《基因工程载体》PPT课件

第 三 章 基 因 工 程 载 体 生 物 科 学 与 技 术 学 院 基 因 工 程 载 体 的 概 念把 一 个 有 用 的 基 因 （ 目 的 基 因 研 究 或 应 用 基 因 ） 通 过 基 因工 程 手 段 送 到 生 物 细 胞 （ 受 体 细 胞 ） ， 需 要 运 载 工 具 （ 交 通 工具 ） 携 带 外 源 基 因 进 入 受 体 细 胞 ， 这 种 运 载 工 具 就 叫 载 体 。 作为 基 因 工 程 载 体 ， 质 粒 至 少 应 该 具 备 复 制 的 起 始 区 、 选 择 标 记基 因 区 、 多 克 隆 位 点 等 部 分 。复 制 的 起 始 区 ： 能 在 宿 主 细 胞 内 进 行 独 立 和 稳定 的 自 我 复 制 。选 择 标 记 基 因 区 ： 可 以 筛 选 重 组 体 。 多 克 隆 位 点 ： 方 便 外 源 基 因 的 插 入 。 第 一 节 质 粒 载 体质 粒 （ plasmid） ： 是 独 立 于 染 色 体 以 外 的 能 自 主 复 制 的 双 链 闭 合 环 状 DNA分 子 。广 泛 存 在 于 细 菌 、 霉 菌 、 蓝 藻 、 酵 母 等 细 胞 中 。质 粒染 色 体质 粒 的 一 般 生 物 学 特 性 ：u分 子 大 小 差 异 大 ：u编 码 基 因 少 ： u形 状 ： u 质 粒 的 空 间 构 型 ： u 质 粒 空 间 构 型 与 电 泳 速 率 ：同 一 质 粒 尽 管 分 子 量 相 同 ， 不 同 的 构 型 电 泳 迁 移 率 不 同 ， scDNA最 快 、 lDNA次之 、 ocDNA最 慢 。1. 共 价 闭 合 环 状 DNA（ Covalent close circular DNA， cccDNA)， 呈 超 螺 旋（ SC） （ super coil）2. 开 环 DNA（ open circular， ocDNA） ，一 条 链 上 有 一 至 数 个 缺 口3. 线 形 DNA（ linear， lDNA） u 质 粒 的 类 型 ：在 大 肠 杆 菌 中 的 质 粒 ， 可 以 分 为 ： 1、 接 合 型 质 粒 （ 能 自 我 转 移 ） ： 除 了 带 有 自 我 复 制 所 必 需 的 遗 传 信 息 外 还 带有 一 套 控 制 细 菌 配 对 和 质 粒 接 合 转 移 的 基 因 。 如 ： F质 粒 （ 性 质 粒 、 或 F因 子 ） 。甚 至 能 使 寄 主 染 色 体 上 的 基 因 随 其 一 道 转 移 到 原 先 不 存 在 该 质 粒 的 受 体 菌 中 。 不符 合 基 因 工 程 的 安 全 要 求 。2、 非 接 合 型 质 粒 （ 不 能 自 我 转 移 ） ： 虽 然 带 有 自 我 复 制 所 必 需 的 遗 传 信 息 ，但 失 去 了 控 制 细 菌 配 对 和 质 粒 接 合 转 移 的 基 因 ， 因 此 不 能 从 一 个 细 胞 转 移 到 另 一个 细 胞 。 如 R质 粒 （ 抗 生 素 抗 性 质 粒 ） 和 Col质 粒 （ 大 肠 杆 菌 素 colicin ） 。 符 合基 因 工 程 的 安 全 要 求 。 大 肠 杆 菌 素 是 大 肠 杆 菌 分 泌 的 一 类 细 菌 素 （ bacteriocin） ， 对 于 其 他 不 能 分 泌 特 异 性 大 肠杆 菌 素 免 疫 蛋 白 （ Immunity protein） 的 细 菌 具 有 杀 灭 作 用 ， 现 在 一 般 认 为 有 调 节 菌 群 数量 的 作 用 。 大 部 分 大 肠 杆 菌 素 由 质 粒 编 码 ， 其 中 最 著 名 的 没 过 于 pColE1 。 u 质 粒 的 复 制 类 型严 紧 型 质 粒 （ stringent plasmid） ：松 弛 型 质 粒 （ relaxed plasmid） ：u 质 粒 的 不 相 容 性又 称 质 粒 的 不 亲 和 性 ， 在 没 有 选 择 压 力 的 情 况 下 ， 两 种 亲 缘 关 系 密 切 的 不 同质 粒 ， 不 能 够 在 同 一 个 寄 主 细 胞 系 中 稳 定 共 存 ， 这 一 现 象 称 为 质 粒 的 不 相 容 性 ,又 称 质 粒 的 不 亲 和 性 。 u 质 粒 的 复 制 过 程质 粒 的 复 制 主 要 是 通 过 型 复 制 和 滚 环 复 制 两 种 方 式 之 一 进 行 的 ， 其 中 以 型复 制 为 主 。 在 型 复 制 中 ， 有 单 向 半 保 留 复 制 和 双 向 半 保 留 复 制 。Ori复 制 起 点 在 革 兰 氏 阳 性 细 菌 中 大 多 数 质 粒 是 以 滚 环 方 式 复 制 。 复 制 起 点 (ori)区 的 功 能u复 制 起 点 是 一 段 特 定 的 DNA序 列 ， 长 约 几 百 碱 基 对 ， 在 其 相 关 的 调 控 元 件 中含 有 由 质 粒 或 宿 主 染 色 体 编 码 的 、 参 与 DNA合 成 起 始 调 控 因 子 的 结 合 位 点 。u在 大 多 数 质 粒 中 ， 与 复 制 有 关 的 蛋 白 质 基 因 位 于 ori序 列 附 近 ， 因 此 ori位 点 周围 的 小 范 围 DNA是 质 粒 复 制 所 必 需 的 。u如 果 质 粒 DNA的 大 部 分 区 域 被 去 掉 ， 而 只 保 留 质 粒 的 ori序 列 ， 而 且 质 粒 是 环状 的 ， 则 质 粒 仍 然 能 进 行 复 制 。u将 ori区 克 隆 到 一 个 不 能 自 主 复 制 的 环 状 双 链 DNA分 子 上 并 引 入 到 原 核 细 胞 后 ， 该 重 组 DNA具 有 自 主 复 制 能 力 。 