干扰素制备的工艺流程

干 扰 素 制 备 的 工 艺 流 程 什 么 是 干 扰 素 ？v 概 念 (interferon,IFN)： 机 体 免疫 细 胞 产 生 的 一 类 细 胞 因 子 ， 是机 体 受 到 病 毒 感 染 时 ， 免 疫 细 胞通 过 抗 病 毒 应 答 反 应 而 产 生 的 一组 结 构 类 似 、 功 能 接 近 的 生 物 调节 蛋 白 。v 根 据 分 子 结 构 和 抗 原 性 的 差 异 分为 、 、 、 等 4个 类 型 。 干 扰 素 又 依 其 结 构 分 为 1b、 2a、 2b等 亚 型 其 区 别 在 于 个 别 氨 基 酸的 差 异 上 ， 早 期 干 扰 素 是 用病 毒 诱 导 人 白 血 球 产 生 的 ，产 量 低 、 价 格 昂 贵 ， 不 能 满足 需 要 ， 现 在 可 利 用 基 因 工程 技 术 并 在 大 肠 杆 菌 中 发 酵 、表 达 来 进 行 生 产 。 v 目 的 基 因 的 分 离克 隆 载 体 目 的 基 因 与 克 隆载 体 的 体 外 重 组 重 组 体 导 入 大 肠 杆 菌 K12 受 体 菌 的 培 养 及 筛 选 从 受 体 菌 中 获 取 目 的 基 因表 达 载 体 重 组 质 粒导 入 大 肠 杆 菌 受 体 菌 的 筛 选 ， 表 达 性 、 稳 定 性 等 检 测 工 程 菌 基 因 工 程 菌 的 制 备 一 、 目 的 基 因 的 分 离 与 获 得v 1. 设 计 合 成 干 扰 素 基 因 的 两 端 引 物 （ 完 全 的 ） ， 每 条 引 物内 或 5 -端 最 好 有 内 切 酶 酶 切 位 点 。v 2. 有 药 物 诱 导 细 胞 ， 如 佛 波 酯 ， 使 细 胞 表 达 干 扰 素 升 高 。v 3. 破 碎 细 胞 ， 提 取 细 胞 总 mRNA.v 4. 用 逆 转 录 试 剂 盒 逆 转 录 ， 把 总 mRNA逆 转 录 成 cDNAv 5. 以 cDNA为 模 板 、 干 扰 素 引 物 为 引 物 ， PCR， 得 到 完 全 的 干扰 素 基 因 的 PCR产 物 二 、 目 的 基 因 与 克 隆 载 体 进 行 体 外 重 组v 1. 提 取 载 体 （ 质 粒 、 病 毒 等 ） ， 双 酶 切 ， 再 把 干 扰 素 基 因的 PCR产 物 用 相 应 的 酶 酶 切 ， 用 连 接 酶 连 接EcoR I BamH IEcoR I BamH I 2.连 接 完 成 后 分 离 纯 化 ， 测 序 ， 与 原 干 扰 素 序 列 比 对 。 3.鉴 定 序 列 无 误 后 （ 无 义 突 变 也 行 ） ， 导 入 受 体 细 胞 ， 筛 选 三 、 重 组 体 引 入 宿 主 细 胞 将 cDNA克 隆 到 含 有 四 环 素 、 氨 苄 青 霉 素 抗 性 基 因 的 质粒 pBR322中 ， 转 化 到 大 肠 杆 菌 ， 重 组 的 载 体 DNA 分 子 在 一定 条 件 下 转 化 入 大 肠 杆 菌 ， 形 成 携 带 质 粒 的 菌 株 。 四 、 从 大 肠 杆 菌 k12获 取 目 的 基 因 由 于 质 粒 重 组 时 有 3种 基 本 方 式 ， 即 ： 目 的 基 因 与 克 隆 载 体重 组 ， 目 的 基 因 片 段 与 目 的 基 因 片 段 重 组 ， 克 隆 载 体 与 克 隆载 体 重 组 ； 另 外 重 组 过 程 可 能 会 发 生 基 因 突 变 情 况 v 流 程 ： 步 骤 一 ： 将 细 菌 涂 布 到 含 氨 苄 青 霉 素 的 培 养 基 上 培 养 ，就 可 得 到 质 粒 PBR322或 重 组 质 粒 的 细 菌 单 菌 落 。 