紫锥菊黄芪对鸡传染性法氏囊的影响

紫 锥 菊 、 黄 芪 对 鸡 传 染 性 法 氏囊 病 免 疫 调 控 及 相 关 性 研 究河 北 农 业 大 学倪 耀 娣 . 有利于防控动物病毒性疾病； 有利于遏制人兽共患病的传播； 有利于保障食品安全； 有利于人类社会和谐发展。 目 前 金 刚 烷 胺 、 病 毒 唑 禁 用 于 病 毒 性疾 病 ， 血 清 治 疗 也 有 一 定 危 险 ， 有 可 能带 来 了 其 他 的 疾 病 发 生 。 由 于 中 药 的 成分 较 复 杂 ， 使 得 病 原 对 某 一 单 一 成 分 不产 生 耐 药 性 ， 作 用 广 泛 ， 相 对 安 全 ， 因此 中 药 的 应 用 具 有 重 要 意 义 。 Echinacea 国 外 紫 锥 菊 属 原产 于 美 洲 的 一 类 菊科 野 生 花 卉 ， 是 多年 生 草 本 ， 头 状 花序 单 生 于 茎 或 枝 顶 ，花 朵 很 大 ， 色 彩 艳 丽 。 在 欧 洲 ， 以 紫 锥 菊 为 原 料 的 产 品 已 连 续 数年 占 据 年 销 量 第 一 的 位 置 。 紫 锥 菊 的 免 疫活 性 受 到 国 内 外 的 普 遍 重 视 ， 尤 其 在 德 国和 法 国 ， 紫 锥 菊 及 其 制 剂 已 成 为 家 庭 常 备药 。 目 前 在 欧 美 广 泛 应 用 于 药 品 、 营 养 补充 剂 和 保 健 食 品 。 黄 芪 为 豆 科 植 物 膜 荚 黄 芪 Astra-galus membranaceus(Fi-sch.) Bge.及 内 蒙 古 黄 芪 A.monghol-icus Bge.var. mongholicus(Bge.) Hsiao.的 根 。 生 用 或 蜜 炙 用 。 【 性 味 与 归 经 】 甘 ， 温 。 归 肺 、脾 经 。 【 功 能 】 补 气 升 阳 ， 益 卫 固 表 ，利 水 消 肿 ， 托 毒 排 脓 ， 敛 疮 生肌 。 黄 芪 对 正 常 机 体 的 抗 体 生成 功 能 有 明 显 促 进 作 用 。 黄 芪多 糖 对 创 伤 小 鼠 具 有 很 好 的 免疫 保 护 作 用 。 Radix astragali 7.1、 目 前 国 内 研 究 中 药 治 疗 病 毒 性疾 病 虽 然 不 少 ， 但 对 中 药 作 用 机 理 研究 不 多 ， 而 且 方 剂 多 半 都 是 很 多 中 药配 合 组 方 ， 实 际 操 作 很 麻 烦 。 引 种 紫锥 菊 及 其 成 分 能 否 作 为 免 疫 调 节 剂 原料 使 用 畜 禽 ， 还 缺 乏 相 关 的 实 验 研 究作 支 持 。 7.2 本 试 验 从 国 内 选 中 具 有 免 疫 增 强作 用 黄 芪 作 做 配 伍 ， 以 引 种 紫 锥 菊 为研 究 对 象 ， 并 与 中 药 方 剂 作 对 比 ， 对其 免 疫 调 节 作 用 的 机 理 及 物 质 基 础 进行 了 深 入 的 研 究 ， 以 期 为 开 发 利 用 引种 紫 锥 菊 资 源 提 供 翔 实 的 实 验 依 据 。 1 研 究 目 标 本 试 验 通 过 人 工 感 染 IBDV的 方 法 ， 对 试验 鸡 口 服 紫 锥 菊 、 黄 芪 合 剂 前 后 生 理 生 化及 免 疫 指 标 进 行 探 讨 ， 从 而 确 定 紫 锥 菊 、黄 芪 提 取 物 治 疗 鸡 法 氏 囊 病 的 确 切 预 防 治疗 效 果 ， 进 一 步 为 开 发 新 型 免 疫 增 强 剂 以及 中 药 广 泛 应 用 于 禽 病 毒 性 传 染 病 提 供 一定 的 理 论 依 据 。 