基因工程的基本操作程序

基 因 工 程 的 基 本 操 作 程 序 原 核 细 胞 的 基 因 结 构原 核 细 胞 基 因 编 码 区 （ 编 码 序 列 ） ： 能 指 导 有 关 蛋 白 质 的合 成 ， 即 能 够 编 码 蛋 白 质非 编 码 区 （ 调 控 序 列 ） ： 位 于 编 码 区 上 游 和编 码 区 下 游 的 DNA序 列 ， 虽 不能 指 导 有 关 蛋 白 质 的 合 成 ， 但有 调 控 遗 传 信 息 表 达 的 核 苷 酸 序 列 ， 如 启 动 子 、 终 止 子 等 原 核 细 胞 的 基 因 结 构 RNA聚 合 酶 的 作 用 是 催 化 DNA转 录 为 RNA。它 能 够 识 别 调 控 序 列 中 的 结 合 位 点 ， 并 与 其 结 合 。转 录 开 始 后 ， RNA聚 合 酶 沿 DNA分 子 移 动 ， 并与 DNA分 子 的 一 条 链 为 模 板 合 成 RNA。 真 核 细 胞 的 基 因 结 构与 原 核 细 胞 比 较 ， 真 核 细 胞 基 因 结 构 的 主 要 特 点 是 ： 编 码 区 是 间 隔 的 、 不 连 续 的 。 也 就 是 说 ， 能 够 编 码蛋 白 质 的 序 列 被 不 能 够 编 码 蛋 白 质 的 序 列 分 隔 开 来 ， 成为 一 种 断 裂 的 形 式 。 其 中 ， 能 够 编 码 蛋 白 质 的 序 列 叫 做 外 显 子 ， 一 般 不能 够 编 码 蛋 白 质 的 序 列 叫 做 内 含 子 。 真 核 细 胞 的 基 因 结 构真 核 细 胞 基 因 编 码 区（ 间 隔 、 不 连 续 ） 外 显 子 ： 能 编 码 蛋 白 质的 DNA序 列内 含 子 ： 不 能 编 码 蛋 白质 的 DNA序 列非 编 码 区 ： 与 原 核 生 物 具 有 相 似 功 能 的 启动 子 、 终 止 子 原 核 细 胞 与 真 核 细 胞 的 基 因 结 构 比 较原 核 细 胞 真 核 细 胞不 同 点 编 码 区 是连 续 的 编 码 区 是 间 隔的 、 不 连 续 的相 同 点 都 由 能 够 编 码 蛋 白 质 的 编码 区 和 具 有 调 控 作 用 的 非编 码 区 组 成 的 基 因 的 种 类（ 1） 编 码 蛋 白 质 的 基 因 ： 包 括 结 构 基 因 和调 节 基 因 。（ 2） 没 有 转 译 产 物 的 基 因 ： 如 rRNA基 因和 tRNA基 因 。（ 3） 不 能 转 录 的 DNA片 段 ： 如 操 纵 基 因 。 启 动 子 与 终 止 子 启 动 子 是 在 非 编 码 区 内 紧 靠 转 录 起 点 ，调 控 遗 传 信 息 表 达 的 脱 氧 核 苷 酸 序 列 ， 它能 引 导 RNA聚 合 酶 与 正 确 的 基 因 部 位 结 合 ，使 转 录 从 起 点 开 始 ， 沿 编 码 区 进 行 。 终 止 子 是 在 非 编 码 区 内 紧 靠 转 录 终 点 ，调 控 遗 传 信 息 表 达 的 脱 氧 核 苷 酸 序 列 ， 它能 阻 碍 RNA聚 合 酶 的 移 动 ， 并 使 其 从 DNA模 板 链 上 脱 离 下 来 ， 使 转 录 终 止 。 基 因 工 程 的 基 本 操 作 流 程 基 因 组 文 库 和 部 分 基 因 文 库基 因 组 文 库部 分 基 因 文 库 基 因 组 文 库 和 部 分 基 因 文 库 cDNA合 成 过 程 n 第 一 步 ， 反 转 录 酶 以 RNA为 模 板 合 成 一 条 与 RNA互补 的 DNA单 链 ， 形 成 RNA-DNA杂 交 分 子 。 