分 子 克 隆 中 常 用 的 质 粒 载 体 就 是 以 这 种 方 法 构 建的 ， 同 时 用 这 种 方 法 可 以 确 定 哪 部 分 DNA是 ori区 并 研 究 ori区 的 功 能 。uori区 域 常 决 定 了 质 粒 的 许 多 特 性 ， 如 质 粒 的 寄 主 范 围 和 质 粒 的 拷 贝 数 。 质 粒 的 命 名用 小 写 字 母 p代 表 质 粒 （ plasmid） ， 在 p字 母 后 用 两 个 大 写 字 母 代 表 发 现 这 一 质粒 的 作 者 或 实 验 室 名 称 ， 再 加 上 质 粒 编 号 。 如 ： pBR322： p表 示 一 种 质 粒 ， 而“ BR” 则 是 分 别 取 自 该 质 粒 的 两 位 主 要 构 建 者 F. Bolivar和 R. L. Rodriguez， 322为 编 号 。 质 粒 载 体 的 构 建u天 然 质 粒 的 局 限 性1、 分 子 量 大 ， 拷 贝 数 低 ， 第 一 个 用 于 基 因 克 隆 的 天 然 质 粒 pSC101， 分 子 长 9.1 kb。 但 只有 一 个 EcoR I切 点 充 当 克 隆 位 点 ， Tetr 作 为 筛 选 标 志 。 EColR I 酶 切 位 点 位 于 Tetr 基 因 外部 ， 外 源 基 因 插 入 不 会 引 起 筛 选 基 因 失 活 ， 因 此 无 法 区 别 重 组 体 和 野 生 型 质 粒 。2、 天 然 质 粒 ColE1质 粒 ， 长 度 为 6.3 kb， 唯 一 的 EcoRI酶 切 位 点 位 于 筛 选 标 志 基 因 大 肠 杆菌 素 E1（ colicin E1） 内 部 。 colicin E1能 杀 死 不 含 ColE1 质 粒 的 菌 ， 形 成 “ 噬 菌 斑 ” 。 可以 通 过 插 入 失 活 筛 选 。 但 细 菌 群 体 容 易 自 发 突 变 出 抗 colicin E1的 细 胞 。u质 粒 载 体 的 发 展 概 况第 一 阶 段 （ 1977年 前 ） ： 天 然 质 粒 和 重 组 质 粒 的 利 用 ， 如 pSC101, colE1, pCR, pBR313 和 pBR322。第 二 阶 段 ： 增 大 载 体 容 量 (降 低 载 体 长 度 )， 建 立 多 克 隆 位 点 区 和 新 的 遗 传 标 记 基 因 ,如 pUC系 列 载 体 。第 三 阶 段 ： 完 善 载 体 功 能 以 满 足 基 因 工 程 克 隆 中 的 不 同 要 求 ， 如 M13mp系 列 载 体 ， 含 T3，T7， sp6启 动 子 载 体 ， 表 达 型 载 体 及 各 种 探 针 型 载 体 。 理 想 质 粒 载 体 必 须 具 备 的 基 本 条 件 ：u1、 具 有 复 制 起 点 （ ORI）u2、 具 有 抗 菌 素 抗 性 基 因 ： 是 筛 选 的 标 志 。 理 想 的 载 体 应 该 有 两 种 抗 菌 素 抗 性基 因 。u3、 若 干 限 制 性 内 切 酶 的 单 一 位 点 ： 用 来 插 入 外 源 DNA片 断 。 且 插 入 后 不 影 响复 制 功 能 。u4、 具 有 较 小 的 分 子 量 和 较 高 的 拷 贝 数 。 质 粒 的 选 择 标 记 及 其 工 作 原 理 ：绝 大 多 数 质 粒 载 体 都 是 用 抗 菌 素 抗 性 标 记 .氨 苄 青 霉 素 抗 性 （ Ampr） :青 霉 素 的 衍 生 物 。 氨 苄 青 霉 素 通 过 干 扰 细 菌 细 胞 壁 合 成 的 末 端 反 应 ， 杀 死生 长 的 细 菌 。 Ampr基 因 编 码 -内 酰 胺 酶 ， 特 异 地 切 割 氨 苄 青 霉 素 的 -内 酰 胺 环 。卡 那 霉 素 抗 性 （ Kanr） :卡 那 霉 素 通 过 与 70S核 糖 体 结 合 ， 导 致 mRNA发 生 错 读 ， 从 而 杀 死 细 菌 。 Kanr 编 码 的 氨 基 糖 苷 磷 酸 转 移 酶 ， 对 卡 那 霉 素 进 行 修 饰 ， 阻 断 其 与 核 糖 体 结 合 作 用 。四 环 素 抗 性 （ Tet r） :四 环 素 通 过 于 30S核 糖 体 亚 基 结 合 ， 干 扰 细 胞 蛋 白 质 的 合 成 并 阻 止 肽 键 的 形 成 。杀 死 生 长 的 细 菌 。 Tetr 编 码 特 异 性 蛋 白 质 ， 对 细 菌 的 膜 结 构 进 行 修 饰 ， 组 止 四 环 素 通 过 细 胞 膜 进 入 细菌 细 胞 内 。链 霉 素 抗 性 （ Strr） :链 霉 素 通 过 与 30S核 糖 体 亚 基 结 合 ， 导 致 mRNA错 译 ， 从 而 杀 死 细 菌 。 Strr 编 码一 种 氨 基 糖 苷 磷 酸 转 移 酶 对 链 霉 素 进 行 修 饰 ， 阻 断 其 与 核 糖 体 30S亚 基 结 合 作 用 。氯 霉 素 抗 性 （ Cmlr） :氯 霉 素 通 过 与 50S核 糖 体 亚 基 结 合 ， 干 扰 细 胞 蛋 白 质 的 合 成 并 阻 止 肽 键 的 形 成 。杀 死 生 长 的 细 菌 。 Cmlr 编 码 乙 酰 转 移 酶 ， 特 异 地 使 氯 霉 素 乙 酰 化 而 失 活 。 人 工 构 建 的 质 粒 载 体 的 类 型u高 拷 贝 数 的 质 粒 载 体pColE1、 pMB1派 生 质 粒 具 有 高 拷 贝 数 的 特 点 。 在 没 有 菌 体 蛋 白 质 合 成 的 条 件 下（ 蛋 白 质 合 成 抑 制 剂 ， 氯 霉 素 等 存 在 下 ） 仍 能 复 制 ， 达 到 每 个 细 胞 的 拷 贝 数1000 3000个 。 适 合 大 量 增 殖 克 隆 基 因 、 或 需 要 表 达 大 量 的 基 因 产 物 。