实验三酵母核糖核酸(RNA)的提取

实 验 三 酵 母 菌 RNA的 提 取 、 鉴 定 及定 量 测 定 一 、 实 验 目 的掌 握 稀 碱 （ NaOH） 法 分 离 酵 母 RNA的 原 理 与 方法 了 解 RNA的 组 分 并 掌 握 定 性 鉴 定 的 具 体 方 法 。 二 、 实 验 原 理 （ 一 ） 目 前 常 用 的 RNA的 制 备 方 法 浓 盐 法 ： 是 用 高 浓 度 盐 溶 液 处 理 ， 同 时 加 热 ， 以 改 变 细 胞 壁的 通 透 性 ， 使 核 酸 从 细 胞 内 释 放 出 来 。 成 本 低 、 适 于 大 规 模操 作 。 稀 碱 法 : 是 用 氢 氧 化 钠 使 酵 母 细 胞 壁 变 性 、 裂 解 ， 然 后 用 酸中 和 ， 除 去 蛋 白 质 和 菌 体 后 的 上 清 液 用 乙 醇 沉 淀 RNA。 提 取 的RNA有 不 同 程 度 的 降 解 。 稀 碱 法 的 提 取 时 间 短 ， 提 取 率 高 于 浓盐 法 ， 更 利 于 工 业 化 生 产 （ 二 ） 实 验 材 料 的 选 择 酵 母 细 胞 富 含 核 酸 ， 且 核 酸 主 要 是 RNA，含 量 为 干 菌 体 的 2.67%-10.0%， 而 DNA含 量较 少 ， 仅 为 0.03%-0.516%。 为 此 提 取 RNA多 以 酵 母 为 原 料 。 （ 三 ） RNA的 化 学 组 成 的 鉴 定 （ 1） 嘌 呤 碱 鉴 定 ： 与 硝 酸 银 作 用 产 生 白 色的 嘌 呤 银 化 合 物 沉 淀 。 （ 2） 核 糖 的 鉴 定 ： 地 衣 酚 （ 3,5 二 羟 甲苯 试 剂 ） 显 色 法 （ 3） 磷 酸 的 鉴 定 ： 与 钼 酸 铵 试 剂 作 用 产 生黄 色 的 磷 钼 酸 铵 沉 淀 (NH4)3PO412MoO3 。 （ 4） 脱 氧 核 糖 的 鉴 定 ： 与 二 苯 胺 试 剂 反 应生 成 蓝 灰 色 沉 淀 ， 如 没 有 沉 淀 产 生 ， 说 明没 有 DNA. 1. 干 酵 母 粉 。2 0.04mol氢 氧 化 钠 溶 液 。 3 乙 酸 。 4 95 乙 醇 。 5 5 硫 酸 。6. 浓 氨 水 。 7. 50g/L硝 酸 银 溶 液 。 8 地 衣 酚 （ 3,5二 羟 甲 苯 试 剂 ） ： 取 比 重1.19HCl 100ml， 加 入 FeCl36H20 100mg及 二 羟 甲苯 100mg， 混 匀 溶 解 后 ， 置 于 棕 色 瓶 中 ， 此 试 剂 必须 在 临 用 前 新 鲜 配 制 。 市 售 的 3,5二 羟 甲 苯 不 能使 用 ， 必 须 用 苯 纯 化 结 晶 l 2次 ， 并 用 活 性 炭 脱色 方 可 使 用 。 9 定 磷 试 剂 ： 2.5 钼 酸 铵 溶 液 ： 20ml水 溶 解 2.5克 钼 酸 铵 ， 加 5mol L H2S0430ml， 用 水 稀 释 至l00ml， 此 试 剂 可 在 冷 处 保 存 一 月 不 变 质 。 10. 10 抗 坏 血 酸 (Vc)溶 液 ： 10g抗 坏 血 酸 溶 于100ml水 。 贮 棕 色 瓶 中 。 溶 液 呈 淡 黄 色 尚 可 用 ，如 呈 深 黄 色 即 失 效 。 11 二 苯 胺 试 剂 ： 称 取 1.5g二 苯 胺 （ 如 不 纯 ，须 在 70 乙 醇 中 重 结 晶 2次 ） ， 溶 于 100ml冰 醋 酸（ AR） 中 ， 再 加 入 浓 H2SO41.5ml， 摇 匀 ， 贮 在棕 色 瓶 中 放 冰 箱 内 保 存 备 用 。 