工业微生物产生菌的分离筛选

第 六 章 工 业 微 生 物 产 生 菌 的 分 离 筛 选本 章 内 容 ：含 微 生 物 样 品 的 采 集含 微 生 物 样 品 的 富 集 培 养微 生 物 的 分 离野 生 菌 株 的 筛 选 和 目 的 产 物 的 鉴 别 菌 种改 进 发 酵 工 艺 和 设 备得 到 理 想 的 发 酵 产 品 从 自 然 界 中 分 离得 到 ， 经 过 筛 选 、纯 化 及 培 养 条 件的 研 究第 一 株 应 用 于 发 酵 工 业 的青 霉 素 生 产 菌 是 从 美 国 伊利 诺 斯 洲 长 霉 的 葡 萄 柚 中分 离 出 来第 一 株 头 孢 霉 素 生 产 菌 则来 自 于 意 大 利 撒 丁 岛 的 污水 中 。 菌 种 收 集 和 筛 选 途 径 向 菌 种 保 藏 机 构 索 取 有 的 菌 株 ， 从 中 筛 选 所 需 菌 株 。 由 自 然 界 采 集 样 品 ， 如 土 壤 、 水 、 动 植 物 体 等 ， 从 中进 行 分 离 筛 选 。 从 一 些 发 酵 制 品 中 分 离 目 的 菌 株 ， 如 从 酱 油 中 分 离 蛋白 酶 产 生 菌 ， 从 酒 醪 中 分 离 淀 粉 酶 或 糖 化 酶 的 产 生 菌 等 。 第 一 节 含 微 生 物 样 品 的 采 集一 、 从 土 壤 中 采 样（ 一 ） 根 据 土 壤 特 点1.土 壤 有 机 质 含 量 和 通 气 状 况525cm土 层 ， 适 合 微 生 物 生 长 ， 每 克 土 中 含 菌 数 约 几 十万 到 几 十 亿 个 。 酵 母 菌 分 布 土 层 最 浅 ， 约 510cm， 霉 菌和 好 氧 芽 孢 杆 菌 也 分 布 在 浅 土 层 。 2.土 壤 酸 碱 度 和 植 被 状 况 偏 碱 土 壤 环 境 ， 适 合 于 细 菌 、 放 线 菌 生 长 。 偏 酸 的 土壤 环 境 下 ， 霉 菌 、 酵 母 菌 生 长 旺 盛 。 植 物 根 部 的 分 泌 物 有 所 不 同 ， 即 植 被 对 微 生 物 分 布 也有 一 定 的 影 响 。 如 番 茄 地 或 腐 烂 番 茄 堆 积 处 有 较 多 维 生 素C产 生 菌 。 葡 萄 或 其 他 果 树 在 果 实 成 熟 时 ， 其 根 部 附 近 土壤 中 酵 母 菌 数 量 增 多 。 豆 科 植 物 的 植 被 下 ， 根 瘤 菌 数 量 比其 他 植 被 下 占 优 势 。 3.地 理 条 件 南 方 土 壤 比 北 方 土 壤 中 的 微 生 物 数 量 和 种 类 都 要 多 ， 特别 是 热 带 和 亚 热 带 地 区 的 土 壤 。 许 多 工 业 微 生 物 菌 种 ， 如 抗 生素 产 生 菌 ， 尤 其 是 霉 菌 、 酵 母 菌 ， 大 多 从 南 方 土 壤 中 筛 选 出来 。 南 方 温 度 高 ， 温 暖 季 节 长 ， 雨 水 多 ， 相 对 湿 度 高 ， 植物 种 类 多 ， 植 被 覆 盖 面 大 ， 土 壤 有 机 质 丰 富 ， 造 成 得 天 独 厚 的微 生 物 生 长 环 境 。 4.季 节 条 件 不 同 季 节 微 生 物 数 量 有 明 显 的 变 化 ， 冬 季 温 度 低 ， 气候 干 燥 ， 微 生 物 生 长 缓 慢 ， 数 量 最 少 。 到 了 春 天 随 着 气 温的 升 高 ， 微 生 物 生 长 旺 盛 ， 数 量 逐 渐 增 加 。 