u低 拷 贝 数 的 质 粒 载 体由 pSC101派 生 来 的 载 体 特 点 是 分 子 量 小 ， 拷 贝 数 低 ， 不 适 合 大 量 扩 增 DNA用 。 但当 有 些 被 克 隆 的 基 因 的 表 达 产 物 过 多 时 会 严 重 地 影 响 寄 主 菌 的 正 常 代 谢 活 动 ， 导致 寄 主 菌 死 亡 时 ， 就 需 要 低 拷 贝 的 载 体 。 如 pLG338、 pLG339、 pHSG415等 。u失 控 的 质 粒 载 体 温 度 敏 感 型 复 制 控 制 质 粒 ， 温 度 低 于 37度 ， 拷 贝 数 很 少 ； 温 度 增 加 ， 大 于 40度时 ， 拷 贝 数 会 很 快 增 加 到 1000个 以 上 。 B. E. Uhlin于 1979年 构 建 的 载 体 如 pBEU1、pBEU2等 。 u 插 入 失 活 型 质 粒 载 体载 体 的 克 隆 位 点 位 于 其 某 一 个 选 择 性 标 记 基 因 内 部 。 如 pDF41、 pDF42、 pBR329。u 正 选 择 的 质 粒 载 体直 接 选 择 转 化 后 的 细 胞 。 只 有 带 有 选 择 标 记 基 因 的 转 化 菌 细 胞 才 能 在 选 择 培 养 基 上 生长 。 如 pUR2、 pTR262等 。 目 前 通 用 的 绝 大 部 分 质 粒 载 体 都 是 正 选 择 载 体 。u 表 达 型 质 粒 载 体主 要 用 来 使 外 源 基 因 表 达 出 蛋 白 质 产 物 。 注 意 启 动 子 的 性 质 ， 终 止 子 、 起 始 密 码 、 终止 密 码 的 阅 读 正 确 。 如 果 在 大 肠 杆 菌 里 表 达 ， 必 须 把 所 克 隆 的 真 核 生 物 的 基 因 置 于 大 肠 杆 菌 的 转 录 翻 译 信 号 控 制 之 下 。u 克 隆 质 粒 载 体专 用 于 基 因 和 DNA片 段 无 性 繁 殖 的 质 粒 载 体 。 纯 粹 的 获 取 基 因 和 DNA片 段 。 常 用 的 质 粒 载 体 pBR3221、 元 件 来 源复 制 起 点 oripMB1系 列 （ 来 源 于 ColE1） 的 高 拷 贝 型 复 制 起 点Ampr基 因pSP2124质 粒 的 Ampr基 因Tetr基 因pSC101的 Tet r 基 因 。2、 长 度4363bp3、 选 择 标 记氨 苄 青 霉 素 和 四 环 素 抗 性4、 克 隆 位 点24个 克 隆 位 点 ， 其 中 9个 会 导 致 Tetr基 因 失 活 （ 如 BamH I、 Hind 、 Sal I） ； 3个 会 导 致 Amp r基 因 失 活 （ Sca I、 PvuI、 Pst I） 。 BamHI片 段 (Tcr) pBR322 PstI(Apr)片 段 重 组 分 子 (Aps Tcr) PstI片 段 外 源 DNA BamHI片 段重 组 分 子 I(Apr Tcs） 分 别 转 化 E.coli(ApS TcS) 重 组 分 子 (Ap s Tcr)影 印 到 Tc平 板 上 Apr Tcr为 原 载 体即 为 非 重 组 子 影 印 到 Ap平 板 上 重 组 分 子 I (Apr Tcs）涂 布 Ap平 板 Apr转 化 子 涂 布 Tc平 板 Tcr转 化 子Apr TcS为 重 组 子ApS Tcr为 重 组 子 重 组 DNAAmprTcs 提 取 DNA 电 泳 Ampr Ampr Ampr AmprTcr Tcr Tc AmprTcs Tcs转 化 无 菌 落 阳 性 菌 落筛 选 重 组 子 2)DNA重 组无 DNA插 入 有 DNA插 入 外 源 DNA 1)限 制 酶 切 影 印 pBR322的 优 点双 抗 菌 素 抗 性 选 择 标 记没 有 获 得 载 体 的 寄 主 细 胞 在 Amp或 Tet中 都 死 亡 。 获 得 载 体 的 寄 主 细 胞 在Amp或 Tet其 中 之 一 中 死 亡 。分 子 小 ， 克 隆 能 力 大载 体 越 小 越 好 。 10kb的 DNA在 纯 化 过 程 中 容 易 断 裂 。高 拷 贝 数氯 霉 素 扩 增 之 后 ， 每 个 细 胞 可 达 10003000copy。安 全失 去 了 转 移 蛋 白 基 因 mob（ mobilization） 。 不 能 通 过 接 合 转 移 。pBR322的 缺 点 保 留 了 转 移 蛋 白 （ mob） 的 作 用 位 点 。 能 够 被 pColK质 粒 编 码 的 mob蛋 白 识 别 ，如 果 再 有 F质 粒 的 参 与 ， 就 有 可 能 转 移 ！ pBR322的 改 良u 删 除 mob识 别 位 点如 pAT153， pBR322的 改 造 衍 生 质 粒 ， 除 去 了 mob识 别 位 点 ， 同 时 增 加 质 粒 的拷 贝 数 。u 改 造 EcoR I 位 点如 pBR325， 使 EcoRI 也 成 为 插 入 失 活 型 位 点 。 在 pBR322位 点 上 接 入 一 段 来自 噬 菌 体 PICm的 HaeII酶 切 片 断 （ 带 有 氯 霉 素 抗 性 基 因 cmlr） 。 cmlr上 也 带 一 个EcoRI位 点 。 cmlr 常 用 的 质 粒 载 体 pUC系 列1、 元 件 来 源2、 长 度 3、 克 隆 位 点选 择 标 记PUC系 列 质 粒 载 体 的 选 择 标 记 是 Ampicillin 抗 性 和 lacZ的 a肽 互 补 （ 蓝 白 斑 ） 相 结 合 。 乳 糖 操 纵 子 调 节 机 制 -半 乳 糖 苷 酶 -半 乳 糖 苷 酶 和 Xgal的 显 色 反 应-半 乳 糖 苷 酶 N端 的 一 段 氨 基 酸 片 断 （ 11-41氨 基 酸 ） ， 也 叫 -肽 （ lacZ ） 。