v 步 骤 二 ： 步 骤 一 获 得 的 每 一 个 细 菌 单 菌 落 标 记 为 a、 b、c、 d等 ， 在 每 一 个 单 菌 落 中 挑 取 部 分 细 菌 转 涂 到 含 有 四 环 素的 培 养 基 上 ， 不 能 生 长 的 是 绝 大 部 分 含 有 重 组 质 粒 的 细 菌 及少 量 可 能 发 生 突 变 的 非 重 组 质 粒 的 细 菌 单 菌 落 。 原 因 ： 因 为PBR322含 有 抗 四 环 素 基 因 ， 重 组 质 粒 中 目 的 基 因 插 在 抗 四 环素 基 因 中 ， 使 其 结 构 破 坏 ， 失 去 抗 四 环 素 作 用 。 五 、 提 取 重 组 质 粒v 1、 对 上 一 步 获 得 含 目 的 基 因 的 大 肠 杆 菌 在 含 有 氯 霉 素 的 培养 基 中 扩 大 培 养 15h。 培 养 时 间 ： 前 人 实 验 证 实 大 肠 杆 菌 K12生 长 前 6h为 迟 缓 期 , 615. 5h为 对 数 增 时 期 , 15. 5 19. 5h为 稳 定 期 , 19. 5h后 为 衰 亡 期 。 氯 霉 素 ： 氯 霉 素 可 抑 制 宿主 的 蛋 白 质 合 成 ， 结 果 阻 止 了 细 菌 染 色 体 的 复 制 ， 然 而 ， 松弛 型 质 粒 仍 可 继 续 复 制 。v 2、 细 菌 的 收 获 和 裂 解 ） 用 合 适 转 头 于 4 以 4000转 /分 离 心 15分 钟 ， 弃 上 清 ， 敞开 离 心 管 口 并 倒 置 离 心 管 使 上 清 全 部 流 尽 。 v ） 将 细 菌 沉 淀 重 悬 于 100ml用 冰 预 冷 的 STE中 。STE0.1mol/L NaCl10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)1mmol/L EDTA(pH8.0)按 步 骤 ） 所 述 方 法 离 心 ， 以 收 集 细 菌 细 胞 。v 3、 碱 裂 解 法 ） 将 冼 过 的 500ml 培 养 物 的 细 菌 沉 淀 物 来 自 收 获 细 菌 的步 骤 3 重 悬 于 10ml（ 18ml） 溶 液 中 。溶 液 :50mmol/L葡 萄 糖25mmol/L Tris.Cl(pH8.0)10mmol/L EDTA(pH8.0)溶 液 可 成 批 配 制 ， 在 10 lbf/in2(6.895x104Pa)高 压 下 蒸气 灭 菌 15分 钟 ， 贮 存 于 。 v ） 加 1ml(2ml)新 配 制 的 溶 菌 酶 溶 液 10mg/ml,溶 于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)。 当 溶 液 的 pH值 低 于 8.0时 ， 溶菌 酶 不 能 有 效 工 作 。 ） 加 20ml(40ml)新 配 制 的 溶 液 。溶 液 :0.2mol/L NaOH(临 用 前 用 10mol/L贮 存 液 现 用 现 稀 释 ）1 SDS盖 紧 瓶 盖 ， 缓 缓 颠 倒 离 心 瓶 数 次 ， 以 充 分 混 匀 内 容 物 。 于 室温 放 置 5-10分 钟 。v ） 加 15nl(20ml)用 冰 预 冷 的 溶 液 。溶 液 :5mol/L乙 酸 钾 60ml冰 乙 酸 11.5ml水 28.5ml v 所 配 成 的 溶 液 对 钾 是 mol/L， 对 乙 酸 根 是 5mol/L。