南 方 ， 春 季 往 往 雨 水 多 ， 土 壤 含 水 量 高 ， 通 气 不 良 ，即 使 有 微 生 物 所 需 的 温 度 、 湿 度 ， 也 不 利 于 其 生 长 繁 殖 。随 后 经 过 夏 季 到 秋 季 ， 约 有 710个 月 处 在 较 高 的 温 度 和 丰富 的 植 被 下 ， 土 壤 中 微 生 物 数 量 比 任 何 时 候 都 多 ， 因 此 ，秋 季 采 土 样 最 为 理 想 。 （ 二 ） 采 样 方 法 用 取 样 铲 ， 将 表 层 5cm左 右 的 浮 土 除 去 ， 取 525cm处的 土 样 1025g， 装 入 事 先 准 备 好 的 塑 料 袋 内 扎 好 。 北 方 土壤 干 燥 ， 可 在 1030cm处 取 样 。 给 塑 料 袋 编 号 并 记 录 地 点 、土 壤 质 地 、 植 被 名 称 、 时 间 及 其 他 环 境 条 件 。 一 般 样 品 取 回 后 应 马 上 分 离 ， 以 免 微 生 物 死 亡 。 如 果 样品 较 多 ， 或 到 外 地 取 样 ， 路 途 遥 远 ， 难 以 做 到 及 时 分 离 ， 则可 事 先 用 选 择 性 培 养 基 做 好 试 管 斜 面 ， 随 身 带 走 。 将 取 好 的土 样 混 匀 ， 取 34g撒 到 试 管 斜 面 上 ， 可 避 免 菌 株 不 能 及 时分 离 而 死 亡 。 二 、 根 据 微 生 物 生 理 特 点 采 样1.根 据 微 生 物 营 养 类 型 每 种 微 生 物 对 碳 、 氮 源 的 需 求 不 一 样 ， 分 布 也 有 差 异 。 微生 物 的 营 养 需 求 和 代 谢 类 型 与 其 生 长 环 境 有 着 很 大 的 相 关 性 。如 ：森 林 土 富 含 纤 维 素 适 合 纤 维 素 酶 产 生 菌 的 生 长 ；肉 类 加 工 厂 附 近 和 饭 店 排 水 沟 的 污 水 、 污 泥 中 分 离 蛋 白 酶和 脂 肪 酶 产 生 菌 ；面 粉 加 工 厂 、 糕 点 厂 、 酒 厂 及 淀 粉 加 工 厂 等 场 所 分 离 产 生淀 粉 酶 、 糖 化 酶 的 菌 株 。蜂 蜜 、 蜜 饯 、 甜 果 及 含 糖 浓 度 高 的 植 物 汁 液 中 筛 选 酵 母 菌 。柑 橘 、 草 莓 及 山 芋 等 果 蔬 中 含 有 较 多 的 果 胶 分 离 果 胶 酶 产 生 菌 。 2.根 据 微 生 物 的 生 理 特 性在 筛 选 一 些 具 有 特 殊 性 质 的 微 生 物 时 ， 需 根 据 该 微 生 物 独 特 的生 理 特 性 到 相 应 的 地 点 采 样 。 如 ：筛 选 高 温 酶 产 生 菌 时 ， 通 常 到 温 度 较 高 的 南 方 ， 或 温 泉 、 火 上爆 发 处 及 北 方 的 堆 肥 中 采 样 ；海 洋 底 部 采 样 分 离 耐 压 菌 ；甜 果 、 蜜 饯 或 甘 蔗 渣 堆 积 处 采 样 分 离 耐 高 渗 透 压 酵 母 菌 。 若 需 要 筛 选 代 谢 合 成 某 种 化 合 物 的 微 生 物 ， 从 大 量 使用 、 生 产 或 处 理 这 种 化 合 物 的 工 厂 附 近 采 集 样 品 ， 容 易 得到 满 意 的 结 果 。 2.极 端 环 境 条 件 的 影 响 高 温 、 低 温 、 高 酸 、 高 碱 、 高 盐 或 高 辐 射 强 度 的 环 境 下 ， 也有 少 数 微 生 物 存 在 ， 这 类 微 生 物 被 称 为 极 端 微 生 物 。 