12 沉 淀 剂 (钼 酸 铵 过 氯 酸 试 剂 )： 0.25 钼 酸铵 溶 于 2.5 过 氯 酸 中 。 如 配 200ml， 即 在 193ml水 中 加 入 7m170 过 氯 酸 和 0.5g钼 酸 铵 。 1.核 酸 的 提 取 ： 每 二 人 用 大 试 管 取 1g干 酵 母 ,加 入 0.05mol NaOH溶 液 5ml提 取 ， 放 入 试 管 沸水 浴 加 热 30分 钟 ， 并 经 常 搅 拌 。 待 冷 却 后 加 入 乙 酸 5 8滴 ， 使 提 取 液 呈 酸 性(石 蕊 试 纸 )， 移 在 离 心 管 里 ， 离 心 10分 钟(3500转 分 )。 将 上 清 液 倒 入 另 一 离 心 管 中 ， 加 入 95 乙 醇2ml， 边 加 边 搅 。 加 毕 ， 离 心 10分 钟 ， 即 可 得到 核 酸 钠 的 白 色 沉 淀 。 2.核 酸 的 水 解 ： 在 含 有 核 酸 钠 的 离 心 管中 加 入 5 硫 酸 2ml， 用 玻 棒 搅 匀 ， 沸 水浴 煮 10分 钟 。 其 中 1ml水 解 液 放 进 EP管 里 ， 贴 好 标 签 冷冻 保 存 （ 下 次 试 验 用 ） 3.核 酸 的 鉴 定 取 水 解 液 ， 按 下 表 所 列 程 序 分 别 鉴 定核 酸 的 嘌 呤 碱 、 磷 酸 及 核 糖 和 脱 氧 核 糖 。 1.嘌 呤 碱 的 鉴 定 ： 取 试 管 两 只 ， 分 别 标 明 测 定 管与 对 照 管 ， 依 次 加 入 下 列 各 试 剂 。管 号 RNA水 解 液 5 H2SO4 浓 氨 水 50g L AgNO3测 定 管 0.2ml 不 加 5滴 使 成 碱 性 5滴对 照 管 不 加 0.2ml 5滴 使 成 碱 性 5滴注 ： 加 浓 氨 水 使 呈 碱 性 可 用 pH 试 纸 检 定 。加 入 AgNO 3后 ， 观 察 有 何 变 化 。 静 置 15分 钟 后 ， 再 比 较 两 管 中 之 沉淀 。 2.磷 酸 的 鉴 定 ： 取 试 管 两 只 ， 分 别 标 明 测定 管 与 对 照 管 ， 然 后 依 次 加 入 下 列 各 试 剂 ：管 号 RNA水 解 液 5 H2SO4 钼 酸 铵 试 剂 VC测 定 管 0.2ml 不 加 5滴 5滴对 照 管 不 加 0.2ml 5滴 5滴放 置 数 分 钟 ， 观 察 两 管 颜 色 有 何 不 同 。磷 酸 +钼 酸 铵 磷 钼 酸 +Vc钼 蓝 3.核 糖 的 鉴 定 ： 取 试 管 两 只 ， 分 别 标 明 测 定 管 与对 照 管 ， 然 后 依 次 加 入 下 列 各 试 剂 。管 号 RNA水 解 液 5 H2SO4 3， 5-二 羟 甲 苯 测 定 管 4滴 不 加 6滴对 照 管 不 加 4滴 6滴将 两 试 管 放 入 沸 水 浴 内 加 热 10分 钟 ， 比 较 两 管 之 颜 色 。 4.脱 氧 核 糖 的 鉴 定 ： 取 两 试 管 分 别 标 明 测 定 管 与对 照 管 ， 然 后 依 次 加 入 下 列 各 试 剂 。管 号 RNA水 解 液 5 H2SO4 二 苯 胺 测 定 管 4滴 不 加 6滴对 照 管 不 加 4滴 6滴 将 两 试 管 同 时 放 入 沸 水 浴 内 ， 加 热 10分 钟 后 ， 比 较 两管 之 颜 色 。 1.核 酸 的 溶 解 性 质 是 什 么 ?常 用 什 么 试 剂分 离 沉 淀 核 酸 ? 2.为 什 么 用 酵 母 作 为 实 验 原 料 ？ 