Xgal是 一 种 人 工 工 合 成 的 、 无 色 的 乳 糖 类 似 物 ；-半 乳 糖 苷 酶 能 把 无 色 的 化 合 物 Xgal分 解 成 半 乳 糖 和 一 个 深 蓝 色 的 物 质 5-溴 -4-氯 靛 蓝 。lacZ只 有 在 4聚 体 的 状 态 下 才 有 功 能 . C端 大 部 分N端 的 11-41aa C端 大 部 分N端 的 11-41aa C端 大 部 分N端 的 11-41aa C端 大 部 分N端 的 11-41aa4聚 体 大 肠 杆 菌 -半 乳 糖 基 因 （ lacZ 基 因 ） -蓝 白 斑 选 择 原 理1、 b-半 乳 糖 苷 酶 能 把 无 色 的 化 合 物 Xgal分 解 成 半 乳 糖和 一 个 深 蓝 色 的 物 质 5-溴 -4-氯 靛 蓝 ；2、 a-肽 ， 也 叫 lacZ ， 是 b-半 乳 糖 苷 酶 N端 的 一 段 氨 基酸 片 断 ， lacZ只 有 在 a-肽 形 成 4聚 体 的 状 态 下 才 有 功 能 。若 受 体 菌 lacZ突 变 ， 受 体 菌 本 身 的 b-半 乳 糖 苷 酶 失 效 ，不 能 分 解 Xgal 。3、 pUC载 体 上 LacZ的 5端 有 一 段 多 克 隆 位 点 (MCS)区 ，本 身 虽 不 干 扰 LacZ的 合 成 ， 但 插 入 外 源 基 因 就 会 阻 止LacZ的 合 成 。 4、 IPTG的 诱 导 作 用 ： IPTG是 乳 糖 的 类 似 物 。 能 诱 导lac操 纵 子 的 启 动 转 录 ， 使 受 体 菌 基 因 组 中 的 lacZ的 C端 部 分 和 载 体 的 lacZ都 表 达 。5、 IPTG诱 导 的 结 果 ： MCS无 插 入 时 ， 互 补 ， 蓝 菌 斑 ；MCS有 插 入 时 ， 不 互 补 ， 白 菌 斑 。 AprAprApr 转 化筛 选 重 组 子 白 色 菌 落2)DNA重 组无 DNA插 入 有 DNA插 入外 源 DNA 重 组 DNA提 取 DNA 电 泳Apr Apr Apr 1)限 制 酶 切 无 质 粒 的受 体 菌 -半 乳 糖 苷 酶部 分 缺 失 ， 不能 分 解 Xgal；无 抗 菌 素 抗 性 在 含 抗 菌 素和 Xgal的 培养 基 上 培 养 无 菌 斑生 长质 粒 转 化的 受 体 菌 -半 乳 糖 苷 酶 的缺 失 被 载 体 产 物互 补 ， 能 分 解Xgal。 且 有 抗 菌素 抗 性 在 含 抗 菌 素和 Xgal的 培养 基 上 培 养 有 蓝 色 菌斑 生 长带 外 源 DNA插入 的 质 粒 转 化的 受 体 菌 载 体 产 物 失 活 ，不 能 互 补 -半乳 糖 苷 酶 的 缺失 。 不 能 分 解Xgal， 但 有 抗 菌 素 抗 性 在 含 抗 菌 素和 Xgal的 培养 基 上 培 养 有 白 色 菌斑 生 长 1、 更 小 的 分 子 量 。 如 pUC18为 2682bp， pUC8为 2750bp。2、 选 择 方 便 。 Xgal显 色 、 抗 菌 素 双 重 直 接 选 择 。3、 克 隆 便 利 。 具 有 多 克 隆 位 点4、 测 序 方 便 。现 在 最 常 用 的 pUC载 体 是 pUC18， 它 的 分 子 量 小 ， 具 有 多 克 隆 位 点 和 易 于 选 择 的分 子 标 记 ， 并 且 是 松 弛 型 复 制 ， 在 正 常 情 况 下 ， 它 的 拷 贝 数 可 达 上 千 个 ， 所 以 不需 要 用 氯 霉 素 进 行 扩 增 。pUC系 列 载 体 的 优 点 1 pMD系 列 载 体 ： Takara公 司 开 发 的 一 种 高 效 克 隆 PCR产 物 (TA Cloning)的专 用 载 体 。 它 由 pUC18载 体 改 建 而 成 。 在 pUC18载 体 的 多 克 隆 位 点 处 的 Xba I 和 Sal I识别 位 点 之 间 插 入 了 EcoR V 识 别 位 点 ， 用 EcoR V进 行 酶 切 反 应 后 ， 再 在 两侧 的 3端 添 加 “ T”而 成 。pUC18载 体EcoR V的 酶 切 位 点 ： 常 用 的 质 粒 载 体 穿 梭 质 粒 载 体人 工 构 建 的 、 具 有 两 种 不 同 复 制 起 点 和 选 择 标 记 、 可 以 在 两 种 不 同 的 寄 主 细 胞 中 存 活 和复 制 的 质 粒 载 体 。常 用 的 穿 梭 质 粒 载 体 有 ：大 肠 杆 菌 -枯 草 杆 菌 穿 梭 载 体大 肠 杆 菌 -酿 酒 酵 母 穿 梭 载 体大 肠 杆 菌 -动 物 细 胞 穿 梭 载 体 。穿 梭 载 体 的 优 点 ： 利 用 大 肠 杆 菌 进 行 基 因 克 隆 、 表 达 ； 也 能 利 用 其 它 细 胞 系 统 （ 酵 母 、 枯 草 杆 菌 、 哺 乳 动 物 细 胞 等 ） 进 行 基 因 表 达 ； 可 以 自 如 地 在 两 种 不 同 寄 主 细 胞 之 间 来 回 转 移 基 因 。 f1 origin是 f1噬 菌 体 基 因 组 DNA的 复 制 区 序 列 ， 可 引 导 单 链 DNA复 制 过 程 。pUC origin是 大 肠 杆 菌 复 制 区 序 列 ， 可 引 导 双 链 DNA复 制 过 程 。 2u origin是 酵 母 菌 的 复 制 区 序 列 ， 可 引 导 双 链 DNA复 制 过 程 。 