生 活 所 处 的特 殊 环 境 ， 导 致 它 们 具 有 不 同 于 一 般 微 生 物 的 遗 传 特 性 、 特 殊 结构 和 生 理 机 能 ， 因 而 在 冶 金 、 采 矿 及 生 产 特 殊 酶 制 剂 方 面 有 着 巨大 的 应 用 价 值 。1.局 部 环 境 条 件 的 影 响 微 生 物 的 分 布 除 了 本 身 的 生 理 特 性 和 环 境 条 件 综 合 因 素的 影 响 之 外 ， 还 要 受 局 部 环 境 条 件 的 影 响 。 海 洋 对 于 微 生 物 来 说 是 一 个 特 殊 的 局 部 环 境 ， 使 海 洋 微生 物 具 备 特 殊 的 生 理 活 性 ， 相 应 也 产 生 了 一 些 不 同 于 陆 地 来源 的 特 殊 产 物 。 具 有 特 殊 性 质 的 微 生 物 通 常 分 布 在 一 些 特 殊 的 环 境 中 。三 、 特 殊 环 境 下 采 样 第 二 节 含 微 生 物 样 品 的 富 集 培 养 富 集 培 养 是 在 目 的 微 生 物 含 量 较 少 时 ， 根 据 微 生 物 的 生 理特 点 ， 设 计 一 种 选 择 性 培 养 基 ， 创 造 有 利 的 生 长 条 件 ， 使 目的 微 生 物 在 最 适 的 环 境 下 迅 速 地 生 长 繁 殖 ， 数 量 增 加 ， 由 原来 自 然 条 件 下 的 劣 势 种 变 成 人 工 环 境 下 的 优 势 种 ， 以 利 分 离到 所 需 要 的 菌 株 。 富 集 培 养 主 要 根 据 微 生 物 的 碳 、 氮 源 、 pH、 温 度 、 需 氧 等生 理 因 素 加 以 控 制 。 一 、 控 制 培 养 基 的 营 养 成 分 微 生 物 的 代 谢 类 型 十 分 丰 富 ， 其 分 布 状 态 随 环 境 条件 的 不 同 而 异 。 在 富 集 培 养 时 ， 还 需 根 据 微 生 物 的 不 同 种 类 选 用 相应 的 富 集 培 养 基 。 根 据 微 生 物 对 环 境 因 子 的 耐 受 范 围 具 有 可 塑 性 的 特点 ， 可 通 过 连 续 富 集 培 养 的 方 法 分 离 降 解 高 浓 度 污 染 物的 环 保 菌 。 二 、 控 制 培 养 条 件 在 筛 选 某 些 微 生 物 时 ， 除 通 过 培 养 基 营 养 成 分 的 选 择 外 ，还 可 通 过 它 们 对 pH、 温 度 及 通 气 量 等 其 他 一 些 条 件 的 特 殊 要求 加 以 控 制 培 养 ， 达 到 有 效 的 分 离 目 的 。 如 细 菌 、 放 线 菌 的 生 长 繁 殖 一 般 要 求 偏 碱 ， 霉 菌 和 酵 母 菌要 求 偏 酸 。 分 离 放 线 菌 时 ， 可 将 样 品 液 在 40 恒 温 预 处 理20min， 有 利 于 孢 子 的 萌 发 ， 可 以 较 大 地 增 加 放 线 菌 数 目 ， 达到 富 集 的 目 的 。 三 、 抑 制 不 需 要 的 菌 类 在 分 离 筛 选 的 过 程 中 ， 除 了 通 过 控 制 营 养 和 培 养 条 件 ，增 加 富 集 微 生 物 的 数 量 以 利 于 分 离 外 ， 还 可 通 过 高 温 、 高 压 、加 入 抗 生 素 等 方 法 减 少 非 目 的 微 生 物 的 数 量 ， 使 目 的 微 生 物的 比 例 增 加 ， 同 样 能 够 达 到 富 集 的 目 的 。