如 何 使RNA从 酵 母 中 释 放 出 来 ？ 3.破 酵 母 细 胞 时 为 什 么 要 在 沸 水 浴 中 进 行 ? 核 酸 及 其 衍 生 物 ， 核 苷酸 、 核 苷 、 嘌 呤 和 嘧 啶 有吸 收 UV的 性 质 ， 其 吸 收 高峰 在 260nm波 长 处 。 测 得未 知 浓 度 核 酸 溶 液 的A260nm值 ， 即 可 以 计 算 出其 中 RNA或 DNA的 含 量 。 该法 操 作 简 便 ， 迅 速 ， 并 对被 测 样 品 无 损 ， 用 量 也 少 。 钼 酸 铵 过 氯 酸 沉 淀 剂 ： 取 3.6ml 70%过 氯 酸 和0.25g钼 酸 铵 溶 于 96.4ml蒸 馏 水 中 ， 即 成 0.25%钼 酸 铵 2.5%过 氯 酸 溶 液 。 （ 1） 取 0.5ml未 知 浓 度 的 RNA溶 液 （ 上 次 实 验 提取 ） ， 用 蒸 馏 水 稀 释 至 50ml， 此 为 A液 。 （ 2） 取 A液 2ml， 再 稀 释 至 50ml， 为 B液 。 （ 3） 另 取 4ml A液 ， 加 1ml沉 淀 剂 ， 摇 匀 后 置 冰 水中 20分 钟 ， 离 心 （ 3500rpm/min， 10分 钟 ） ， 取 上清 液 2.5ml， 稀 释 至 50ml， 此 为 C液 。 沉 淀 剂 的 作 用 是 ， 使 RNA沉 淀 析 出 ， 得 到 不 含 RNA的 对 照 液 。 （ 4） 分 别 取 B， C液 于 厚 度 为 1cm的 石 英 比 色 杯 ，在 260nm波 长 处 测 定 A值 。 式 中 A260为 B管 稀 释 液 在 260nm波 长 处 A值 减 去 C管 稀 释液 在 260nm波 长 处 A值 。 N为 稀 释 倍 数 .0.024（ 或 0.020） 表 示 1mg/ml RNA（ 或 DNA） 溶 液 测 定 的A260值 相 当 于 0.024。 此 为 多 次 试 验 验 证 的 数 值 。260RNA DNA 0.024( 0.020)A NL 或 浓 度 或计 算 1000 1.核 酸 的 溶 解 性 质 是 什 么 ?常 用 什 么 试 剂分 离 沉 淀 核 酸 ? 2.为 什 么 用 酵 母 作 为 实 验 原 料 ？ 如 何 使RNA从 酵 母 中 释 放 出 来 ？ 3.破 酵 母 细 胞 时 为 什 么 要 在 沸 水 浴 中 进 行 ? 一 、 实 验 目 的学 习 米 氏 常 数 的 测 定 方 法 。 二 、 实 验 原 理米 氏 常 数 的 测 定 ： 双 倒 数 作 图 法 （ Lineweaver-Burk法 ） 1 Km 1 1 = . + v Vmax S Vmax 二 、 实 验 原 理 本 实 验 测 定 红 细 胞 中 过 氧 化 氢 酶 的 米 氏 常 数 。 过 氧 化 氢 酶(CAT)催 化 下 列 反 应 ： 2H2O2 CAT 2H2O+O2 H2O2浓 度 可 用 KMnO4在 硫 酸 存 在 下 滴 定 测 知 。 2KMnO4 5H2O2 3H2SO4 - 2MnSO4 K2SO4 5O2 8H2O 求 出 反 应 前 后 H 2O2的 浓 度 差 即 为 反 应 速 度 。 作 图 求 出 过氧 化 氢 酶 的 米 氏 常 数 。 1 0.05mol/L草 酸 钠 标 准 液 将 草 酸 钠 （ AR） 于 100 105 烘12h。 冷 却 后 ， 准 确 称 取 0.67g， 用 水 溶 解 倒 入 100ml量 瓶 中 ，加 入 浓 H2SO4 5ml， 加 蒸 馏 水 至 刻 度 ， 充 分 混 匀 ， 此 液 可 贮 存 数周 。 