大 肠 杆 菌 和 酿 酒 酵 母 的 穿 梭 表 达 载 体 pcDNA3.1(+)质 粒 谱 图 及 其 用 户 实 验 手 册 讲 解 Important Information Methods OverviewCloning into pcDNA3.1 Multiple Cloning Site of pcDNA3.1(+) 多 克 隆 位 点 Multiple Cloning Site of pcDNA3.1(-) pcDNA3.1 Vectors Map pcDNA3.1 Vectors MapFeatures 常 用 的 质 粒 载 体 表 达 载 体原 核 表 达 载 体 ： 适 用 于 在 原 核 细 胞 中 表 达 外 源 基 因 的 载 体 。1、 普 通 载 体 元 件复 制 起 始 点 ORI 选 择 标 记多 克 隆 位 点 MCS2、 大 肠 杆 菌 操 纵 子 元 件阻 遏 基 因 I 操 纵 基 因 O 启 动 基 因 P 核 糖 体 结 合 位 点 序 列 （ SD） 转 录 终 止 信 号 区如 果 在 大 肠 杆 菌 里 表 达 蛋 白 ， 必 须 把 所 克 隆 的目 的 基 因 置 于 大 肠 杆 菌 的 转 录 翻 译 信 号 控 制之 下 。 1) 特 点 : a. 基 因 的 启 动 子 序 列 和 终 止 子 序 列 ；b. 一 般 无 检 测 标 记 基 因 ；c. 克 隆 位 点 是 确 定 的 （ 即 位 于 启 动 子 序 列 后 ） ；d. 重 组 分 子 用 凝 胶 电 泳 检 出 （ 依 赖 于 分 子 量 差 异 ） 。2) 结 构 : a. 转 化 单 元 -宿 主 细 胞 转 化b. 表 达 单 元 -外 源 基 因 表 达3) 类 型 : 型 ： 转 录 起 始 区 （ 调 控 序 列 +启 动 子 ） + 终 止 子 型 ： 转 录 起 始 区 + 翻 译 起 始 区 （ 核 糖 体 结 合 序 列 和 起 始 密 码 子 ） + 终 止 子 型 ： 转 录 起 始 区 + 翻 译 起 始 区 + 信 号 肽 链 编 码 区 + 终 止 子 （ 常 称 之 为 表 达 分 泌 型 载 体 ） 表 达 载 体 （ expression vector） TAAATG I II III IV V I V I II VATG I II III V IIIIII Ori 转 录 起 始 翻 译 起 始 信 号 肽 成 熟 蛋 白 质 转 录 终 止 区CS CS CS CS-cloning site 显 然 ， 不 同 类 型 载 体 中 所 缺 少 的 部 分 必 须 由 外 源 基 因 提 供 。 换 言 之 ， 被 表 达 的 外源 基 因 一 旦 确 定 ， 表 达 载 体 的 类 型 也 就 确 定 了 。例 子 ： pET-43和 pPIC9K4) 用 途 :a. 表 达 外 源 基 因 以 产 生 大 量 外 源 基 因 产 物b. 用 于 构 建 cDNA文 库5) 注 意 事 项 : a. 启 动 子 来 源b. 终 止 子 来 源c. 启 动 子 的 启 动 效 率d.信 号 肽 来 源 与 结 构 e. 调 控 类 型 1. 质 粒 稳 定 遗 传 必 须 的 两 个 条 件 ：（ 1） 每 个 世 代 、 每 个 质 粒 至 少 要 复 制 一 次 ；（ 2） 在 细 胞 分 裂 时 ， 复 制 过 的 质 粒 必 须 分 配 到 两 个 子 细 胞 中 。六 、 质 粒 载 体 的 不 稳 定 性2. 质 粒 分 配 方 式 ：有 主 动 分 配 和 随 机 分 配 两 种 假 说 。（ 1） 主 动 分 配 。 天 然 质 粒 具 有 一 个 控 制 质 粒 拷 贝 分 配 的 功 能 区 （ Par） ， 能 以 主 动 分 配的 方 式 确 保 质 粒 能 正 确 分 配 到 两 个 子 细 胞 中 。（ 2） 随 机 分 配 。 人 工 构 建 的 质 粒 载 体 缺 失 了 par区 ， 只 能 以 随 机 分 配 方 式 分 到 子 细 胞 中 。一 般 情 况 下 也 能 保 证 质 粒 的 稳 定 遗 传 ， 但 在 一 定 条 件 下 会 出 现 质 粒 丢 失 的 现 象 。 3. 质 粒 分 离 的 不 稳 定 性 （ segregation instability）在 寄 主 菌 细 胞 分 裂 的 过 程 中 ， 有 一 个 细 胞 没 有 获 得 质 粒 拷 贝 ， 并 最 终 繁 殖 成 无 质 粒 的 优势 群 体 。4. 结 构 的 不 稳 定 性 （ structural instability）寄 主 基 因 组 的 IS序 列 插 入 质 粒 、 质 粒 间 的 同 源 重 组 等 都 会 使 质 粒 发 生 插 入 或 缺 失 。IS dimer重 组 5. 影 响 质 粒 载 体 稳 定 性 的 主 要 因 素（ 1） 新 陈 代 谢 负 荷 ：a、 复 制 负 荷b、 转 录 和 翻 译 负 荷使 寄 主 细 胞 生 长 减 缓 ： 质 粒 载 体 使 寄 主 的 世 代 时 间 延 长 约 15%。 减 缓 的 程 度 与 质粒 的 分 子 量 成 正 比 。 丢 失 质 粒 的 细 胞 反 而 会 成 为 优 势 群 体 ！（ 2） 质 粒 载 体 的 拷 贝 数质 粒 载 体 的 拷 贝 数 是 产 生 无 质 粒 细 胞 的 重 要 原 因 。差 度 （ variance） ： 每 个 菌 体 中 所 拥 有 的 质 粒 拷 贝 数 不 完 全 相 同 ， 称 差 度 。低 拷 贝 数 的 质 粒 的 差 度 小 ， 遗 传 稳 定 。 高 拷 贝 数 的 质 粒 载 体 差 度 大 ， 拥 有 少 量 拷贝 数 的 菌 体 多 ， 发 生 丢 失 的 可 能 性 大 。 （ 3） 寄 主 菌 的 重 组 体 系含 有 大 分 子 量 插 入 片 断 的 质 粒 载 体 普 遍 能 形 成 质 粒 二 聚 体 。二 聚 体 灾 难 （ dimer catastrophe） ： 质 粒 在 寄 主 的 重 组 酶 作 用 下 会 发 生 重 组 形 成二 聚 体 质 粒 。 