏度度符符合合规规定定-说说明明供供试试品品无无干干扰扰作作用用；如如灵灵敏敏度度不不符符合合规规定定-说说明明供供试试品品存在干扰作用。存在干扰作用。88干扰试验预试验干扰试验预试验取取 1批批 经经 热热 原原 测测 定定 合合 格格 的的 样样 品品（L=15EU/ml），用用BET水水将将其其作作30、60、120、240、480倍倍稀稀释释，并并以以此此溶溶液液来来溶溶解解和和稀稀释释内内毒毒素素，使使每每个个稀稀释释度度中中内内毒毒素素的的含含量量均均为为2，与与灵灵敏敏度度为为0.5EU/ml的的TAL进进行行反反应。应。89表表1预试验结果：预试验结果：TAL批号批号020819=0.5EU/ml稀释稀释倍数倍数30601202404802 +样品样品+-+无内无内毒素毒素样品样品-90编号编号 内毒素浓度内毒素浓度/配配 制液制液稀释用稀释用液液 稀释稀释倍数倍数 内浓内浓度度度度 管管数数 A无无/供试品溶液供试品溶液-2B2/供试品溶液供试品溶液 供试品溶液供试品溶液12421440.5480.254C2/检查用水检查用水检查水检查水12421440.5480.254D无无/检查用水检查用水-291操操作作步步骤骤：先先将将样样品品按按前前法法稀稀释释成成供供试试液液（鲎试剂仍以灵敏度为（鲎试剂仍以灵敏度为0.25EU/m为例）为例）A：以以供供试试液液来来溶溶解解和和稀稀释释内内毒毒素素成成每每1ml中中含含0.50、.25、0.125、0.062EU的的内内毒毒素素溶溶液液，以以下下同同灵灵敏敏度度复复核核。此此为为药药典典方方法。法。B：以以二二倍倍浓浓的的供供试试品品液液和和二二倍倍浓浓的的内内毒毒素素溶溶液液两两两两对对半半稀稀释释，最最终终使使含含内内毒毒素素为为l每每1ml中中含含0.50、.25、0.125、0.062EU的的内内毒毒素素溶溶液液，以以下下同同灵灵敏敏度度复复核核。此此为为药药典方法典方法。92C：以以供供试试液液来来溶溶解解鲎鲎试试剂剂，内内毒毒素素仍仍以以水水来来溶溶解解和和稀稀释释，下下面面操操作作同同鲎鲎试试剂剂灵灵敏度复核。敏度复核。例：注射用头孢拉定的干扰试验例：注射用头孢拉定的干扰试验注注射射用用头头孢孢拉拉定定 规规格格：0.5g/瓶瓶，内内毒毒素素限限值值为为0.20EU/mg,所所用用鲎鲎试试剂剂灵灵敏敏度为度为0.25EU/ml1、供供试试液液的的制制备备：取取1瓶瓶加加水水5ml溶溶解解（100 mg/ml）,该该溶溶液液的的内内毒毒素素限限值值L=20EU/ml，再再稀稀释释80倍倍（最最大大有有效效稀稀释倍数），即为供试液。释倍数），即为供试液。932、内内毒毒素素的的稀稀释释：同同灵灵敏敏度度复复核核项项下同样操作。下同样操作。3、具具 体体 操操 作作：取取 鲎鲎 试试 剂剂 18支支（0.1ml/支支，0.25EU/ml），各各加加供供试试液液0.1ml使使溶溶解解，放放置置5分分钟钟，以以四四支支为为一一组组，分分别别依依次次加加入入0.5、0.25、0.125、0.062EU/ml的的内内毒毒素素和和水水0.1ml,轻轻轻轻混混合合，置置水水浴浴60分分钟钟，观观察察结结果果，计计算算灵灵敏敏度度，看看此此灵灵敏敏度是否在度是否在0.52范围内。范围内。94C C=lg=lg-1-1（lg0.25+lg0.5+lg0.25+lg0.25)/4lg0.25+lg0.5+lg0.25+lg0.25)/4=lglg-1(-0.527)=10-1(-0.527)=10-0.5270.527=0.297EU/ml=0.297EU/ml（0.125-0.50EU/ml)0.125-0.50EU/ml)955、凝胶半定量试验（新增内容）本方法系通过确定本方法系通过确定反应反应终点浓度来终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。