2 约 0.02ml KMnO4储 存 液 称 取 KMnO4 3.5g， 溶 于 1000ml蒸 馏水 中 ， 加 热 搅 拌 ， 待 全 部 溶 解 后 ， 用 表 面 皿 盖 住 ， 在 低 于 沸 点温 度 上 加 热 数 小 时 ， 冷 后 放 置 过 夜 ， 玻 璃 丝 过 滤 ， 棕 色 瓶 内 保存 。 3 0.004mol/L KMnO4应 用 液 取 0.05mol/L草 酸 钠 标 准 液 20ml，于 锥 形 瓶 中 ， 加 浓 H2SO4 4ml， 于 70 水 浴 中 用 KMnO4贮 存 液 滴定 至 微 红 色 ， 根 据 滴 定 结 果 算 出 KMnO4贮 存 液 的 标 准 浓 度 ， 稀释 成 0.004mol/L， 每 次 稀 释 都 必 须 重 新 标 定 储 存 液 。 4 约 0.08mol/L H 2O2液 取 20%H2O2（ AR） 40ml于 1000.0ml量 瓶中 ， 加 蒸 馏 水 至 刻 度 ， 临 用 时 用 0.004mol/L KMnO4标 定 之 ， 稀释 至 所 需 浓 度 。 5 0.2mol/L磷 酸 盐 缓 冲 液 （ pH7.0） 。 l 血 液 稀 释 ： 吸 取 新 鲜 （ 或 肝 素 抗 凝 ）血 液 0.1ml， 用 蒸 馏 水 稀 释 至 10ml， 混 匀 。 取此 稀 释 血 液 1.0ml， 用 磷 酸 盐 缓 冲 液 (pH7.0，0.2mol/L)稀 释 至 10ml， 得 1： 1000稀 释 血 液 。 2 H2O2浓 度 的 标 定 ： 取 洁 净 锥 形 瓶 两 只 ， 加浓 度 约 为 0.08mol/L的 H2O2 2.0ml和 25%H2SO4 2.0ml， 分 别 用 0.004mol/L KMnO4滴 定 至 微 红色 。 从 滴 定 用 去 KMnO4 ml数 ， 求 出 H2O2的 mol浓 度 。 3 反 应 速 度 的 测 定 ： 取 干 燥 洁 净 50ml锥 形 瓶 5只 ，编 号 ， 按 下 表 操 作 。将 各 瓶 置 37 水 浴 预 热 5min， 依 次 加 入 1： 1000稀 释 血 液 每 瓶0.5ml， 边 加 边 摇 ， 继 续 保 温 准 5min， 按 顺 序 向 各 瓶 加25%H 2SO4 2.0ml， 边 加 边 摇 ， 使 酶 促 反 应 立 即 终 止 。最 后 用 0.004mol/L KMnO4滴 定 各 瓶 至 微 红 色 ,记 录 KMnO4消 耗 量(ml)。加 入 物 (ml) 1 2 3 4 5H2O2(约 0.08mol/L) 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50蒸 馏 水 3.0 2.50 2.00 1.50 1.00 五 、 计 算1 （ 式 中 ： 4为 反 应 液 量 4ml）2 反 应 速 度 的 计 算 ： 以 反 应 消 耗 的 H2O2 mmol数 表 示 。反 应 速 度 =加 入 的 H2O2 mmol数 剩 余 的 H2O2 mmol数剩 余 的 H2O2 mmol数 ： KMnO4 0.005 mol/L 消 耗 的 KMnO4毫 升 数 5/2（ 式 中 ： 5/2为 KMnO4与 H2O2反 应 中 mol换 算 系 数 ）3 求 Km值 ： 实 验 测 得 的 结 果 ， 以 1/v对 1/S作 图 ， 求 出 V和 Km的 数 值 。 