《环境微生物学》实验三微生物培养基的配制和灭菌

实 验 三微生物培养基的配制和灭菌 微生物培养基的配制和灭菌目的要求实验材料实验程序 目 的 要 求了 解 培 养 基 的 配 制 原 理 和 方 法 ， 掌 握 其配 制 过 程 。了 解 几 种 灭 菌 方 法 ， 掌 握 干 热 灭 菌 法 和加 压 蒸 汽 灭 菌 法 的 原 理 及 其 使 用 方 法 。熟 悉 分 离 、 培 养 微 生 物 前 的 有 关 准 备 工作 及 操 作 方 法 。 实 验 材 料药 品 ： 牛 肉 膏 、 蛋 白 胨 、 氯 化 钠 、 琼 脂 、 马 铃 薯 、 蔗 糖 ；可 溶 性 淀 粉 、 K2HPO4、 KNO3、 MgSO47H2O、FeSO47H2O等 。高 压 蒸 汽 灭 菌 器 、 恒 温 干 热 灭 菌 箱 、 细 菌 过 滤 器 、 紫 外 线杀 菌 灯 。其 它 ： 天 平 、 牛 角 匙 、 电 炉 、 1N HCl、 1N NaOH、 pH试 纸 、刻 度 搪 瓷 杯 、 量 筒 、 漏 斗 、 漏 斗 架 、 玻 棒 、 带 玻 璃 珠 的 三角 瓶 、 带 棉 塞 的 无 菌 试 管 、 无 棉 塞 的 空 试 管 、 培 养 皿 、 吸管 、 各 种 包 装 纸 、 防 水 纸 、 绳 索 、 棉 花 、 标 签 等 。 实 验 程 序培 养 基 的 配 制分 离 培 养 微 生 物 常 用 器 皿 的 准 备培 养 基 和 玻 璃 器 材 的 灭 菌 方 法 实 验 程 序 1 （ 培 养 基 的 配 制 ）培 养 基 的 种 类培 养 基 的 配 制 方 法 和 步 骤三 种 培 养 基 的 配 方 及 配 制无 菌 水 的 制 备 实 验 程 序 2 （ 培 养 基 的 种 类 ）据 组 成 成 分 可 分 为 : 1.合 成 培 养 基 ： 由 各 种 纯 化 学 物 质 按 一 定 比 例 配 制 而 成 。 2.半 合 成 培 养 基 ： 有 一 部 分 纯 化 学 物 质 和 另 一 部 分 天 然 物 质 配 制而 成 。 3.天 然 培 养 基 ： 利 用 天 然 来 源 的 有 机 物 配 制 而 成 。从 培 养 基 的 物 理 状 态 可 分 为 1.液 体 培 养 基 ： 不 加 凝 固 剂 的 液 体 状 态 培 养 基 。 2.固 体 培 养 基 ： 在 液 体 培 养 基 中 加 入 2%左 右 的 凝 固 剂 的 固 体 状态 的 培 养 基 或 农 副 产 品 培 养 基 。 3.半 固 体 培 养 基 ： 在 液 体 培 养 基 中 加 入 0.20.5%凝 固 剂 而 成的 半 固 体 状 培 养 基 。 实 验 程 序 3 （ 培 养 基 的 种 类 ）常 用 凝 固 剂 为 琼 脂 （ 其 次 为 明 胶 ） ， 又 叫 洋 菜 、 冻 粉 。 实 验 程 序 4 （ 培 养 基 的 配 制 方 法 和 步 骤 ）称 量 ： 按 照 配 方 正 确 称 取 各 种 原 料 放 于 搪 瓷 杯 中 。溶 化 ： 在 搪 瓷 杯 中 加 入 所 需 水 量 ， 玻 棒 搅 匀 ， 加 热 溶 解 。调 pH值 ： 用 1N NaOH或 1N HCl调 pH， 用 pH试 纸 对 照 。加 琼 脂 溶 化 ： 加 热 过 程 中 要 不 断 搅 拌 ， 可 适 当 补 水 。