细胞检测技术

T细 胞 检 测 技 术 机 体 接 受 外 来 抗 原 及 自 身 抗 原 刺激 后 ， 通 过 细 胞 免 疫 和 体 液 免 疫 及 相 关 系统 协 同 作 用 ， 对 抗 原 产 生 应 答 。T 细 胞 应 答 ： T细 胞 增 殖 分 泌 细 胞 因 子 细 胞 毒 效 应 表 达 特 定 表 面 标 志 淋 巴 细 胞DNA合 成 分 化 母 细 胞 刺 激 物细 胞 变 大细 胞 浆 扩 大空 泡核 仁 明 显核 染 色 质 疏 松一 、 淋 巴 细 胞 增 殖 实 验1 、 原 理 （ 1 ） 形 态 学 检 测2 、 检 测 方 法 %100 胞 数转 化 和 未 转 化 的 淋 巴 细转 化 的 淋 巴 细 胞 数转 化 率 方 法 学 评 价优 点 ： 形 态 学 方 法 简 便 易 行 ， 普 通 光 学 显 微 镜 便 能观 察 结 果 ， 适 于 基 层 实 验 室 应 用 。缺 点 ： 是 依 靠 肉 眼 观 察 形 态 学 变 化 ， 判 断 结 果 易 受主 观 因 素 影 响 ， 重 复 性 和 准 确 性 较 差 。 （ 2 ） 3 H-TdR掺 入 法 （ MTT法 ） PHA 淋 巴 细 胞 （ 5 4 h） 3 HTdR掺 入 （ MTT被 还 原 ） 收 集 细 胞 ， 检 测 射 线 （ 4 9 0 nm吸 光度 ） 值值)均A对照孔cpm( )均A试验孔cpm( 490nm490nmSI 优 点 ： 3H-TdR掺 入 法 敏 感 性 高 ， 客 观 性 强 ， 重 复 性 好 。缺 点 ： 但 需 一 定 设 备 条 件 ， 同 时 还 存 在 放 射 性 核 素 污 染 问 题 。 原 理 ： CFSE等 染 料 可 连 结 到 细 胞 内 蛋 白 的 氨 基 酸 群（ PKH2 6 能 插 入 脂 膜 ） ， 并 随 细 胞 分 裂 而 分 配 到 子代 细 胞 中 ， 每 分 裂 一 次 ， 荧 光 强 度 减 少 一 倍 。 方 法 学 评 价优 点 ： 操 作 简 单 ； 重 复 性 强 ； 安 全 ；缺 点 ： CFSE可 能 干 扰 细 胞 增 殖（ 3 ） CFSE（ PKH2 6 等 ） 染 色 法 二 、 T细 胞 分 泌 功 能 的 检 测 T细 胞 经 各 种 丝 裂 原 或 特 异 性 抗 原 刺 激后 ,分 泌 的 各 种 细 胞 因 子 ,可 借 助 免 疫 学 、细 胞 生 物 学 及 分 子 生 物 学 技 术 分 别 检 测 细胞 因 子 含 量 、 生 物 学 活 性 或 基 因 表 达 水 平 ，从 而 间 接 反 映 T细 胞 功 能 。 1 、 生 物 活 性 检 测 对 于 依 赖 于 该 细 胞 因 子 而 增 殖 的 细 胞 ，细 胞 增 殖 程 度 与 细 胞 因 子 含 量 呈 正 相 关 。 