第三章第二节 脱毒苗培养课件.ppt

第 二 节 脱 毒 种 苗 生 产 及 病 毒 检 测 技 术 一 、 脱 毒 的 意 义 ： 无 性 繁 殖 作 物 长 期 营 养 繁 殖 ， 易 受 病 毒 侵 染 ， 而 使 病毒 在 体 内 积 累 ， 导 致 种 性 退 化 ， 造 成 产 量 下 降 或 品 质 降 低甚 至 死 亡 ， 给 农 业 造 成 巨 大 损 失 。 通 过 茎 尖 培 养 获 得 无 病 毒 种 苗 ， 对 退 化 品 种 进 行 提 纯 复壮 。 提 高 产 量 和 品 质 ， 如 马 铃 薯 脱 毒 可 提 高 产 量 30-60%,提高 了 经 济 效 益 。 此 外 ， 由 于 减 少 农 药 使 用 ， 可 以 保 护 生 态环 境 。 脱 毒 技 术 主 要 应 用 于 各 种 无 性 繁 殖 植 物 ， 如 草 莓 、 马铃 薯 、 甘 薯 、 苹 果 、 香 蕉 、 甘 蔗 等 。 二 、 脱 毒 方 法 ：（ 一 ） 茎 尖 分 生 组 织 培 养 脱 毒 ：1. 脱 毒 原 理 ： 病 毒 在 植 物 体 内 的 分 布 不 均 匀 ， 越 靠 近顶 端 区 域 ， 带 毒 越 少 ， 顶 端 分 生 组 织 （ 0.2-0.5 mm） 不 带病 毒 或 含 病 毒 量 极 低 。 因 此 ， 分 离 分 生 组 织 细 胞 进 行 培养 ， 可 以 获 得 无 病 毒 种 苗 。 2. 茎 尖 分 生 组 织 培 养 脱 毒 的 基 本 程 序 ： 一 般 包 括 培 养 基 选 择 和 制 备 、 带 脱 毒 材 料 的 表 面 、 灭菌 、 茎 尖 分 生 组 织 分 离 、 接 种 和 培 养 、 诱 导 芽 分 化 和 小植 株 增 殖 、 诱 导 生 根 、 驯 化 移 栽 等 环 节 。 茎 尖 分 生 组 织 的 分 离 需 要 在 超 净 工 作 台 上 借 助 体 视 显微 镜 进 行 。 茎 尖 放 在 培 养 皿 内 进 行 解 剖 ， 一 只 手 用 镊 子固 定 ， 另 一 手 用 解 剖 针 将 叶 片 和 叶 原 基 层 层 剥 掉 ， 当 露出 半 圆 形 顶 端 分 生 组 织 时 ， 将 分 生 组 织 切 下 ， 接 种 与 培养 基 上 。 virus-freetissuevirus particlesfound here 3. 脱 毒 效 果 与 茎 尖 大 小 的 关 系 ： 脱 毒 效 果 和 茎 尖 分 生 组 织 大 小 直 接 相 关 ， 茎 尖 分 生 组织 越 小 ， 脱 毒 率 越 高 ， 但 生 长 速 度 慢 。 如 草 莓 茎 尖 切 取0.2-0.3mm时 ， 脱 毒 率 达 到 100%， 而 切 取 1.0mm时 ， 脱毒 率 为 50%。 因 此 ， 脱 毒 培 养 时 ， 需 要 兼 顾 脱 毒 率 、 成活 率 及 茎 尖 发 育 成 完 整 植 株 的 能 力 。 既 要 脱 除 病 毒 ， 也要 使 茎 尖 分 生 组 织 迅 速 生 长 发 育 。 一 般 茎 尖 分 生 组 织 大小 以 0.2-0.5mm为 适 宜 。 （ 二 ） 微 体 嫁 接 脱 毒 ： 微 体 嫁 接 是 在 无 菌 条 件 下 ， 将 极 小 (0.2mm） 的 茎 尖 嫁接 到 试 管 内 的 无 菌 实 生 苗 砧 木 上 ， 经 培 养 ， 待 接 口 愈 合 发育 为 完 整 植 株 而 达 到 脱 毒 的 效 果 。 该 方 法 已 在 柑 橘 、 苹 果 、葡 萄 、 山 茶 等 园 艺 植 物 中 应 用 。 微 体 嫁 接 1. 微 体 嫁 接 的 方 法 ：（ 1） 试 管 砧 木 的 准 备 :将 无 病 毒 种 子 表 面 灭 菌 后 接 种 与 MS培 养基 ， 黑 暗 条 件 下 培 养 15d使 其 发 芽 。