封 住 瓶 口 ， 摇 动 离 心 瓶 数 次 以 混 匀 内 容 物 ， 此 时 应 不 再 出 现分 明 的 两 个 液 相 。 置 冰 上 放 10分 钟 ， 应 形 成 一 白 色 絮 状 沉 淀 。于 0 放 置 后 所 形 成 的 沉 淀 应 包 括 染 体 DNA、 高 分 子 量 RNA和钾 SDS 蛋 白 质 膜 复 合 物v ） 用 合 适 转 头 于 4 以 4000转 /分 离 心 15分 钟 ， 不 开 刹 车 而使 转 头 自 然 停 转 。 如 果 细 菌 碎 片 贴 壁 不 紧 ， 可 以 5000转 /分再 度 离 心 20分 钟 ， 然 后 尽 可 能 将 上 清 全 部 转 到 另 一 瓶 中 ，弃 去 残 留 在 离 心 管 内 的 粘 稠 状 液 体 。 未 能 形 成 致 密 沉 淀 块 的原 因 通 常 是 由 于 溶 液 与 细 菌 裂 解 物 混 合 不 充 分 v ） 上 清 过 滤 至 一 250ml离 心 瓶 中 ， 加 0.6体 积 的 异 丙 醇 ， 充分 混 匀 ， 于 室 温 放 置 10分 钟 。v ） 用 合 适 转 头 于 室 温 以 500转 /分 离 心 15分 钟 ， 回 收 核 酸 。如 于 4 离 心 ， 盐 也 会 了 生 沉 淀 。v ） 小 心 倒 掉 上 清 ， 敞 开 瓶 口 倒 置 离 心 瓶 使 残 余 上 清 液 流 尽 ，于 室 温 用 70 乙 醇 洗 涤 沉 积 管 壁 。 倒 出 乙 醇 ， 用 与 真 空 装 置相 联 的 巴 期 德 吸 出 附 于 瓶 壁 的 所 有 液 滴 ， 于 室 温 将 瓶 倒 置 放在 纸 巾 上 ， 使 最 后 残 余 的 痕 量 乙 醇 挥 殆 尽 。v ） 用 3ml TE(pH8.0)溶 解 核 酸 沉 淀 。v 10） 纯 化 。 六 、 质 粒 DNA的 纯 化v （ 一 ） 聚 乙 二 醇 沉 淀 法 提 取 质 粒 ） 将 核 酸 溶 液 所 得 转 入 15ml orex 管 中 ， 再 加 3ml 用 冰 预 冷 的5mol/L LiCl溶 液 ， 充 分 混 匀 ， 用 合 适 转 头 于 下 以 10 000转 /分 离 心10分 钟 。 LiCl可 沉 淀 高 分 子 RNA。 ） 将 上 清 转 移 到 另 一 30mlCorex管 内 ， 加 等 量 的 异 丙 醇 ， 充 分 混 匀 ， 用 SorvallSS34转 头 （ 或 与 其 相 当 的 转 尖 ） 于 室 温 以 10 000转 /分 离 心 10分 钏 ， 回 收 沉 淀 的 核 酸 。 ） 小 心 去 掉 上 清 ， 敞 开 管 口 ， 将 管 倒 置 以 使 最 后 残 留 的 液 滴 流 尽 。 于室 温 用 70 乙 醇 洗 涤 沉 淀 及 管 壁 ， 流 尽 乙 醇 ， 用 与 真 空 装 置 相 连 的 巴 其德 吸 管 吸 去 附 于 管 壁 的 所 有 液 滴 ， 敞 开 管 口 并 将 管 侄 置 ， 在 纸 巾 上 放 置几 分 钟 ， 以 使 最 后 残 余 的 痕 量 乙 醇 蒸 发 殆 尽 。 ） 用 500 l含 无 DNA酶 的 胰 RNA酶 (20 g/ml ） 的 TE（ pH8.0） 溶 解 沉 淀 ，将 溶 液 转 到 一 微 量 离 心 管 中 ， 于 室 温 放 置 30分 钟 。 v ） 加 500 l含 13 （ w/v)聚 乙 二 醇 （ PEG 8000） 的1.6mol/L NaCl,充 分 混 合 ， 用 微 量 离 心 机 于 以12000g离 心 分 钟 ， 以 回 收 质 粒 。 ） 吸 出 上 清 ， 用 400 l TE(pH8.0)溶 解 质 粒 DNA沉 淀 。用 酚 、 酚 ： 氯 仿 、 氯 仿 各 抽 次 。 ） 将 水 相 转 到 另 一 微 量 离 心 管 中 ， 加 100 l 10mol/L乙 醇 铵 ， 充 分 混 匀 ， 加 倍 体 积 （ 约 1ml） 乙醇 ， 于 室 温 放 置 10分 钟 ， 于 4 以 12 000g离 心 5分 钟 ，以 回 收 沉 淀 的 质 粒 。 ） 吸 去 上 清 ， 加 200 l处 于 4 以 12 000g离 心 2分 钟 。 ） 吸 去 上 清 ， 敞 开 管 口 ， 将 管 置 于 实 验 桌 上 直 到 最后 可 见 的 痕 量 乙 醇 蒸 发 殆 尽 。10） 用 500 l TE（ pH8.0） 溶 解 沉 淀 1:100稀 释 用 TE（ pH8.0) 后 测 量 OD 260， 计 算 质 粒 DNA的 浓 度（ 1OD260 50 g质 粒 DNA/ml） ， 然 后 将 DNA贮 于 20 。 七 、 对 重 组 质 粒 的 检 测 与 目 的 基 因 提 取v 目 的 基 因 获 取v 对 获 得 的 质 粒 进 行 双 酶 切 ， 获 得 目 的 基 因 与 PBR322质 粒 片段 ， 通 过 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 ， 由 于 目 的 基 因 与 PBR322质 粒 片段 相 对 分 子 量 不 同 ， 在 电 泳 过 程 中 产 生 不 同 的 条 带 ， 通 过 与已 知 基 因 长 度 的 对 比 ， 我 们 可 以 选 出 相 应 的 目 的 基 因 ， 接 着利 用 Qiagen纯 化 柱 回 收 纯 化 DNA。 具 体 ： 用 3倍 体 积 的 特 殊高 盐 溶 液 于 55 融 化 带 有 目 的 基 因 的 DNA片 段 的 琼 脂 糖 凝 胶块 ， 将 DNA释 放 到 水 溶 液 中 。 然 后 将 其 通 过 Qiagen纯 化 柱 ，经 过 如 图 结 合 洗 涤 洗 脱 步 骤 ， 直 接 得 到 纯 化 的 DNA样 品 。 v 利 用 核 酸 探 针 杂 交 法 鉴 定 目 的 基 因 八 、 目 的 基 因 与 表 达 载 体 的 组 合 与 导 入v 表 达 载 体 ： PBV220,， 将 PBV220和 目 的 基 因 用 双 酶 切 法 处 理 ，退 火 后 连 接 ， 构 建 重 组 质 粒 ， 利 用 CaCl2法 导 入 到 宿 主 大 肠杆 菌 中 ， 构 建 工 程 菌 ， 在 培 养 基 中 培 养 ， 利 用 干 扰 素 性 质 鉴定 目 的 工 程 菌 ， 分 离 工 程 菌 ， 扩 大 培 养 ， 提 取 出 质 粒 ， 分 析质 粒 稳 定 性 。 干 扰 素 的 发 酵 工 艺 过 程启 开 种 子 制 备 种 子 液 发 酵 培 养 粗 提 精 提 半 成 品 制 备 半 成 品 检 定 分 装 冻 干 成 品 检 定 成 品 包 装 v 1 菌 种 制 备 取 70 下 保 存 的 甘 油 管 菌 种 （ 工 作 种子 批 ） ， 于 室 温 下 融 化 。 然 后 ， 接 入 摇 瓶 ， 培 养 温 度 30 ，pH7.0， 250 r/min活 化 培 养 18 2小 时 后 ， 进 行 吸 光 值 测 定和 发 酵 液 杂 菌 检 查 。