二 聚 体 质 粒 的 复 制 速 度 是 单 体 的 二 倍 ！ 导 致 质 粒 失 控 。 第 二 节 噬 菌 体 载 体一 、 噬 菌 体 的 一 般 特 性 细 菌 病 毒 （ Bacteriophage）噬 菌 体 的 蛋 白 质 外 壳 内 包 裹 着 的 DNA， DNA有 双 链 、 单 链 、 线 性、 环 状 等 结 构 。 二 、 噬 菌 体 的 生 活 周 期1. 溶 菌 周 期 烈 性 噬 菌 体 感 染 细 菌 后 ， 立 即 在 菌 体 内 复 制 DNA和 合 成 外 壳 蛋 白 质 ， 重 新 组装 成 噬 菌 体 颗 粒 ， 并 导 致 细 菌 细 胞 解 体 ， 释 放 出 大 量 子 代 噬 菌 体 。2. 溶 原 周 期 温 和 噬 菌 体 感 染 细 菌 后 ， 将 自 己 的 DNA整 合 到 细 菌 的 染 色 体 DNA中 , 这 一 过 程称 为 溶 源 化 。 整 合 到 细 菌 染 色 体 上 的 噬 菌 体 DNA称 为 原 噬 菌 体 ， 随 细 菌 的 染 色体 复 制 而 复 制 。 噬菌斑 三 、 载 体 的 5-突 起 末 端 （ 5-GGGCGGCGACCT-3） ， 该 末 端 称 为 cos位 点 ， 可 被 编 码 的 末 端 酶 所 识 别 噬 菌 体 从 溶 原 转 为 裂 解 是 一 种 可 诱 导 过 程 。 诱 导 的 因 素 很 多 ， 实 验 室 常 用 的 是 热 诱 导 。如 分 离 得 到 某 些 噬 菌 体 clts857 ， 在 低 温 时 （ 30 ） 建 立 溶 原 ， 用 高 温 （ 420C） 则 出 现裂 解 。 这 些 噬 菌 体 的 cl基 因 是 温 度 敏 感 突 变 型 的 ， 称 为 c1ts。 clts1857可 作 为 组 件 插 入 质 粒 DNA内 。 目 的 基 因 插 在 clts857下 游 ， 重 组 体 的 目 的 基 因 在42 表 达 ， 30 不 表 达 。 这 种 方 法 称 为 热 诱 导 表 达 ， 使 用 的 是 温 敏 开 关 。 PL和 PR是 噬 菌 体 上 2个 主 要 的 启 动 子 ， 都 是 启 动 能 力 相 当 强 的 转 录 构 件 。 把 启 动 子 连同 其 附 属 成 分 ， 将 pBR322的 tet r基 因 进 行 替 换 ， 成 为 以 启 动 子 为 组 件 的 质 粒 。 -DNA载 体 的 构 建噬 菌 体 的 缺 陷 ：1、 基 因 组 太 大 （ 49kb） ；2、 酶 切 点 太 多 ， 它 有 5个 BamH1位 点 （ GGATCC） ， 6个 Bg 位 点 （ AGATCT） ， 5个EcoR 位 点 （ GAATTC） 。3、 野 生 型 只 能 接 纳 一 定 长 度 的 DNA。噬 菌 体 的 改 造 ：1、 切 去 非 必 须 区 段 ， 在 切 去 的 同 时 ， 加 载 目 的 基 因 （ 2.5kb或 更 大 ） ；2、 去 掉 太 多 的 酶 位 点 ， 每 种 酶 只 留 1-2个 切 口 ；3、 增 加 标 记 基 因 ；4、 引 入 无 义 突 变 。 载 体 类 型 ：1、 插 入 型 载 体 ： 通 过 特 定 的 酶 切 位 点 允 许 外 源 DNA片 断 插 入 的 载 体 （ 0-11kb) 。2、 置 换 型 载 体 ： 允 许 外 源 DNA片 断 替 换 非 必 需 DNA片 断 的 载 体 (9-23kb)。 -DNA载 体 的 选 择 标 记1、 lacZ 基 因 ： IPTG/X-gal 2、 基 因 c 失 活 （ 热 敏 感 ）3、 Spi 筛 选 ： 野 生 型 的 l噬 菌 体 不 能 在 P2噬 菌 体 溶 源 性 的 细 菌 中 繁 殖 （ Spi+） ， 这 种 生长 抑 制 表 型 受 -DNA上 的 red和 gam两 个 基 因 控 制 。 若 将 外 源 DNA取 代 red和 gam，重 组 噬 菌 体 便 拥 有 Spi-表 型 ， 能 在 P2噬 菌 体 溶 源 性 的 大 肠 杆 菌 受 体 菌 中 繁 殖 ， 并 形成 透 明 斑 。代 表 性 噬 菌 体 载 体1、 插 入 型 载 体 -gt10 载 体 2、 置 换 型 载 体 -EMBL3 基 因 c 被 一 段 来 自 434 噬 菌 体 的 片 段 imm434替 换 了 ， 其 中 内 有 一 个 EcoR 位 点 。 在 填 充 片 段 两 端 带 有 对 称 的 多 克 隆位 点 。 四 、 单 链 噬 菌 体 载 体1 M13 噬 菌 体 的 生 物 学M13 噬 菌 体 颗 粒 是 丝 状 的 ， 只 感 染 革 兰 氏 阳 性 大 肠 杆 菌 。 感 染 宿 主 后 不 裂 解 宿主 细 胞 ， 而 是 从 感 染 的 细 胞 中 分 泌 出 噬 菌 体 颗 粒 ， 宿 主 细 胞 仍 能 继 续 生 长 和 分裂 。M13 噬 菌 体 的 基 因 组 为 单 链 DNA （ +DNA） ， 由 6407 的 碱 基 组 成 。 基 因 组 90% 以 上 的 序 列 可 编 码 蛋 白 质 ， 共 有 11 个 编 码 基 因 ， 基 因 之 间 的 间 隔 区 多 为几 个 碱 基 。 较 大 的 间 隔 位 于 基 因 和 基 因 以 及 基 因 和 基 因 之 间 ， 其间 有 调 节 基 因 表 达 和 DNA 合 成 的 元 件 。M13 噬 菌 体 基 因 组 可 编 码 3 类 蛋 白 质 ， 包 括 复 制 蛋 白 ， 形 态 发 生 蛋 白 ， 结 构 蛋白 。 