依表量化供试品中内毒素的含量。依表3制备溶液制备溶液A、B、C和和D。按鲎试剂灵。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。敏度复核试验项下操作。96编号编号 内毒素浓度内毒素浓度/配配 制液制液稀释用稀释用液液 稀释稀释倍数倍数 内浓内浓度度度度 管管数数 A无无/供试品溶液供试品溶液 检查水检查水1-22-24-28-2B2/供试品溶液供试品溶液 供试品溶液供试品溶液122C2/检查用水检查用水检查水检查水12221240.5280.252D无无/检查用水检查用水-297注注A：没没有有超超过过MVD并并且且通通过过干干扰扰试试验验的的供供试试品品溶溶液液。用用检检查查用用水水进进行行2倍倍系系列列稀稀释释，从从通通过过干干扰扰试试验验的的稀稀释释倍倍数数开开始始再再稀稀释释至至1倍倍、2倍倍、4倍倍和和8倍，但随后的稀释也不得超过倍，但随后的稀释也不得超过MVD。B：含含2浓浓度度标标准准内内毒毒素素的的溶溶液液A（供试品阳性对照）。（供试品阳性对照）。C：含含2、1、0.5和和0.25浓浓度度标标准内毒素的检查用水系列。准内毒素的检查用水系列。D：阴性对照。：阴性对照。98结结果果判判断断 若若阴阴性性对对照照溶溶液液D的的平平行行管管均均为为阴阴性性，供供试试品品阳阳性性对对照照溶溶液液B的的平平行行管管均均为为阳阳性性，系系列列溶溶液液C的的反反应应终终点点浓浓度度的的几几何何平平均均值值在在0.52之间，试验有效。之间，试验有效。99系系列列溶溶液液A中中每每一一系系列列平平行行管管的的终终点点稀稀释释倍倍数数乘乘以以，为为每每个个系系列列的的反反应应终终点点浓浓度度，所所有有平平行行管管反反应应终终点点浓浓度度的的几几何何平平均均值值即即为为供供试试品品溶溶液液的的内内毒毒素素浓浓度度（按按公公式式CE=lg-1（X/2）。如如果果检检验验时时采采用用的的是是供供试试品品的的稀稀释释液液，则则计计算算原原始始溶溶液液内内毒毒素素浓浓度度时时要要将将结结果乘上稀释倍数。果乘上稀释倍数。100编编号号 内毒素浓度内毒素浓度/配配 制液制液稀释用稀释用液液 稀释稀释倍数倍数 内浓内浓度度度度 管管数数 结结果果A无无/供试品溶液供试品溶液 检查水检查水1-2+2-2+4-2-8-2-B2/供试品溶液供试品溶液 供试品溶液供试品溶液122+C2/检查用水检查用水检查水检查水122+212+40.52-80.252-D无无/检查用水检查用水-2-101如为葡萄糖注射液。如为葡萄糖注射液。其其L=0.5EUml/ML,如实验选用鲎试剂如实验选用鲎试剂=0.5EUml/ML,则其内毒素含量为则其内毒素含量为0.5X2=1.0EUml/ML,不符合规定。不符合规定。如鲎试剂如鲎试剂=0.06EUml/ML,则其内毒素含量为则其内毒素含量为0.06X2=0.12EUml/ML,符合规定。符合规定。102如如试试验验中中供供试试品品溶溶液液的的结结果果都都为为阴阴性性，应应记记为为内内毒毒素素浓浓度度小小于于（如如果果检检验验的的是是稀稀释释过过的的供供试试品品，则则记记录录为为小小于于乘乘以以该该供供试试品品的的最最低低稀稀释释倍倍数数）。如如果果结结果果都都为为阳阳性性，应应记记为为内内毒毒素素的的浓浓度度大大于于或等于最大的稀释倍数乘以或等于最大的稀释倍数乘以。若若内内毒毒素素浓浓度度小小于于规规定定的的限限值值，判判供供试试品品符符合合规规定定。若若内内毒毒素素浓浓度度大大于于或或等等于于规定的限值，判供试品不符合规定。规定的限值，判供试品不符合规定。