n 第 二 步 ， 核 酸 酶 H使 RNA-DNA杂 交 分 子 中 的 RNA链 降 解 ， 使 之 变 成 单 链 的 DNA。n 第 三 步 ， 以 单 链 DNA为 模 板 ， 在 DNA聚 合 酶 的 作 用下 合 成 另 一 条 互 补 的 DNA链 ， 形 成 双 链 DNA分 子 。 利 用 PCR技 术 扩 增 目 的 基 因 原 理 :DNA双 链 复 制前 提 :要 有 一 段 已 知目 的 基 因 的 脱氧 核 苷 酸 序 列 ，以 便 合 成 引 物 。 获 取 目 的 基 因n从 基 因 文 库 中 获 取n利 用 PCR技 术 扩 增n利 用 化 学 方 法 人 工 合 成 构 建 表 达 载 体表 达 载 体 的 组 成1. 目 的 基 因2. 启 动 子3. 终 止 子4. 标 记 基 因 基 因 工 程 载 体 的 构 建 需 要 考 虑 哪 些 因 素 （ 1） 基 因 的 特 点 ： 如 果 一 个 来 自 动 物 的 目 的 基 因 含 有 内含 子 ， 就 不 能 用 于 转 基 因 植 物 ， 因 为 动 物 中 内 含 子的 剪 接 系 统 与 植 物 的 不 同 ， 植 物 不 能 将 动 物 基 因 的内 含 子 剪 切 掉 ， 只 能 用 该 基 因 的 cDNA。 基 因 的 产物 如 果 是 一 个 糖 蛋 白 ， 那 么 该 基 因 在 原 核 生 物 细 菌中 表 达 出 来 的 蛋 白 就 可 能 不 具 备 天 然 状 态 下 的 活 性 ，因 为 糖 蛋 白 上 的 糖 链 是 在 内 质 网 和 高 尔 基 体 上 加 上的 ， 而 细 菌 无 这 些 细 胞 器 。（ 2） 要 选 择 强 启 动 子 或 组 织 特 异 性 启 动 子 。 启 动 子 有 强有 弱 ， 选 择 强 启 动 子 可 以 增 加 转 录 活 性 ， 使 基 因 产物 量 增 多 。 如 果 希 望 基 因 在 生 物 的 某 个 组 织 表 达 ，如 只 在 植 物 种 子 中 表 达 ， 就 要 选 择 种 子 中 特 异 表 达的 启 动 子 。（ 3） 要 有 选 择 标 记 基 因 ， 如 抗 生 素 基 因 ， 以 便 选 择 出 真 正 的 转 基 因 生 物 。 将 目 的 基 因 导 入 受 体 细 胞 （ 植 物 细 胞 ）农 杆 菌 转 化 法基 因 枪 法花 粉 管 通 道 法 将 目 的 基 因 导 入 受 体 细 胞 （ 动 物 细 胞 ）n 显 微 注 射 法 将 目 的 基 因 导 入 受 体 细 胞 （ 微 生 物 细 胞 ）n Ca2+处 理 目 的 基 因 的 检 测 与 鉴 定n 检 测 :n 是 否 插 入 目 的 基 因n 是 否 转 录n 是 否 翻 译n 鉴 定 :n 功 能 活 性 鉴 定n 抗 性 鉴 定 分 别 提 取 什 么 进 行 检 测 归 纳 步 骤 归 纳 : 基 因 工 程 的 基 本 操 作 程 序1. 获 取 目 的 基 因u 从 基 因 文 库u 利 用 PCRu 化 学 方 法 人 工 合 成2. 构 建 基 因 表 达 载 体u 目 的 基 因 、 启 动 子 、 终 止 子 、 标 记 基 因3. 将 目 的 基 因 导 入 受 体 细 胞u 农 杆 菌 转 化 法 、 显 微 注 射 法4. 目 的 基 因 的 检 测 与 鉴 定u 检 测 ： 是 否 插 入 、 转 录 、 翻 译 基 因 操 作 的 基 本 步 骤 基 因 操 作 的 基 本 步 骤