分 装 ： 注 意 不 要 污 染 棉 塞 。包 扎 成 捆 ， 挂 上 标 签 （ 必 须 用 铅 笔 写 ） ， 注 明 何 种 培 养 基 。灭 菌 备 用 ： 培 养 基 灭 菌 后 必 须 在 37 0C下 恒 温 培 养 24h， 确 定 无菌 生 长 ， 方 可 使 用 。 实 验 程 序 5 （ 培 养 基 的 配 制 方 法 和 步 骤 ） 实 验 程 序 6 （ 培 养 基 的 配 制 方 法 和 步 骤 ） 实 验 程 序 7 （ 三 种 培 养 基 的 配 方 及 配 制 ）牛 肉 膏 蛋 白 胨 琼 脂 培 养 基 （ 用 于 分 离 和 培 养 细菌 ， 是 一 种 天 然 培 养 基 ） 配 方 如 下 ： 牛 肉 膏 3g 蛋 白 胨 5g 氯 化 钠 3g 琼 脂 20g 自 来 水 1000mL pH 7.27.4 灭 菌 1.05kg/cm 2， 2530min 实 验 程 序 8 （ 三 种 培 养 基 的 配 方 及 配 制 ）马 铃 薯 （ 或 豆 芽 汁 ） 蔗 糖 （ 或 葡 萄 糖 ） 琼 脂 培 养 基（ 用 于 分 离 和 培 养 真 菌 之 用 ， 是 一 种 半 合 成 培 养 基 ） ，其 配 方 如 下 ： 去 皮 马 铃 薯 （ 或 鲜 豆 芽 ） 200g 蔗 糖 （ 或 葡 萄 糖 ） 20g 自 来 水 1000mL 琼 脂 20g pH 自 然 灭 菌 ： （ 含 蔗 糖 ） 1.05kg/cm 2 20min （ 含 葡 萄 糖 ） 0.1kg/cm2 30min 实 验 程 序 9 （ 三 种 培 养 基 的 配 方 及 配 制 ）淀 粉 琼 脂 培 养 基 （ 高 氏 一 号 Gause1） ， 用 于 分 离和 培 养 放 线 菌 ， 是 一 种 合 成 培 养 基 。 配 方 如 下 ：可 溶 性 淀 粉 20.0g KNO3 1.0g K2HPO4 0.5g MgSO4 7H2O 0.5g NaCl 0.5g FeSO 4 7H2O 0.01g 琼 脂 20g 自 来 水 1000mL 灭 菌 ： 1.05kg/cm2 30min 实 验 程 序 10 （ 三 种 培 养 基 的 配 方 及 配 制 ）无 菌 水 的 制 备 无 菌 水 为 下 一 次 微 生 物 分 离实 验 中 所 需 要 的 材 料 。 100mL三 角 烧 瓶 （ 装 有 玻 璃 珠 ） ， 装 自 来 水45.0mL， 试 管 中 装 9.0mL自 来 水 ， 塞 上 棉 塞 ，包 扎 、 灭 菌 备 用 。 三 角 烧 瓶 和 试 管 须 预 先 塞 好棉 塞 ， 并 经 干 热 灭 菌 。 实 验 程 序 11 （ 分 离 培 养 微 生 物 常 用 器 皿 的 准 备 ）清 洗 一 些 玻 璃 仪 器 ： 如 三 角 烧 瓶 、 试 管 、 培 养 皿 、 吸 管 等 。棉 塞 的 制 作 包 装 培 养 皿 和 吸 管 等 。 实 验 程 序 12 （ 培 养 基 和 玻 璃 器 材 的 灭 菌 方 法 ）干 热 灭 菌 法 ： 电 热 烘 箱 作 为 干 热 灭 菌 器加 压 蒸 汽 灭 菌 法 其 步 骤 如 下 ： 1.灭 菌 器 内 加 入 一 定 量 的 水 ， 将 用 防 水 纸 包 扎 好 的 物 品 放 入 其 中 。2.接 通 电 源 ， 进 行 加 热 。 