103比浊法比浊法光度测定法（定量法）光度测定法（定量法）比色法比色法动态比浊法动态比浊法终点比浊法终点比浊法动态比色法动态比色法终点比色法终点比色法6、细菌内毒素光度测定法分类细菌内毒素光度测定法分类A&C104光光度度测测定定试试验验应应在在特特定定的的仪仪器器中中进行，温度一般为进行，温度一般为371。浊度法系利用检测鲎试剂与内毒浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中素反应过程中的的浊度变化而测定浊度变化而测定内毒素含量的方法。内毒素含量的方法。根据检测原理，可分为终点浊度根据检测原理，可分为终点浊度法和动态浊度法。法和动态浊度法。105终点浊度法是依据反应混合物中的终点浊度法是依据反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时的浊内毒素浓度和其在孵育终止时的浊度（吸光度或透光率）之间存在着度（吸光度或透光率）之间存在着量化关系来测定内毒素含量的方法。量化关系来测定内毒素含量的方法。动态浊度法是检测反应混合物的浊动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。速度的方法。106显色基质法系利用鲎试剂与内显色基质法系利用鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶毒素反应过程中产生的凝固酶使特使特定定底物释放出底物释放出呈呈色团的多色团的多少而测定内毒素含量的方法。少而测定内毒素含量的方法。根据检测原理，分为终点显色根据检测原理，分为终点显色法和动态显色法。法和动态显色法。107终终点点显显色色法法是是依依据据反反应应混混合合物物中中内内毒毒素素浓浓度度和和其其在在孵孵育育终终止止时时释释放放出出的的呈呈色色团团的的量量之之间间存存在在的的量量化化关关系系来测定内毒素含量的方法。来测定内毒素含量的方法。动动态态显显色色法法是是检检测测反反应应混混合合物物的的色色度度达达到到某某一一预预先先设设定定的的吸吸光光度度所所需需要要的的反反应应时时间间，或或检检测测色色度度增增长长速速度的方法。度的方法。108 根根据据凝凝胶胶反反应应在在到到达达预预设设的的吸吸光光度度变变化化值值时时所所需需的的反反应应时时间间对对数数值值（lgTg）与与细细菌菌内内毒毒素素浓浓度度对对数数值值（lgC）成成反反比比的的关关系系，进行定量测定细菌内毒素的方法。进行定量测定细菌内毒素的方法。动态比浊法动态比浊法A&C109T1T2T3OD反应时间预设OD变化值C1C2C3动态比浊法原理动态比浊法原理A&C110C1T1C2C3T2T3Lg（反应时间)Lg（内毒素浓度)LgT-LgC（Lg C1,LgT1)（Lg C2,LgT2)（Lg C3,LgT3)动态比浊法标准曲线动态比浊法标准曲线A&C111CxTx样品内毒素含量的测定样品内毒素含量的测定A&COD反应时间预设OD变化值112Lg（反应时间（反应时间)Lg（内毒素浓度（内毒素浓度)LgT Tx xLgC Cx x已知已知Tx,求得求得Cx样品内毒素含量的测定样品内毒素含量的测定A&C113ATI系列动态试管仪是世界上第一台动态试管仪的系列动态试管仪是世界上第一台动态试管仪的生产商生产商英国莱伯金耐特公司（英国莱伯金耐特公司（LabKineticsLtd）最新一代的产品。）最新一代的产品。