4 mlOHmol OH(mol/L)OH 222222 数加 入浓 度浓 度反 应 瓶 中 反 应 速 度 v= 一 剩 余 H2O2mmol= 0.005 5/2 酶 作 用 后 ， KMnO4滴 定 ml 底 物 浓 度 S = 4 加 人 H2O2mmol= 标 定 浓 度 2.502.001.501.000.50 加 人 H2O2 ml 数 54321计 算 程 序 反 应 速 度 一 剩 余 酶 作 用 后 ， 滴 定 底 物 浓 度 加 人 标 定 浓 度 加 人 数 计 算 程 序 .004 一 、 实 验 目 的 1. 学 习 并 掌 握 定 量 测 量 维 生 素 C的 原理 和 方 法 。 2. 熟 练 微 量 滴 定 法 的 基 本 操 作 。 二 、 实 验 原 理 维 生 素 C是 人 类 营 养 中 最 重 要 的 维 生 素 之 一 ， 根 据 它 具 有 的 还原 性 质 可 以 测 定 维 生 素 C的 含 量 。 常 用 的 测 定 方 法 有 （ 1） 2， 6-DCPIP (Dichlorophenolindo phenol （ 还 原 型 VC） （ 2） 2， 4-二 硝 基 苯 肼 法 （ 总 VC） （ 3） 碘 酸 法 （ 4） 碘 量 法 （ 5） 荧 光 分 光 光 度 法 （ 一 ） 试 剂 及 材 料（ 1） 松 针（ 2） 酸 化 蒸 馏 水（ 3） 2， 6DCPIP； 将 50mg 2， 6DCPIP溶 解 于 约 200ml含 有 52mg碳 酸 氢 钠 的 热 水 中 。 冷 后 稀 释 至 250ml。 装 入 棕 色 瓶 内 。 放 在 冰 箱 里 保 存 。 2， 6DCPIP不 稳 定 , 每 周 必 须 重 新 配 制 ， 使 用 前需 按 照 下 法 标 定 ： 取 5ml标 准 抗 坏 血 酸 溶 液 加 5ml 1 草 酸 ， 以 2， 6DCPIP滴 定呈 粉 红 色 ， 并 在 15秒 钟 内 不 退 色 为 终 点 。 计 算 2， 6DCPIP溶 液的 浓 度 。（ 4） 标 准 抗 坏 血 酸 溶 液 ： 溶 解 100mg纯 抗 坏 血 酸 粉 状 结 晶 于 1草 酸 中 ， 然 后 稀 释 到 500ml。 使 用 前 临 时 配 制 。（ 二 ） 器 材（ 1） 锥 形 瓶 （ 50ml） （ 2） 小 研 钵 （ 3） 吸 量 管 （ 10ml） （ 4） 漏斗 （ 5） 滤 纸 （ 6） 容 量 瓶 （ 50ml） （ 7） 微 量 滴 定 管 （ 5ml） 1.准 确 称 取 松 针 约 1g。 样 品 必 须 用 温 水 洗 去 泥 土 ， 并 在 空 气 中风 干 。 放 入 研 钵 中 ， 加 1g石 英 砂 ， 再 加 酸 化 蒸 馏 水 5 10ml一 起 研 磨 。2. 离 心 （ 3500转 /分 ） 10分 钟 ， 将 上 清 液 移 入 容 量 瓶 ， 用 酸 化蒸 馏 水 定 容 至 50ml。3.取 10ml上 述 溶 液 放 入 小 锥 形 瓶 内 ， 用 微 量 滴 定 管 ， 以 2，6DCPIP（ 蓝 色 ） 滴 定 至 提 取 液 呈 现 淡 粉 红 色 ， 并 保 持 1530秒 不 褪 。 (滴 定 过 程 必 须 迅 速 ， 不 要 超 过 2min。 因 为 在 本滴 定 条 件 下 ， 一 些 非 维 生 素 C还 原 物 质 的 还 原 作 用 较 迟 缓 ，快 速 滴 定 右 以 避 免 或 减 少 它 们 的 影 响 )4.另 取 10ml酸 化 蒸 馏 水 作 空 白 对 照 滴 定 。 