如 土 壤 中 分 离 芽 孢 杆 菌 ， 可 先 将 土 样 加 热 到 80 或 在 50%乙醇 溶 液 中 浸 泡 1h筛 选 霉 菌 时 ， 可 在 培 养 集 中 加 入 四 环 素 等 抗 生 素 抑 制 细 菌分 离 放 线 菌 时 ， 在 样 品 悬 浮 液 中 加 入 10滴 10%的 酚 或 加 青 霉素 、 链 霉 素 ， 以 及 丙 酸 钠 抑 制 霉 菌 和 细 菌 的 生 长 。 第 三 节 微 生 物 的 分 离一 、 好 气 微 生 物 的 分 离（ 一 ） 稀 释 涂 布 法（ 二 ） 划 线 分 离 法（ 三 ） 利 用 平 皿 的 生 化 反 应 进 行 分 离1.透 明 圈 法 在 平 板 培 养 基 中 加 入 溶 解 性 较 差 的 底 物 ， 使 培 养 基 混浊 。 能 分 解 底 物 的 微 生 物 便 会 在 菌 落 周 围 产 生 透 明 圈 ， 圈的 大 小 初 步 反 应 该 菌 株 利 用 底 物 的 能 力 。 该 法 在 分 离 水 解酶 产 生 菌 时 采 用 较 多 ， 如 脂 肪 酶 、 淀 粉 酶 、 蛋 白 酶 、 核 酸 酶 产 生 菌 的 分 离 。 2.变 色 圈 法 对 于 一 些 不 易 产 生 透 明 圈 产 物 的 产 生 菌 ， 可 在 底 物 平 板 中加 入 指 示 剂 或 显 色 剂 ， 使 所 需 微 生 物 能 被 快 速 鉴 别 出 来 。 如 ： 筛 选 果 胶 酶 产 生 菌 时 ， 用 含 0.2%果 胶 为 唯 一 碳 源 的 培 养 基平 板 ， 对 含 微 生 物 样 品 进 行 分 离 ， 待 菌 落 长 成 后 ， 加 入 0.2%刚果 红 溶 液 染 色 4h， 具 有 分 解 果 胶 能 力 的 菌 落 周 围 便 会 出 现 绛 红色 水 解 圈 。 分 离 谷 氨 酸 产 生 菌 时 ， 可 在 培 养 基 中 加 入 溴 百 里 酚 蓝 ， 它是 一 种 酸 碱 指 示 剂 ， 变 色 范 围 在 pH6.27.6， 当 pH在 6.2以 下时 为 黄 色 ， pH7.6以 上 为 蓝 色 。 通 过 平 板 上 产 生 的 变 色 圈 还 可 快 速 分 离 筛 选 产 乙 醇 的 菌 株 。在 以 糖 为 碳 源 的 琼 脂 平 板 的 菌 落 上 ， 覆 盖 一 层 含 有 盐 类 物 质 的琼 脂 ， 该 蓝 色 物 质 在 乙 醇 脱 氢 酶 和 NAD作 用 下 （ 在 少 量 乙 醇 存在 时 ） 反 应 产 生 的 电 子 脱 色 。 3.生 长 圈 法 生 长 圈 法 通 常 用 于 分 离 筛 选 氨 基 酸 、 核 苷 酸 和 维 生 素的 产 生 菌 。 工 具 菌 是 一 些 相 对 应 的 营 养 缺 陷 型 菌 株 。 将 待 检 菌 涂 布 于 含 高 浓 度 的 工 具 菌 并 缺 少 所 需 营 养 物的 平 板 上 进 行 培 养 ， 若 某 菌 株 能 合 成 平 板 所 需 的 营 养 物 ，在 该 菌 株 的 菌 落 周 围 便 会 形 成 一 个 混 浊 的 生 长 圈 。4.抑 菌 圈 法 常 用 于 抗 生 素 产 生 菌 的 分 离 筛 选 。 抑 菌 圈 法 是 常 用 的初 筛 方 法 ， 工 具 菌 采 用 抗 生 素 的 敏 感 菌 。 （ 四 ） 组 织 分 离 法1.对 一 般 有 病 组 织 的 分 离 方 法是 由 一 些 有 病 组 织 或 特 殊 组 织 中 分 离 菌 株 的 方 法 。 如从 患 恶 苗 病 的 水 稻 组 织 中 分 离 赤 霉 菌 ， 从 根 瘤 中 分 离 根 瘤菌 ， 及 从 各 种 食 用 的 子 实 体 中 分 离 孢 子 等 。