英国Lab Kinetics 公司 ATi-320动态试管仪,32孔，可变波长定量检测法的相关仪器定量检测法的相关仪器A&C114美国Charles River Endosafe 内毒素全自动测定系统美国 Charles River Endosafe 恒温酶标测定仪,使用96孔酶标板定量检测法的相关仪器定量检测法的相关仪器A&C115定量检测法的相关仪器定量检测法的相关仪器日本和光纯药株式会社Toxinometer美国Bio-Tek Elx808IUA&C116细细菌菌内内毒毒素素检检查查用用水水：中中国国药药典典20052005年年版版规规定定定定量量测测定定用用的的细细菌菌内内毒毒素素检检查查 用用 水水，含含 内内 毒毒 素素 的的 量量 应应 小小 于于0.005EU/ml。内内毒毒素素国国家家标标准准品品（RSERSE）或或内内毒毒素素工作标准品（工作标准品（CSECSE）定定量量鲎鲎试试剂剂（TALTAL或或LALLAL）：动动态态浊浊度度法（法（KTAKTA）定量检测法的专用试剂定量检测法的专用试剂A&C117定量检测的有效性试验定量检测的有效性试验“为保证浊度和显色试验的精确性和有效性，为保证浊度和显色试验的精确性和有效性，需要进行预试验来证实标准曲线的可靠性和需要进行预试验来证实标准曲线的可靠性和供试品溶液对反应没有干扰作用。当任何可供试品溶液对反应没有干扰作用。当任何可能影响试验结果的条件改变时，要求对试验能影响试验结果的条件改变时，要求对试验方法重新验证。方法重新验证。”v标准曲线的可靠性试验v供试品干扰试验A&C118内毒素：内毒素：鲎试剂：鲎试剂：内毒素测定仪：内毒素测定仪：预热预热复溶复溶反应管，每个浓度平行三管反应管，每个浓度平行三管插入反应管插入反应管混匀混匀稀稀释释为为至至少少3个个等等比比系系列列稀稀释释液液，稀稀释释度度为为210倍倍（如如4、2、或或100100、1010、稀稀释释液液，为为最低浓度）最低浓度）结果判断及数据处理结果判断及数据处理复溶复溶动态比浊法标准曲线的制备动态比浊法标准曲线的制备A&C119标准曲线的可靠性标准曲线的可靠性v阴阴性性对对照照最最低低内内毒毒素素浓浓度度，则则实实验有效；验有效；v标准曲线的相关系数标准曲线的相关系数|r|0.980;|r|0.980;v变异系数：建议变异系数：建议CV10%。A&C120动态浊度法定量检测动态浊度法定量检测生脉注射液中的细菌内毒素生脉注射液中的细菌内毒素SI的的L为为:K/M=5.0EUml-1。表表1标准曲线的可靠性（标准曲线的可靠性（n=3）：lgT=2.7212-0.33776gC,r=-0.9991（.98）121内毒素浓度内毒素浓度 (EUml-1)平均反应时平均反应时间间(S)RSD%阴性对照阴性对照360002.04240.3340.258110.1740.0317500.929122定量检测的试验程序定量检测的试验程序1.1.试验准备：试剂、仪器及用具等试验准备：试剂、仪器及用具等；2.2.确定药品的细菌内毒素限值（确定药品的细菌内毒素限值（L）；3.3.选择定量鲎试剂选择定量鲎试剂；4.计计算算供供试试品品的的最最大大有有效效稀稀释释（MVD）或或最最低低有有效效浓浓度度（MVC）；）；5.5.标准曲线的可靠性试验标准曲线的可靠性试验；6.6.药品与鲎试剂相容性的初筛试验药品与鲎试剂相容性的初筛试验；7.7.供试品干扰试验及验证供试品干扰试验及验证；8.8.供试品日常的内毒素定量检查供试品日常的内毒素定量检查；A&C123干扰试验（n=2）样品稀样品稀释倍数释倍数 Ai(EUml-1)Bi(EUml-1)回收率回收率%200.03 0.506202.4400.03 0.647258.8800.03 0.477190.81600.03 0.367146.8124表3SI内毒素检查结果批号批号 Ai液液(EUml-1)Bi液液(EUml-1)回收回收率率(%)含内含内毒素毒素(EUml-1)0.03 0.367146.84.80.03 0.351140.44.80.03 0.340136.04.8125器具分类器具分类器器具具名名称称反应试管反应试管玻璃试管（外径玻璃试管（外径875m