（ 2） 茎 尖 嫁 接 ： 在 超 净 工 作 台 上 ， 将 幼 苗 的 上 胚 轴 和 子 叶 去 掉 ，根 系 截 短 ， 在 离 上 胚 轴 顶 端 越 0.5cm处 斜 向 下 切 一 深 达 木 质部 ， 长 2-3cm的 切 口 ， 在 斜 切 口 末 端 横 切 一 刀 ， 用 去 掉 切 下部 分 。 在 体 视 显 微 镜 下 ， 从 待 脱 毒 样 品 上 切 取 0.2mm的 茎 尖分 生 组 织 ， 小 心 放 于 切 口 的 水 平 面 上 ， 切 面 向 下 并 与 砧 木 切口 形 成 层 组 织 紧 密 贴 合 ， 然 后 接 于 培 养 基 上 。（ 3） 嫁 接 苗 培 养 ： 将 嫁 接 苗 置 于 光 下 培 养 ， 光 照 时 数 16h， 嫁接 1周 后 形 成 愈 伤 组 织 ， 2-3周 愈 合 ， 5-6周 后 接 穗 发 育 为 新梢 。 2. 微 体 嫁 接 脱 毒 的 关 键 ： 影 响 微 体 嫁 接 成 活 率 的 主 要 因 素 为 接 穗 大 小 和 取 样 时 间 。与 接 穗 大 小 呈 正 相 关 ， 而 无 病 毒 植 株 获 得 与 接 穗 茎 尖 的 大小 呈 负 相 关 。 茎 尖 分 生 组 织 小 于 0.2mm可 以 脱 除 多 数 病 毒 ，春 季 取 材 嫁 接 的 成 活 率 高 于 其 他 季 节 。 （ 3） 热 处 理 脱 毒 ： 通 过 热 处 理 可 以 由 受 病 毒 侵 染 的 个 体 得 到 无 病 毒 植 株 ，其 原 理 是 利 用 病 毒 与 植 物 的 耐 热 性 不 同 ， 在 高 于 常 温 的 环境 下 ， 植 物 组 织 中 的 病 毒 受 热 后 可 被 部 分 或 全 部 钝 化 或 失去 活 性 ， 而 寄 主 植 物 组 织 很 少 或 不 会 受 到 伤 害 。 或 高 温 下植 物 生 长 快 ， 而 病 毒 增 殖 慢 而 使 植 物 新 生 部 分 不 带 病 毒 。 1.热 处 理 脱 毒 方 法 ： 可 以 通 过 温 汤 浸 渍 或 热 空 气 处 理 法 脱 毒 ， 前 者 对 休 眠 芽效 果 较 好 ， 后 者 对 活 跃 生 长 的 茎 尖 效 果 较 好 。 热 空 气 处 理 即 把 旺 盛 生 长 的 植 物 移 入 热 疗 室 ， 在 35-40 下 处 理 一 定 时 间 （ 几 分 钟 到 数 周 ） 热 处 理 后 将 茎 尖 切下 嫁 接 于 无 病 毒 砧 木 或 进 行 组 织 培 养 。 热 处 理 温 度 应 逐 步升 高 ， 直 到 要 求 温 度 。 温 汤 浸 渍 的 材 料 常 用 50-55 处 理 10-50min或 35 温水 处 理 30-40min。 2. 热 处 理 脱 毒 条 件 ：（ 1） 温 度 和 持 续 时 间 ： 因 病 毒 种 类 而 异 ， 有 些 33-34 处理 28-33d即 可 脱 毒 ， 而 有 些 必 须 在 39-42 处 理 50-60d，耐 热 杆 状 病 毒 热 处 理 脱 毒 效 果 差 。 在 植 物 的 耐 热 范 围 内 ，温 度 越 高 ， 脱 毒 效 果 越 好 。 一 般 采 用 35-38 .尤 其 37恒 温 处 理 30 2天 为 普 遍 。 也 可 采 用 高 低 温 处 理 减 少 对 植 物的 损 伤 。 如 马 铃 薯 40 （ 4h） +16-20 （ 20h） 。（ 2） 湿 度 和 光 照 ： 湿 度 以 70-80%为 适 宜 。 光 照 以 自 然 光最 好 。（ 3） 前 处 理 ： 27-35 1-2周 。 （ 四 ） 其 他 脱 毒 方 法 ：1. 花 器 官 培 养 脱 毒 ： 由 植 物 的 花 器 官 培 养 脱 分 化 形 成 愈 伤组 织 ， 然 后 再 分 化 不 定 芽 ， 可 以 获 得 无 毒 苗 。 