切 除 小 块 含 菌 组 织 洗 去 表 面 污 物 10%漂 白 粉 或0.1%升 汞 浸 泡 25min， 无 菌 水 冲 洗 移 至 平 皿 上 培养 观 察 菌 落 挑 入 斜 面 培 养 分 离 纯 化 、 筛 选 。从 豆 科 植 物 的 根 瘤 中 分 离 根 瘤 菌 ： 取 根 瘤 10%漂 白 粉或 0.1%升 汞 浸 泡 25min， 无 菌 水 冲 洗 用 无 菌 镊 子 将根 瘤 压 破 ， 取 汁 液 少 许 与 分 离 培 养 基 混 合 倒 入 平 皿 ， 摊 平 ， 培 养 观 察 菌 落 挑 入 斜 面 培 养 。 2.食 用 菌 孢 子 分 离 法（ 1） 多 孢 子 分 离 法（ 2） 单 孢 子 分 离 法（ 五 ） 单 细 胞 或 单 孢 子 分 离 法（ 六 ） 特 殊 菌 类 环 保 降 解 菌 的 分 离 二 、 通 过 控 制 营 养 和 培 养 条 件 进 行 分 离1.培 养 基 的 营 养 成 分2.培 养 基 的 pH3.排 除 不 需 要 的 菌 类4.控 制 培 养 温 度 三 、 厌 气 菌 的 分 离（ 一 ） 加 还 原 剂 分 离 培 养 基 内 加 入 还 原 剂 ， 如 半 胱 氨 酸 、 D型 维 生 素C、 硫 化 钠 等 ， 操 作 时 以 最 快 的 速 度 划 线 分 离 ， 然 后 立 即置 于 事 先 已 抽 真 空 密 闭 的 容 器 内 （ 充 CO2或 N2也 可 ） ，于 适 温 培 养 。（ 二 ） 焦 性 没 食 子 酸 法焦 性 没 食 子 酸 和 NaOH互 相 反 应 除 去 氧 气 。 要 除 去 100mL空 气 中 的 氧 气 需 要 焦 性 没 食 子 酸 固 体 1g和 10%NaOH溶 液10mL。 （ 六 ） 生 物 吸 氧 法（ 五 ） 玻 璃 板 隔 绝 空 气 培 养 法（ 四 ） 试 管 厌 气 培 养 法（ 三 ） 平 皿 厌 气 培 养 法 第 四 节 野 生 菌 株 的 筛 选 和 目 的 产 物 的 鉴 别一 、 初 筛1.平 板 筛 选 初 筛 是 从 大 量 分 离 到 的 微 生 物 中 将 具 有 合 成 目 的 产 物 的微 生 物 筛 选 出 来 的 过 程 。 由 于 菌 株 多 ， 工 作 量 大 ， 为 了 提 高初 筛 的 效 率 ， 通 常 需 要 设 计 一 种 快 速 、 简 便 又 较 为 准 确 的 筛选 方 法 。 对 那 些 在 纯 化 分 离 阶 段 没 有 采 用 平 皿 定 性 法 挑 选 出 来 的菌 落 ， 即 随 机 挑 选 的 菌 株 ， 由 于 数 量 很 大 ， 又 不 知 是 否 具 有 目 的 产 物 的 生 产 能 力 ， 这 时 只 能 首 先 采 取 较 粗 放 的 检 测 方 法 ： 对 那 些 在 纯 化 分 离 阶 段 没 有 采 用 平 皿 定 性 法 挑 选 出 来 的菌 落 ， 即 随 机 挑 选 的 菌 株 ， 由 于 数 量 很 大 ， 又 不 知 是 否 具 有 目的 产 物 的 生 产 能 力 ， 这 时 只 能 首 先 采 取 较 粗 放 的 检 测 方 法 ： 如 筛 选 产 生 碱 性 蛋 白 酶 的 地 衣 芽 孢 杆 菌 时 ， 可 以 将 分 离 得到 的 菌 株 ， 点 种 在 含 有 0.3%0.4%酪 蛋 白 的 琼 脂 平 板 上 ， 适温 培 养 后 ， 测 量 形 成 的 水 解 圈 直 径 和 菌 落 直 径 的 比 值 来 表 示 酶活 力 的 强 弱 。 