M13没 有 包 装 限 制 ：2、 单 链 噬 菌 体 的 特 点 ：（ 1） 存 在 两 种 类 型 ， ssDNA和 RF dsDNA；（ 2） +DNA（ ssDNA） ； （ 3） 复 制 型 （ RF） 是 双 链 环 状 DNA；（ 4） RF dsDNA和 ssDNA都 能 转 染 感 受 态 大 肠 杆 菌 ， 并 产 生 噬 菌 斑 ；（ 5） 不 存 在 包 装 限 制 ；（ 6） 可 产 生 大 量 的 含 有 外 源 DNA插 入 片 断 的 单 链 分 子 ， 便 于 作 探 针 或 测 序 。J. Messing证 明 ，IG区 存 在 M13的 复 制 起 点 ，可 以 插 入 外 源DNA而 不 影 响M13噬 菌 体 的活 力 。 不 导 致 溶 菌 ， 但 可 使 细 菌 生 长 变 慢 ， 约 为 正 常 的 1/23/4M13通 过 雄 性 细 菌 的 F性 菌 毛 注 入 其 +DNA+DNA合 成 DNA， 形 成 RF dsDNA DNA转 录 mRNA、 翻 译 形 成 噬 菌 体 蛋 白 、 同 时 复 制 +DNA组 装 成 新 的 噬 菌 体 M13， 挤 出 寄 主 细 胞M13的 生 活 周 期雄 性 细 菌 的 F性 菌 毛 ： 仅 见 于 少 数 革 兰 阴 性 菌 ， 比 普 通 菌 毛 略 微 稍 粗 ， 一 个 菌 体 只有 1 4根 ， 通 常 由 质 粒 编 码 。 带 有 性 菌 毛 的 细 菌 具 有 致 育 能 力 ， 称 为 F+菌 或 者 雄 性 菌 。雄 性 菌 的 遗 传 物 质 能 通 过 性 菌 毛 传 递 给 F-菌 ， 这 个 过 程 称 为 接 合 。 细 菌 可 以 通 过 这 个 方 式传 递 耐 药 性 以 及 毒 力 。 此 外 ， 性 菌 毛 还 是 某 些 噬 菌 体 感 染 宿 主 菌 的 受 体 。 3. M13载 体 的 构 建单 链 DNA 的 酶 切 和 连 接 是 比 较 困 难 的 ， 因 此 M13 噬 菌 体 在 用 作 载 体 时 是 利 用其 双 链 RF DNA。 RF DNA 很 容 易 从 感 染 细 胞 中 纯 化 出 来 ， 可 以 象 质 粒 一 样 进 行操 作 ， 并 可 通 过 转 化 方 法 再 次 导 入 细 胞 。1） 载 体 的 插 入 位 点在 M13 噬 菌 体 基 因 组 中 绝 大 多 数 为 必 需 基 因 ， 只 有 两 个 间 隔 区 可 用 来 插 入 外 源 DNA。 基 因 和 基 因 之 间 的 508bp 间 隔 区 是 主 要 的 外 源 片 段 插 入 位 点 。 在基 因 和 基 因 之 间 的 小 间 隔 区 也 可 用 来 插 入 外 源 片 段 ， 但 是 在 操 作 过 程 中 ，需 要 获 得 感 染 细 胞 的 菌 落 进 行 影 印 筛 选 ， 比 利 用 可 见 的 噬 菌 斑 方 法 更 慢 更 麻 烦 。2） M13 噬 菌 体 载 体 组 成现 在 所 使 用 的 M13 噬 菌 体 载 体 是 Messing 及 其 同 事 建 立 的 mp 系 列 载 体 ， 以 基因 和 基 因 之 间 的 区 域 作 为 外 源 DNA 插 入 区 。mp 载 体 系 列 都 是 从 同 一 个 重 组 M13 噬 菌 体 （ M13mpl） 改 造 而 来 的 。 在 M13mpl 载 体 中 ， 间 隔 区 内 的 Hae 位 点 插 入 了 一 小 段 大 肠 杆 菌 DNA ， 引 入laz的 互 补 筛 选 。 3） M13载 体 系 列 M13载 体 系 列 的 命 名 ： M13mpn， n代 表 系 列 数 字 。 对 M13mp1的 改 进 ： 加 上 常 用 的 酶 切 位 点 。 如 B. Gronenborn和 J. Messing1978年 把 LacZ 5端 的 第 13个 核 苷 酸 G突 变 成 A， 产 生 了 一 个 EcoR I切点 ， 构 建 成 M13mp2。 对 M13mp2的 进 一 步 改 进 产 生 了 M13mp系 列 载 体 。 在 M13mp2的 LacZ的 5端加 上 一 段 人 工 合 成 的 多 克 隆 位 点 （ MCS） 。 如 M13mp7、 M13mp8、 M13mp9、 M13mp10、 M13mp11、 M13mp18、 M13mp19。4） M13mpl8 和 M13mpl9M13mpl8 和 M13mpl9 这 两 个 载 体 含 有 13 个 不 同 的 酶 切 位 点 ， 可 供 插 入 由 多 种各 不 相 同 的 限 制 酶 切 割 而 成 的 DNA 片 段 。 M13mpl8 和 M13mpl9 DNA 的 全 序列 已 经 测 定 完 成 ， 这 两 种 载 体 只 是 在 lacZ区 内 不 对 称 的 多 克 隆 区 的 方 向 上 有 所不 同 。M13mpl8 和 M13mpl9 轻 易 不 能 重 新 环 化 。 仅 当 连 接 混 合 液 中 含 有 带 匹 配 末 端 的 外 源 双 链 DNA片 段 时 ， 方 可 闭 合 成 环 。 这 一 片 段 在 M13mpl8 和 M13mpl9 中将 以 两 个 互 为 相 反 的 方 向 插 入 。 这 样 一 来 ， 在 M13mpl8 重 组 体 的 子 代 噬 菌 体 内含 有 外 源 DNA 的 一 条 链 ， M13mpl9 重 组 体 的 子 代 噬 菌 体 内 则 含 有 它 的 互 补 链。 故 用 M13mpl8 和 M13mpl9 作 为 一 对 载 体 ， 就 可 能 用 一 个 引 物 ， 从 所 插 入 DNA 片 段 的 任 一 端 开 始 ， 测 定 互 为 相 反 的 两 条 链 的 DNA 序 列 ， 并 可 制 备 只 与 外源 DNA 的 任 意 一 条 链 互 补 的 DNA 探 针 。 