2 研 究 内 容 紫 锥 菊 、 黄 芪 提 取 物 对 法 氏 囊 病 鸡 预 防 治 疗 的最 佳 剂 量 紫 锥 菊 、 黄 芪 提 取 物 对 法 氏 囊 病 鸡 免 疫 器 官 的影 响 紫 锥 菊 、 黄 芪 提 取 物 对 法 氏 囊 病 鸡 的 生 理 生 化指 标 的 影 响 紫 锥 菊 、 黄 芪 提 取 物 对 法 氏 囊 病 鸡 的 血 液 中 免疫 球 蛋 白 的 影 响 紫 锥 菊 、 黄 芪 提 取 物 对 法 氏 囊 病 鸡 的 组 织 间CD4+、 CD8+T淋 巴 细 胞 的 影 响 3 拟 解 决 的 关 键 性 问 题 （ 1） 病 理 模 型 的 建 立 （ 2） 法 氏 囊 病 毒 RNA的 提 取 及 确 定 （ 3） 紫 锥 菊 、 黄 芪 提 取 物 对 鸡 法 氏 囊 病 的治 疗 效 果 及 测 定 指 标 的 综 合 分 析 1 研 究 方 法 1.1 病 毒 的 传 代 1.2 建 立 病 理 模 型 1.2.1 IBDV的 EID50（ 鸡 胚 半 数 致 死 量 ） 的 测 定 1.2.2 人 工 感 染 病 理 模 型 的 建 立 1.2.3 发 病 标 准 判 断 1.3 实 验 动 物 分 组 及 处 理 1.4 紫 锥 菊 、 黄 芪 提 取 物 对 人 工 感 染 IBDV雏 鸡 发 病 率 和 死 亡率 的 影 响 1.5 用 物 理 方 法 测 定 免 疫 器 官 发 育 指 数 1,6 用 相 应 试 剂 盒 及 全 自 动 分 析 仪 测 定 血 液 生 理 生 化 指 标 1.7 用 比 浊 法 测 定 血 清 免 疫 球 蛋 白 含 量 1.8 采 用 免 疫 组 化 的 方 法 测 定 组 织 器 官 内 CD4+、 CD8+T淋巴 细 胞 的 含 量 2 技 术 路 线 病 毒 的 传 代 人 工 感 染 IBDV雏 鸡 模 型 的 建 立IBD发 病 率 、 死 亡 率 和免 疫 器 官 指 数 的 测 定免 疫器官指数的测定 发病率、死亡率的测定 外周血液中CD4+ 、CD8+ 的测定 组织器官中CD4+ 、CD8+ 的测定 免疫球蛋白IgM 、IgA 、IgG 的测定对 T、 B淋 巴 细 胞 的 影 响生 理 生 化 指 标 的 测 定 紫 锥 菊 、 黄 芪 提 取 物 对 人 工 感 染 IBDV雏 鸡 免 疫 功 能 的调 控 作 用 RT-PCR 检测病料组织中IBDV 谷草转氨酶，谷丙转氨酶、碱性磷酸酶 血清总蛋白、白蛋白含量测定 超氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶等 结 果 及 数 据 分 析 3 试 验 方 案 3.1病 毒 的 传 代 3.2 建 立 病 理 模 型 (1) IBDV的 EID50（ 鸡 胚 半 数 致 死 量 ） 的 测定（ 2） 人 工 感 染 病 理 模 型 建 立（ 3） 发 病 标 准 判 断（ 4） RT-PCR检 测 病 料 组 织 中 IBDV 3.3 试 验 动 物 分 组 及 处 理 （ 1） 将 试 验 用 雏 鸡 210只 随 机 分 为 组 ：紫 锥 菊 、 黄 芪 合 剂 高 、 中 、 低 剂 量 组 、中 药 方 剂 对 照 组 、 阳 性 对 照 组 、 攻 毒 对照 组 、 正 常 对 照 组 ， 每 组 30只 ， 隔 离 饲养 。 