v 2 种 子 罐 培 养 将 已 活 化 的 菌 种 接 入 装 有 30L培 养 基 的种 子 罐 中 ， 接 种 量 10%， 培 养 温 度 30 ， pH7.0， 级 联 调 节 通气 量 和 搅 拌 转 速 ， 控 制 溶 解 氧 为 30%， 培 养 3 4小 时 ， 转 入发 酵 罐 中 ， 同 时 取 样 发 酵 液 进 行 显 微 镜 检 查 和 LB培 养 基 划 线检 查 ， 控 制 杂 菌 v 3.发 酵 罐 培 养 将 种 子 液 通 入 300L培 养 基 的 发 酵 罐 中 ， 接种 量 10%， 培 养 温 度 30 ， pH7.0。 级 联 调 节 通 气 量 和 搅 拌 转速 ， 控 制 溶 解 氧 30%， 培 养 4小 时 。 然 后 控 制 培 养 温 度 20 ，pH6.0， 溶 解 氧 60%， 继 续 培 养 5 6.5小 时 。 同 时 进 行 发 酵 液杂 菌 检 查 ， 当 OD值 达 9.0 1.0后 ， 用 5 冷 却 水 快 速 降 温 至15 以 下 ， 以 减 缓 细 胞 衰 老 。 或 者 将 发 酵 液 转 入 收 集 罐 中 ，加 入 冰 块 使 温 度 迅 速 降 至 10 以 下 。v 4. 菌 体 收 集 将 已 降 温 的 发 酵 液 转 入 连 续 流 离 心 机 ，16000 r/min离 心 收 集 。 进 行 干 扰 素 含 量 、 菌 体 蛋 白 含 量 、菌 体 干 燥 失 重 、 质 粒 结 构 一 致 性 、 质 粒 稳 定 性 等 项 目 的 检 测 。菌 体 于 20 冰 柜 中 保 存 时 ， 不 得 超 过 12个 月 。 每 保 存 3个月 ， 检 查 一 次 活 性 。 干 扰 素 发 酵 过 程 控 制v 在 假 单 孢 杆 菌 的 发 酵 生 产 中 ， 菌 体 在 培 养 1.5小 时 分 裂速 度 最 快 ， 到 3.5小 时 开 始 下 降 。 而 干 扰 素 的 迅 速 合 成 出 现在 3.5小 时 之 后 ， 在 4小 时 达 到 最 大 ， 然 后 由 于 降 解 而 迅 速 下降 。 可 见 在 发 酵 生 产 工 艺 中 ， 假 单 孢 杆 菌 的 生 长 和 干 扰 素 的生 产 基 本 处 于 不 相 关 状 态 ， 可 采 用 两 段 培 养 的 策 略 进 行 过 程控 制 。 v (1) 溶 解 氧 控 制 分 别 在 生 长 阶 段 和 生 产 阶 段 采 用 各 自最 佳 溶 解 氧 浓 度 ， 以 期 提 高 干 扰 素 的 发 酵 水 平 。 通 过 级 联 调节 通 气 量 和 搅 拌 转 速 得 以 实 现 。v (2). 温 度 控 制 假 单 孢 杆 菌 生 长 最 适 温 度 与 产 物 形 成最 适 温 度 是 不 同 的 。 产 物 合 成 温 度 控 制 在 20 可 以 有 效 防 止干 扰 素 - 2b的 降 解 ， 而 其 最 佳 生 长 温 度 则 为 30 。 质 粒 的稳 定 性 随 温 度 的 升 高 而 迅 速 下 降 ， 因 此 在 培 养 后 期 降 温 可 以减 少 目 标 产 物 的 降 解 ， 增 加 质 粒 的 稳 定 性 。v (3) pH值 发 酵 过 程 中 ， pH的 变 化 由 工 程 菌 的 代谢 、 培 养 基 的 组 成 和 发 酵 条 件 所 决 定 。 干 扰 素 - 的 等 电 点在 pH 6.0附 近 ， 在 低 酸 性 条 件 下 稳 定 ， 能 耐 受 pH 2.5的 酸 性环 境 。 