M13mp1M13 RFBsuI不 完 全 消 化各 种 长 度 的 线 性 片 断（ 其 中 应 有 只 在 IG上 切 开 的线 性 全 长 M13） E.coli lac基 因 的 HindII片 断 (lacI、 lacP、lacO、 lacZ）JM101宿 主只 有 在 IG区 插 入 lacZ才 能 存 活 并 在 Xgal上 出 现 互 补 的 蓝 噬 菌 斑 4. M13系 列 载 体 的 优 点 ：（ 1） 有 MCS， 便 于 克 隆 不 同 的 酶 切 片 段 。（ 2） Xgal显 色 反 应 ， 可 供 直 接 选 择 。（ 3） 无 包 装 限 制 ， 克 隆 能 力 大 。（ 4） 可 以 克 隆 双 链 DNA分 子 中 的 每 一 条 链 （ 子 代 M13噬 菌 体 中 包 含 的 是 单 连+DNA） 。5. M13载 体 的 缺 点 ：（ 1） 插 入 外 源 DNA后 ， 遗 传 稳 定 性 显 著 下 降 。（ 2） 实 际 克 隆 能 力 小 于 1500bp（ 虽 无 包 装 限 制 ， 并 非 无 限 包 装 ） 。 五 、 COS质 粒 载 体cosmid 是 英 文 cos site-carrying plasmid 的 缩 写 , 也 称 粘 粒 、 柯 斯 载 体 。 本 意 是 带 有 粘性 末 端 位 点 的 质 粒 , 因 此 , 柯 斯 质 粒 是 人 工 建 造 的 的 含 有 DNA的 cos序 列 和 质 粒 复 制 子 的特 殊 类 型 的 质 粒 载 体 。1. 结 构 特 点 ： 在 普 通 质 粒 载 体 中 插 入 一 个 或 两 个 来 自 的 cos位 点 片 段 ， 双 cos载 体 比 单 cos载 体 易 于 重 组 ， cos结 构 长 200 bp， 由 以 下 几 个 亚 单 位 组 成 ：a. cosN末 端 酶 的 gpA亚 基 识 别 和 切 割 ， 产 生 5-12 nt突 起 ；b. cosB分 别 位 于 cosN的 两 侧 ， 称 之 为 cosBL（ 左 侧 ） 和 cosBR（ 右 侧 ） ， 为 末 端 酶 的 结合 位 点 。 Cos B CosN R3 I1 R2 R1 Nu1 +200-80 优 点 ：1、 容 量 大 （ 可 达 45 kb） ， 用 于 基 因 簇 的 克 隆 ；2、 形 成 的 重 组 DNA分 子 可 进 行 体 外 包 装 ， 并 能 感 染 E.coli细 胞 （ 在 细 胞 内 不 能 形 成 噬 菌体 颗 粒 ， 因 而 不 能 形 成 噬 菌 斑 ） ；3、 操 作 简 便 ， 可 直 接 转 化 细 胞 ；4、 对 重 组 DNA分 子 长 度 具 有 选 择 性 包 装 ；遗 传 标 记 ： 与 质 粒 载 体 相 同 ， 利 用 抗 生 素 抗 性 选 择 转 化 子 ， 例 子 : pJB8和 C2XB 六 、 噬 菌 粒 载 体 （ phagemid vectors）噬 菌 粒 （ phagemid） 实 际 上 是 带 有 丝 状 噬 菌 体 大 间 隔 区 的 质 粒 载 体 ， 是 集 质粒 和 丝 状 噬 菌 体 的 有 利 特 征 于 一 身 的 载 体 ， 具 有 ColE1 复 制 起 点 及 抗 生 素 抗 性选 择 标 记 的 质 粒 ， 以 及 丝 状 体 噬 菌 体 的 间 隔 区 。 此 间 隔 区 含 噬 菌 体 DNA 合 成的 起 始 与 终 止 及 噬 菌 体 颗 粒 形 态 发 生 所 必 需 的 全 部 顺 式 作 用 序 列 。 含 噬 菌 粒 的细 菌 被 噬 菌 体 感 染 后 ， 基 因 蛋 白 可 作 用 于 噬 菌 粒 的 间 隔 区 ， 启 动 滚 环 复 制产 生 ssDNA 并 进 行 包 装 。噬 菌 粒 具 有 以 下 特 征 ： 双 链 DNA 既 稳 定 ， 又 高 产 ， 具 有 常 规 质 粒 的 特 征 ； 免 却 了 将 外 源 DNA 片 段 从 质 粒 亚 克 隆 于 噬 菌 体 载 体 这 一 既 繁 琐 又 费 时 的 步骤 ； 由 于 载 体 足 够 小 ， 故 可 得 到 长 达 10kb 的 外 源 DNA 区 段 的 单 链 ； 两 种 复 制 形 式 ： 既 具 有 质 粒 的 复 制 起 点 ， 又 具 有 噬 菌 体 的 复 制 起 点 。 因 此 ， 既 能 在 大 肠 杆 菌 中 以 质 粒 的 形 式 双 链 复 制 ， 又 能 在 噬 菌 体 内 进 行 单 链 复 制 。 噬 菌 粒 的 主 要 优 点 在 于 它 可 以 产 生 大 段 外 源 DNA的 适 量 单 链 拷 贝 ， 又 不 必 担心 发 生 缺 失 突 变 ， 而 这 些 外 源 DNA区 段 常 常 由 于 太 大 而 不 能 克 隆 于 常 规 M13载 体 。 但 许 多 噬 菌 粒 都 有 一 个 主 要 缺 点 ， 即 辅 助 噬 菌 体 感 染 后 ， 有 时 候 单 链 DNA 的 产 量 较 低 且 重 复 性 较 差 。 第 三 节 人 工 染 色 体 载 体酵 母 人 工 染 色 体 （ yeast artificial chromosome, YAC)： YAC人 工 染 色 体 载 体 是 利 用 酿 酒 酵母 （ Saccharomycescerevisiae） 的 染 色 体 的 复 制 元 件 构 建 的 载 体 ， 其 工 作 环 境 也 是 在酿 酒 酵 母 中 。 A.W.Murray 1983年 形 成 YAC构 建 理 论 , D.T.Burke等 1987年 变 为 现 实 。 酿酒 酵 母 的 形 态 为 扁 圆 形 和 卵 形 ， 生 长 的 代 时 为 90 分 钟 ； 含 16 条 染 色 体 ， 每 条 的 大 小 为 225-1900kb； 具 真 核 mRNA 的 加 工 活 性 。 （ 1） DNA复 制 起 始 点 （ ori）（ 2） 着