挑 选 其 中 产 酶 能 力 强 的 菌 株 进 一 步 用 摇 瓶 培 养 、筛 选 。 在 筛 选 谷 氨 酸 菌 种 时 ， 用 一 种 不 含 有 机 氮 （ 如 蛋 白 胨 ） 的培 养 基 ， 使 分 离 得 到 的 菌 株 在 这 种 培 养 基 上 形 成 单 菌 落 ， 用 内径 68mm的 打 孔 器 ， 把 菌 落 连 同 琼 脂 培 养 基 逐 个 取 出 ， 放 在灭 过 菌 的 滤 纸 上 ， 放 置 一 定 时 间 ， 菌 落 产 生 的 氨 基 酸 会 渗 透 并扩 散 到 滤 纸 上 ， 喷 上 茚 三 酮 ， 出 现 成 色 圈 者 即 为 氨 基 酸 的 产 生菌 。 菌 种 选 育 工 作 者 在 初 筛 时 经 常 使 用 这 种 平 皿 快 速 检 测 法 ，将 复 杂 而 费 时 的 化 学 测 定 改 为 平 皿 上 肉 眼 可 见 的 显 色 或 生 化 反应 ， 能 较 大 幅 度 地 提 高 筛 选 效 率 ， 减 少 工 作 量 。 如 以 往 在 分 离生 物 表 面 活 性 剂 产 生 菌 时 ， 传 统 方 法 ： 测 定 菌 株 的 排 油 活 性 、表 面 张 力 、 乳 化 性 能 等 ， 工 作 量 大 ， 效 率 低 。 改 良 法 ： 根 据 生物 表 面 活 性 剂 能 够 溶 血 的 原 理 ， 把 加 入 羊 血 的 培 养 基 作 成 平 板 ， 将 菌 株 逐 个 点 种 ， 适 温 培 养 12d， 挑 选 溶 血 的 单 菌 落 。 2.摇 瓶 发 酵 筛 选 由 于 摇 瓶 振 荡 培 养 法 更 接 近 于 发 酵 罐 培 养 的 条 件 ，效 果 比 较 一 致 ， 由 此 筛 选 到 的 菌 株 易 于 推 广 。 一 个 菌 株 接 一 个 瓶 ， 在 一 定 转 速 的 摇 瓶 机 上 及适 宜 的 温 度 下 振 荡 培 养 ， 得 到 的 发 酵 液 过 滤 后 进 行 活性 测 定 ： 取 玻 璃 板 16cm 26cm或 18cm 28cm，制 备 含 有 鉴 定 菌 （ 测 定 抗 生 素 ） 或 底 物 （ 酶 制 剂 ） 等的 平 板 。 琼 脂 板 厚 约 3mm， 用 内 径 5mm钢 圈 打 孔 ，取 以 上 过 滤 后 的 发 酵 液 10l逐 个 加 入 ， 放 在 鉴 定 菌 或酶 作 用 最 适 温 度 下 温 育 一 定 时 间 ， 孔 的 周 围 出 现 透 明的 溶 菌 圈 或 水 解 圈 。 根 据 活 性 圈 的 大 小 决 定 取 舍 。 二 、 复 筛 琼 脂 平 板 活 性 测 定 法 ， 其 最 大 的 优 点 就 是 简 便 、 快 速 ，因 而 在 筛 选 工 作 量 大 时 具 有 相 当 的 优 越 性 。 该 法 不 足 之 处是 产 物 活 性 只 能 相 对 比 较 ， 难 以 得 到 确 切 的 产 量 水 平 ， 只适 用 于 初 筛 。 通 过 初 筛 可 淘 汰 85%90%不 符 合 要 求 的 微 生 物 ， 剩余 的 较 好 的 菌 株 则 需 进 行 摇 瓶 培 养 复 筛 。 复 筛 过 程 中 ， 要 结 合 各 种 培 养 条 件 ， 如 培 养 基 、 温 度 、pH、 供 氧 量 等 进 行 筛 选 ， 也 可 对 同 一 个 菌 株 的 各 种 培 养 因素 加 以 组 合 ， 构 成 不 同 培 养 条 件 进 行 试 验 ， 以 便 初 步 掌 握 野 生 型 菌 株 适 合 的 培 养 条 件 。