因 此 可 在 发 酵 后 期 降 低 pH， 从 而 造 成 大 量 蛋 白 酶 失 活 ，减 少 干 扰 素 - 的 水 解 ， 提 高 干 扰 素 的 积 累 量 。 半 成 品 检 定v （ 1） 效 价 测 定 用 细 胞 病 变 抑 制 法 ， 以 Wish细 胞 、 VSV病 毒 为 基 本 检 测系 统 ， 测 定 中 必 须 用 国 家 或 国 际 参 考 品 校 准 为 国 际 单 位 。v （ 2） 蛋 白 质 含 量 测 定v 福 林 -酚 法 ， 以 中 国 药 品 生 物 制 品 检 定 所 提 供 的 标 准 蛋白 为 标 准 。v （ 3） 比 活 性v 效 价 的 国 际 单 位 与 蛋 白 质 含 量 的 毫 克 数 之 比 。v （ 4） 纯 度 v 电 泳 纯 度 用 非 还 原 型 SDS-PAGE法 ， 银 染 显 色 应 为 单 一区 带 ， 经 扫 描 仪 测 定 纯 度 应 在 95%以 上 。 v （ 5） 相 对 分 子 量 测 定v 还 原 型 SDS-PAGE， 加 样 量 不 地 域 微 克 ， 同 时 用 已 知 相对 分 子 量 的 蛋 白 标 准 系 列 做 对 照 ， 以 迁 移 率 为 横 坐 标 ， 相 对分 子 量 的 对 数 为 纵 坐 标 作 图 ， 计 算 相 对 分 子 量 。 与 理 论 值 比较 ， 误 差 不 得 高 于 10%。v （ 6） 残 余 外 源 性 DNA含 量 测 定v 用 放 射 性 核 素 或 生 物 素 探 针 法 测 定 ， 每 剂 量 中 残 余 外源 性 DNA应 低 于 100pg。v （ 7） 残 余 血 清 IgG含 量 测 定v 在 应 用 抗 体 亲 和 层 析 法 作 为 纯 化 方 法 时 必 须 进 行 此 项检 定 。v （ 8） 残 余 抗 生 素 活 性 测 定 v 半 成 品 中 不 应 有 抗 生 素 活 性 存 在 。 v （ 9） 紫 外 光 谱 扫 描v 检 查 半 成 品 的 光 谱 吸 收 值 ， 最 大 吸 收 值 应 在 280 2纳米 。v （ 10） 肽 图 测 定v 用 CNBr裂 解 法 ， 测 定 结 果 应 符 合 干 扰 素 的 结 构 ， 且 批与 批 之 间 应 一 致 。v （ 11） 等 电 点 测 定 等 电 聚 焦 电 泳 。v （ 12） 除 菌 半 成 品 应 做 干 扰 素 效 价 测 定 、 无 菌 试 验 和 热 源 质试 验 。 成 品 检 定v （ 1） 物 理 性 状v 冻 干 品 白 色 或 微 黄 色 疏 松 体 ， 加 入 注 射 水 后 不 得含 有 肉 眼 可 见 不 溶 物 。v （ 2） 鉴 别 试 验v 应 用 ELISA或 中 和 试 验 检 定 。v （ 3） 水 分 测 定v 用 卡 氏 法 ， 应 低 于 3%。v （ 4） 无 菌 试 验 v 同 半 成 品 。 v （ 5） 热 原 质 试 验v 同 半 成 品 检 定 。v v （ 6） 干 扰 素 效 价 测 定v 同 半 成 品 检 定 ， 效 价 不 应 低 于 标 示 量 。v （ 7） 安 全 试 验v 取 体 重 为 350-400克 豚 鼠 3只 ， 每 只 腹 侧 皮 下 注 射量 为 成 人 每 千 克 体 重 临 床 使 用 最 大 量 的 3倍 ， 观 察 7天 ， 若 豚鼠 局 部 无 红 肿 、 坏 死 、 总 体 重 不 下 降 ， 说 明 成 品 合 格 。 