提 取 液 和 空 白 对 照 各 做 三 份 ， 对 结 果 取 平 均 值 进 行 计 算 式 中 ： VA为 滴 定 样 品 提 取 液 所 耗 用 的 2， 6DCPIP的 平 均 毫 升 数 ；VB为 滴 定 空 白 对 照 所 耗 用 的 2， 6DCPIP的 平 均 毫 升 数 ； C为样 品 提 取 液 的 总 毫 升 数 ； D为 滴 定 时 所 取 的 样 品 提 取 液 毫 升数 ； W为 被 检 样 品 的 质 量 。 T为 1ml标 准 0.001N 2， 6DCPIP溶液 相 当 维 生 素 C的 毫 克 数 ， T的 具 体 数 目 为 0.088mg/ml。 思 考 题为 了 准 确 测 得 维 生 素 C含 量 ， 实 验 过 程 中 都 应 注意 哪 些 操 作 步 骤 ？ 为 什 么 ？ 一 、 实 验 目 的 学 习 GOD-PAP法 测 定 血 糖 含 量 的 原理 和 方 法 。 二 、 实 验 原 理 动 物 血 液 中 的 糖 主 要 是 葡 萄 糖 ， 正 常 情 况 下 ， 其 含 量 较 恒 定 。健 康 动 物 血 糖 水 平 为 80-120mg/100ml。 GOD-PAP法 ， 即 过 氧化 物 酶 -抗 过 氧 化 物 酶 法 是 近 几 年 临 床 血 糖 定 量 测 定 的 普 遍 方法 。 该 法 测 定 血 糖 依 据 的 酶 反 应 为 ： 葡 萄 糖 +O2+H2O = 葡 萄 糖 酸 +H2O2 2H 2O2+4-氨 基 安 替 比 林 +酚 = 醌 亚 胺 +4H2O 醌 亚 胺 在 A480nm-A550nm波 长 有 最 大 吸 收 ， 所 产 生 颜 色 的 深浅 与 血 清 中 葡 萄 糖 的 量 成 正 比 。 在 同 样 条 件 下 ， 测 定 葡 萄 糖标 准 液 和 样 品 的 吸 收 值 ， 代 入 后 面 所 给 公 式 即 可 求 出 样 品 中葡 萄 糖 的 含 量 。 1.血 糖 试 剂 盒 酶 试 剂 （ GOD， PAP， 磷 酸 盐 ， 酚 ， 4-氨 基 安 替比 林 ） 100mg/dL血 糖 标 准 溶 液 2.兔 血 清 取 3只 试 管 ， 按 下 列 加 入 试 剂 空 白 标 准 样 品酶 制 剂 3.00ml 3.00ml 3.00ml蒸 馏 水 0.02ml - -葡 萄 糖 标 准 溶 液 - 0.02ml -样 品 - - 0.02ml分 别 将 各 管 溶 液 摇 匀 ， 37度 保 温 15分 钟 ， 505nm波 长 比 色 。 C样 品 = (A样 品 /A标 准 ) x C标 准 实 验 九 小 麦 萌 发 前 后 淀 粉 酶 活 力的 比 较 一 、 实 验 目 的 1 学 习 分 光 光 度 计 的 原 理 和 使 用 方 法 。 2 学 习 测 定 淀 粉 酶 活 力 的 方 法 。 3 了 解 小 麦 萌 发 前 后 淀 粉 酶 活 力 的 变 化 。 二 、 实 验 原 理 种 子 中 贮 藏 的 碳 水 化 合 物 主 要 以 淀 粉 的 形 式 存 在 。 种 子 萌 发 时 ，淀 粉 酶 活 性 随 萌 发 时 间 迅 速 增 加 ， 将 淀 粉 分 解 成 小 分 子 糖 类 ，供 幼 苗 生 长 。 淀 粉 的 水 解 产 物 麦 芽 糖 有 还 原 性 ,能 与 3,5-二 硝 基 水 杨 酸 试 剂反 应 ， 使 其 还 原 生 成 红 色 3-氨 基 -5-硝 基 水 杨 酸 。 