3. 排 除 高 压 锅 内 的 冷 空 气 ， 可 将 排 气 阀 打 开 ， 待 排 出 大 气 后 关闭 排 气 阀 ； 或 关 闭 排 气 阀 ， 待 压 力 上 升 到 0.5kg/cm2时 再 打 开排 气 阀 ， 待 压 力 回 复 到 0时 再 关 闭 排 气 阀 。 4.当 压 力 达 15bl/in 2（ 即 1.05kg/cm2） 时 ， 此 时 灭 菌 器 内 的 温度 为 1210C， 维 持 30min。 对 热 不 稳 定 的 培 养 基 如 含 有 葡 萄 糖 、氨 基 酸 等 物 时 ， 应 适 当 降 低 压 力 ， 延 长 时 间 。 5.灭 菌 时 间 一 到 ， 切 断 电 源 ， 待 压 力 降 至 零 时 ， 才 能 打 开 排 气 阀 ，然 后 打 开 灭 菌 器 盖 ， 取 出 物 品 。 实 验 程 序 13 实 验 程 序 14 实 验 程 序 15 （ 培 养 基 和 玻 璃 器 材 的 灭 菌 方 法 ）间 歇 灭 菌 法 ： 待 灭 菌 的 物 品 放 在 灭 菌 器 或 蒸 笼 里 ， 每 天 蒸 煮 1次 ， 每次 煮 沸 1h， 连 续 3d重 复 进 行 。 在 每 两 次 蒸 煮 之 间 ， 将物 品 （ 指 培 养 基 ） 放 在 370C恒 温 条 件 下 培 养 过 夜 ， 这样 可 以 使 每 次 蒸 煮 后 未 杀 死 残 留 的 芽 孢 萌 发 成 营 养 体 ，以 便 下 次 蒸 煮 时 杀 灭 。过 滤 除 菌 法 ： 不 能 用 加 热 灭 菌 的 液 体 物 质 （ 如 维 生 素 、 血 清 ） ， 一 般可 用 细 菌 过 滤 器 进 行 除 菌 。 （ 教 师 示 范 ） 实 验 程 序 16 （ 培 养 基 和 玻 璃 器 材 的 灭 菌 方 法 ） 实 验 程 序 17 （ 培 养 基 和 玻 璃 器 材 的 灭 菌 方 法 ）紫 外 线 灭 菌 法 ： 一 般 30W灯 管 ， 9m3空 间 ， 距 地 面 2m每 次 打 开 紫 外 线 照 射 0.5h，就 使 室 内 空 气 灭 菌 。 若 照 射 紫 外 线 时 先 喷 洒 石 炭 酸 等 化 学 消 毒 剂 ，可 增 强 灭 菌 效 果 。 紫 外 线 虽 有 较 强 的 杀 菌 力 ， 但 穿 透 力 弱 ， 即 使一 薄 层 玻 璃 或 水 层 就 能 将 大 部 分 紫 外 线 滤 除 ， 因 此 只 适 用 于 空 气及 表 面 杀 菌 。化 学 药 剂 消 毒 灭 菌 ： 微 生 物 实 验 室 中 常 用 的 化 学 杀 菌 剂 有 升 汞 、 甲 醛 、 高 锰 酸 钾 、 酒精 、 碘 酒 、 龙 胆 紫 、 石 炭 酸 、 漂 白 粉 、 新 洁 尔 灭 、 煤 酚 皂 溶 液 ，它 们 有 的 是 杀 菌 剂 ， 有 的 是 抑 菌 剂 ， 详 见 表 64。 实 验 程 序 18 （ 培 养 基 和 玻 璃 器 材 的 灭 菌 方 法 ） 思 考 题固 体 培 养 基 加 琼 脂 后 加 热 溶 化 时 要 注 意 哪 些 问题 ？培 养 基 中 加 琼 脂 的 作 用 是 什 么 ？干 热 灭 菌 、 高 压 蒸 汽 灭 菌 和 间 歇 灭 菌 的 场 合 有何 不 同 ？如 何 检 查 培 养 基 灭 菌 是 否 彻 底 ？ 实 验 三结 束