前 组 在 10日 龄 分 别 灌 服 相 应 的 药物 到 17日 龄 ， 前 组 于 20日 龄 点 眼 IBDV悬 液 （ 除 正 常 对 照 组 ） 进 行 攻 毒 。 分 组情 况 详 见 表 1 表 1 10日 龄 口 服 20日 龄 肌 肉 注 射 组 别 加 药 组Ml/只 生 理 盐 水ml/只 抗 IBDV蛋 黄抗 体 ml/只 中 药 方剂 ml/只 IBDV悬 液 ml/只 组 (紫 锥 菊 、 黄 芪 低 剂 量 ) 0.1ml (1g/ml) - - - 0.2 组 (紫 锥 菊 、 黄 芪 中 剂 量 ) 0.5ml (1g/ml) - - - 0.2 组 (紫 锥 菊 、 黄 芪 高 剂 量 ) 1ml (1g/ml) - - - 0.2 组 （ 方 剂 对 照 ） - - - 0.5ml (1g/ml) 0.2 组 （ 阳 性 对 照 ） - - 1.0 - 0.2 组 （ 攻 毒 对 照 组 ） - 1.0 - - 0.2 组 （ 正 常 对 照 组 ） - - - - - (2) 攻 毒 组 与 正 常 组 对 照 组 隔 离 饲 养 。 试验 结 束 时 ， 记 录 雏 鸡 死 亡 情 况 ， 计 算 死亡 率 及 成 活 率 。 然 后 分 别 采 血 ， 分 离 血清 ， 比 浊 法 检 测 血 清 免 疫 球 蛋 白 含 量 。处 死 雏 鸡 ， 取 胸 腺 ， 脾 脏 ， 法 式 囊 ， 称其 湿 重 ， 计 算 胸 腺 指 数 ， 脾 脏 指 数 。 3.4 紫 锥 菊 、 黄 芪 对 人 工 感 染 IBDV雏 鸡发 病 率 和 死 亡 率 的 影 响 3.5 免 疫 器 官 指 数 测 定 取 其 胸 腺 、 脾 脏 、 法 氏 囊 ， 称 重 并 计 算 其 免 疫 器 官 指 数 。 胸 腺 指 数 （ mg/g） 胸 腺 湿 重 （ mg） /体 重 （ g） 脾 腺 指 数 （ mg/g） 脾 脏 湿 重 （ mg） /体 重 （ g） 法 氏 囊 指 数 （ mg/g） 法 氏 囊 湿 重 （ mg） /体 重 （ g） 3.6 生 理 生 化 指 标 的 测 定 3.7 血 清 免 疫 球 蛋 白 含 量 测 定 抗 体 Ig G、 lg A、 Ig M试 剂 盒 ， 按 试 剂 盒 操 作 进 行 。 3.8 组 织 器 官 中 CD4+、 CD8+的 测 定 3.9 外 周 血 液 中 CD4+、 CD8+的 测 定 4 可 行 性 分 析 4.1掌 握 了 大 量 国 内 外 相 关 文 献 和 资 料 4.2 本 实 验 室 曾 进 行 过 该 类 研 究 ， 该 试 验所 采 用 的 方 法 均 比 较 成 熟 。 4.3 本 试 验 室 能 提 供 试 验 所 需 的 仪 器 设 备 。 4.4 本 项 目 是 石 家 庄 科 技 局 项 目 ， 有 足 够的 经 费 保 障 。 1. 研 究 分 析 紫 锥 菊 、 黄 芪 的 药 理 活 性 ， 确定 其 防 治 鸡 法 氏 囊 病 的 最 佳 剂 量 。 2. 详 细 探 讨 紫 锥 菊 、 黄 芪 作 为 免 调 节 剂 防治 鸡 传 染 性 法 氏 囊 病 的 作 用 机 制 。 3. 应 用 免 疫 组 化 分 析 紫 锥 菊 、 黄 芪 对 T细胞 亚 群 （ CD4+/CD8+） 的 影 响 。