方 法 学 评 价优 点 ： 敏 感 （ pg） ； 显 示 细 胞 因 子 的 活 性 ；缺 点 ： 影 响 因 素 多 （ 同 一 细 胞 分 泌 多 种 细 胞 因 子 ，多 种 细 胞 因 子 呈 现 相 同 功 能 ， 细 胞 因 子 及 其 相 应受 体 同 时 分 泌 ） ； 2 、 免 疫 学 检 测（ 1 ） ELISA: 操 作 简 单 ， 非 特 异 性 影 响 大 ；（ 2 ） ELISPOT: 高 度 的 敏 感 性 ， 可 重 复 性 强 ，抗 原 特 异 性 精 确 ；（ 3 ） ICS： 可 同 时 检 测 产 生 细 胞 因 子 的 细 胞 表型 ； 需 要 样 本 量 大 于 ELISPOT， 破 膜 后 的 细胞 不 能 做 进 一 步 功 能 检 测 ； 优 点 ： 简 单 ， 适 用 性 广 ， 应 用 特 异 的 单 克 隆 抗 体 ，可 检 测 单 一 细 胞 因 子 的 含 量 ；缺 点 ： 无 法 反 应 细 胞 因 子 的 生 物 活 性 ； 不 同 单 克隆 抗 体 检 测 的 结 果 不 同 ； 敏 感 性 稍 差 （ 100pg）方 法 学 评 价 （ 1 ） Realtime-PCR（ 2 ） 分 子 杂 交2 、 分 子 生 物 学 检 测 三 、 T细 胞 介 导 的 细 胞 毒 实 验 特 异 性 细 胞 毒 性 T淋 巴 细 胞 （ CTL） 识别 靶 细 胞 表 面 特 异 性 抗 原 ， 通 过 Fas途 径 及 颗 粒 酶途 径 ， 介 导 靶 细 胞 溶 解 。 1 、 5 1 Cr释 放 实 验 铬 酸 钠 （ Na2 5 1 CrO4 ） 中 的 六 价 铬能 被 活 细 胞 摄 取 ， 并 在 细 胞 溶 解 后 以 三 价铬 的 形 式 被 释 放 。 方 法 学 评 价 优 点 ： 灵 敏 、 特 异 ， 是 CTL活 性 测 定 的 经 典 方 法 ； 缺 点 ： 操 作 繁 琐 ； 放 射 性 ； 靶 细 胞 5 1 Cr自 发 释 放 ； 2 、 IC Assay（ In vivo cytotoxicity Assay） 表 达 特 定 抗 原 的 肿 瘤 细 胞 系 经 CFSE标 记 后 ，皮 下 注 射 入 小 鼠 ， 被 小 鼠 体 内 抗 原 特 异 性 CTL作 用2 4 小 时 后 ， 取 出 肿 瘤 细 胞 ， 检 测 其 CFSE含 量 。方 法 学 评 价优 点 ： 反 应 体 内 杀 伤 效 果 ；缺 点 ： 影 响 因 素 多 ； 四 、 T细 胞 表 面 标 志 的 检 测 特 异 性 T淋 巴 细 胞 活 化 需 要 第 一 信 号 和 第 二信 号 。 因 此 检 测 CTL表 面 特 异 性 受 体 或 相 关 的 表 面标 志 可 以 反 映 CTL的 活 化 状 态 。 1 、 Tetramer技 术 模 拟 T细 胞 活 化 的 第 一 信 号 ， 构 建 荧 光 标 记 的MHC-肽 复 合 物 ， 被 特 异 性 T细 胞 识 别 。 通 过 检 测标 记 的 荧 光 ， 反 应 活 化 的 特 异 性 T细 胞 。方 法 学 评 价优 点 ： 简 便 ， 快 速 ， 敏 感缺 点 ： 成 本 高 ， 受 HLA型 别 的 限 制 2 、 表 面 标 志 CD1 0 7 a/b的 检 测 CD1 0 7 a/b表 达 于 T细 胞 内 的 质 膜 上 ， 随 着 脱 颗粒 作 用 ， 一 过 性 表 达 于 细 胞 表 面 ； T细 胞 表 面CD1 0 7 a/b的 检 测 可 反 应 T细 胞 的 溶 解 靶 细 胞 效 应 。方 法 学 评 价优 点 ： 简 便 ， 快 速 ， 敏 感 ， 不 受 HLA型 别 的 限 制缺 点 ： 脱 颗 粒 作 用 的 非 特 异 性 谢 谢