在 一 定 范 围内 ， 其 颜 色 深 浅 与 淀 粉 酶 水 解 产 物 的 浓 度 成 正 比 ， 可 用 麦 芽 糖（ 或 葡 萄 糖 ） 浓 度 表 示 ， 用 比 色 法 测 定 淀 粉 生 成 的 还 原 糖 的 量 ，以 单 位 重 量 样 品 在 一 定 时 间 内 生 成 的 麦 芽 糖 的 量 表 示 酶 活 力 。 （ 一 ） 器 材1 25毫 升 刻 度 试 管 。 2 吸 管 。 3 乳 体 。 4 离 心 管 。5 分 光 光 度 计 。 6 离 心 机 。 7 恒 温 水 浴 。（ 二 ） 试 剂1. 0.1 标 准 麦 芽 糖 溶 液 20毫 升 ： 精 确 称 量 100毫 克 麦 芽 糖 ，用 少 量 水 溶 解 后 ， 移 入 100ml容 量 瓶 中 ， 加 蒸 馏 水 至 刻 度 。2 pH 6.9， 0.02摩 尔 L磷 酸 缓 冲 液 100毫 升3 l 淀 粉 溶 液 100毫 升 ： 1克 可 溶 性 淀 粉 溶 于 100毫 升 0.02摩 尔 L磷 酸 缓 冲 液 ， 其 中 含 有 0.006摩 尔 L氯 化 钠 。4 l 3,5-二 硝 基 水 杨 酸 试 剂 : 1g 3,5-二 硝 基 水 杨 酸 溶 于 20毫升 2摩 尔 L的 氢 氧 化 钠 溶 液 和 50毫 升 水 中 ； 再 加 人 30克 酒 石 酸钾 钠 ， 定 客 至 100毫 升 。 若 溶 液 混 浊 ， 可 过 滤 。5 l 氯 化 钠 溶 液 300毫 升 1 种 子 发 芽 ：小 麦 种 子 浸 泡 2.5小 时 后 ， 放 人 25 恒 温 箱 内 或 在 室 温 下 发 芽 。2 酶 液 提 取 ： 取 发 芽 第 三 天 或 第 四 天 的 幼 苗 15株 ， 放 人 乳 钵 内 ， 加 海 砂 0.2g， 加 1 NaCI溶 液 10毫 升 ， 用 力 磨 碎 。 在 室 温 下 放 置 20分 钟 ， 搅 拌 几 次 。 将 提 取 液 离 心 （ l500转 min） 10分 钟 。将 上 清 液 倒 人 量 筒 ， 测 定 酶 提 取 液 的 总 体 积 。 进 行 酶 活 力 测定 时 ， 将 酶 提 取 液 稀 释 10倍 。 取 干 燥 种 子 15粒 作 为 对 照 （ 提 取 步 骤 同 上 ） 。 3 酶 活 力 测 定 ： （ 1） 取 25毫 升 刻 度 试 管 4支 。 编 号 。 按 下 表 要 求 加 人 各 试 剂（ 各 试 剂 须 25 预 热 10分 钟 ） 。将 各 管 混 匀 ， 放 在 25 ， 水 浴 中 保 温 3分 钟 后 ， 立 即 向 各 管 中加 人 1 3,5-二 硝 基 水 杨 酸 溶 液 2毫 升 。（ 2） 取 出 各 试 管 ， 放 人 沸 水 浴 中 加 热 5分 钟 。 冷 至 室 温 ， 加 水稀 释 至 25毫 升 。 将 各 管 充 分 混 匀 。（ 3） 用 空 白 管 作 对 照 ； 在 500nm处 测 定 各 管 的 光 吸 收 值 . 1（ 干 种 子 ） 2（ 湿 种 子 ） 3（ 标 注 管 ） 4（ 空 白 管 ） 酶 液 0.5 0.5 - - 标 准 麦 芽 糖 溶 液 - - 0.5 - 淀 粉 溶 液 1 1 1 1 蒸 馏 水 - - - 0.5 根 据 溶 液 的 浓 度 与 光 吸 收 值 成 正 比 的 关 系 ，即 ： A标 准 A未 知 C标 准 C未 知则 C A酶 C标 准 A标 准总 活 力 单 位 = C酶 N酶 V酶N为 酶 液 的 稀 释 倍 数V为 测 量 后 酶 液 的 总 体