如 草 莓 花药 培 养 。2. 珠 心 胚 培 养 脱 毒 ： 柑 橘 类 珠 心 胚 与 微 管 组 织 没 有 联 系 ， 一般 不 带 毒 ， 可 以 利 用 珠 心 胚 进 行 培 养 获 得 。3.化 学 脱 毒 :采 用 病 毒 唑 等 试 剂 处 理 材 料 或 添 加 到 培 养 基 中 可以 钝 化 病 毒 ， 达 到 一 定 的 脱 毒 效 果 。4. 超 低 温 处 理 脱 毒 :经 过 冷 冻 保 护 剂 处 理 过 的 茎 尖 材 料 ， 采 用液 氮 处 理 （ -196 ） 可 以 钝 化 病 毒 ， 达 到 脱 毒 效 果 ， 该 方法 已 在 香 蕉 等 果 树 中 成 功 应 用 。5. 合 并 热 处 理 、 茎 尖 培 养 或 微 嫁 接 脱 毒 ： 采 用 多 种 方 法 同 时处 理 可 以 达 到 更 好 的 脱 毒 效 果 。 二 、 病 毒 检 测 方 法 ： 1、 形 态 鉴 定 ： 根 据 植 株 的 生 长 状 态 鉴 定 是 否脱 毒 ， 但 不 准 确 。 2、 指 示 植 物 鉴 定 法 ： 利 用 特 定 的 易 于 感 染 某 些病 毒 的 指 示 植 物 的 特 征 进 行 病 毒 鉴 定 。 指 示 植 物 CMV病 毒 感 染 的 植 株 叶 片 3、 抗 血 清 鉴 定 法 ： 利 用 抗 原 和 抗 体 的 特 异 性 反 应 原 理进 行 病 毒 鉴 定 。 用 已 知 病 毒 的 抗 血 清 （ antiserum） 鉴定 未 知 病 毒 。 近 年 来 又 在 此 基 础 上 发 展 出 酶 联 免 疫 法 （ Enzyme Linked Immunosorbent Assay， ELISA） ， 方 法 是 将 抗原 固 定 在 支 持 物 上 ， 加 入 待 检 血 清 ， 然 后 加 入 酶 （ 过 氧化 物 酶 或 碱 性 磷 酸 酶 ） 标 记 的 抗 体 ， 使 待 检 血 清 与 对 应抗 原 的 特 异 性 抗 体 结 合 ， 最 后 用 分 光 光 度 计 进 行 诊 断 。 酶 联 免 疫 法 进 行 病 毒 鉴 定 4、 电 子 显 微 镜 检 测 （ Electronmicroscope） ： 采 用 电子 显 微 镜 对 病 毒 的 薄 样 品 （ 约 1 100um） 或 纯 化 的病 毒 悬 液 中 进 行 病 毒 的 直 接 观 察 。5、 RT PCR检 测 （ Reverse TranscriptionPolymerase Chain Reaction） ： RT-PCR是 将 RNA模 板 的反 转 录 （ RT） ,和 cDNA的 聚 合 酶 链 式 扩 增 （ PCR） 相 结合 的 技 术 。 RT-PCR技 术 灵 敏 而 且 用 途 广 ， 可 用 于 检 测病 毒 DNA的 转 录 产 物 ， 分 析 表 达 的 水 平 。 该 方 法 已 用 于大 蒜 脱 毒 苗 检 测 。 四 、 无 毒 苗 的 保 存 与 繁 殖 ：（ 一 ） 无 毒 苗 的 保 存 ： 无 毒 苗 木 需 在 隔 离 条 件 下 保 存 以 防 止 再 度 感 染 病 毒 ， 一般 在 专 用 的 防 虫 网 室 进 行 培 养 ， 或 者 在 离 体 条 件 下 保 存 。（ 二 ） 无 毒 苗 的 繁 殖 ：1.无 毒 苗 的 继 代 培 养 与 快 速 繁 殖 可 采 用 不 定 芽 或 丛 生 芽 等 途 径 进 行 无 毒 苗 的 快 繁 。2. 无 毒 苗 的 生 根 及 微 型 鳞 茎 的 培 养 生 长 至 1.0-1.5 cm的 无 毒 苗 接 种 于 生 根 培 养 基 诱 导 生 根 或在 诱 导 试 管 鳞 茎 、 试 管 种 薯 等 培 养 基 上 诱 导 形 成 脱 毒 鳞 茎 、脱 毒 种 薯 等 繁 殖 材 料 。 2010312