取 体 重 18-20克 小 鼠 5只 ， 每 只 尾 静 脉 注 射 剂 量 按 人每 千 克 体 重 临 床 使 用 最 大 量 的 3倍 ， 观 察 7天 ， 若 动 物 全 部 存活 ， 说 明 成 品 合 格 。 1.目 的 基 因 的 获 取 为 什 么 用 mRNA而 不 是 DNA？v 基 因 组 ， 即 某 种 生 物 一 个 细 胞 内 全 部 的 DNA信 息 。v 将 这 些 DNA打 断 ， 连 接 到 载 体 上 并 转 入 微 生 物 ， 使 这 些 微 生 物 细 胞 内 含有 某 生 物 的 全 部 基 因 组 。 那 么 这 些 微 生 物 就 组 成 了 基 因 组 文 库 。v 以 上 两 者 包 含 的 都 是 遗 传 信 息 。 对 于 某 种 生 物 来 说 ， 任 何 一 个 细 胞 的 遗传 信 息 都 是 相 同 的 。v cDNA是 由 细 胞 内 的 mRNA通 过 逆 转 录 的 方 式 获 得 的 ， 其 包 含 的 一 个 细胞 内 的 表 达 信 息 。 多 细 胞 生 物 的 不 同 细 胞 的 表 达 信 息 往 往 是 不 同 的 。 若将 某 一 个 细 胞 全 部 的 mRNA（ 又 称 为 这 个 细 胞 的 转 录 组 ） 都 逆 转 录 成cDNA， 再 将 这 些 cDNA连 接 到 载 体 上 （ 基 本 上 不 打 断 ） 并 转 入 微 生 物 ，那 么 这 些 微 生 物 就 组 成 了 cDNA文 库 。 v 简 单 来 说 ， 基 因 组 是 分 子 ， 基 因 组 文 库 是 表 示 遗 传 信 息 的 微 生 物 ，cDNA文 库 是 表 示 表 达 信 息 的 微 生 物 。 2、 选 择 大 肠 杆 菌 作 为 宿 主 细 胞 的 原 因 ：v 第 一 ,大 肠 杆 菌 是 一 种 常 见 菌 种 .人 们 对 其 细 胞 形 态 及 生 理 生 化 特 性 已 经 了解 比 较 深 入 ,对 于 培 养 基 配 制 与 运 载 体 导 入 的 具 体 技 术 等 方 面 也 就 更 容 易把 握 .v 第 二 ,细 菌 质 粒 (游 离 于 细 菌 等 微 生 物 细 胞 质 中 的 小 型 环 状 DNA分 子 )是基 因 工 程 常 用 的 运 载 体 (与 目 的 基 因 结 合 的 工 具 ),而 大 肠 杆 菌 质 粒 又 是 最常 用 的 质 粒 ,因 为 大 肠 杆 菌 质 粒 上 有 诸 如 抗 青 霉 素 基 因 等 易 于 检 测 的 标 记基 因 ,并 且 容 易 使 目 的 基 因 在 宿 主 细 胞 中 复 制 和 表 达 .而 最 适 合 大 肠 杆 菌 质粒 完 成 使 命 的 场 所 当 然 就 是 它 的 天 然 来 源 大 肠 杆 菌 .v 第 三 ,大 肠 杆 菌 是 一 种 典 型 兼 性 厌 氧 行 细 菌 ,由 于 体 积 小 ,表 面 积 与 体 积的 比 例 很 大 ,并 且 能 利 用 氧 气 进 行 彻 底 生 物 氧 化 释 放 大 量 能 量 ,因 而 能 够 与外 界 迅 速 进 行 物 质 和 能 量 交 换 ,并 在 体 内 迅 速 转 化 .这 样 一 来 使 大 肠 杆 菌 新陈 代 谢 极 其 迅 速 ,就 如 同 一 个 效 率 极 高 的 化 工 厂 ,而 与 真 正 化 工 厂 相 比 所 需反 应 条 件 又 很 温 和 ,容 易 达 到 ,其 经 济 效 益 是 显 而 易 见 的 . v 综 合 以 上 考 虑 大 肠 杆 菌 常 选 为 宿 主 菌 用 于 基 因 工 程 也 就 不 足 为 怪 了