实验五、植物组织中过氧化氢酶的活力测定

实验五、植物组织中过氧化氢酶活力测定高锰酸钾滴定法 一、实验目的l 1.掌握酶活力测定的方法l 2.了解过氧化氢酶在生物体中的作用原理 二、实验原理l过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。l R(Fe2+)+H2O2 = R(Fe3+OH)l R(Fe3+OH)2+H2O2 = R(Fe2+)2+2H2O+O2 l据此，可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）的H2O2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的H2O2，即可求出消耗的H2O2的量。l 5 H2O2 +2KMnO4+4H2SO4 =5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4 三、材料、试剂与器具 1.材料：小麦叶片2.试剂（1）10% H2SO4；（2）0.2mol/L磷酸缓冲液pH7.8；（3）0.1mol/L高锰酸钾标准液：称取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，用0.1mol/L草酸溶液标定；（4）0.1mol/L H2O2：市售30% H2O2大约等于17.6mol/L，取30% H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/ KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；（5）0.1mol/L草酸：称取优级纯H2C2O4 2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1L。 3.器具（1）恒温水浴；（2）研钵；三角瓶50ml4；酸式滴定管（10ml）；容量瓶25ml1等 四、实验步骤1.酶液提取l取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将缓冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。 2.反应l取50ml三角瓶4个（两个测定两个对照），测定瓶中加入酶液2.5ml，对照瓶中加入煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时，于30恒温水浴中保温10min，立即加入10% H2SO4 2.5ml。3.滴定l用0.1mol/L KMn4标准溶液滴定H2O2，至出现粉红色（在30min内不消失）为终点。 五、计算l酶活力用每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示l酶活(mgH2O2/gmin)=l式中： A对照KMnO4滴定毫升数； B酶反应后KMnO4滴定毫升数； VT酶液总量（ml）； V1反应所用酶液量（ml）； F W样品鲜重（g）； 1.71ml 0.1mol/L的KMnO 4相当于1.7mg H2O2 ( ) .A B VFW V tT 171 六、研讨题l 1.影响过氧化氢酶活力测定的因素有哪些?l 2.过氧化氢酶与哪些生化过程有关?l 3.过氧化氢酶的活力测定还有另外一种方法，即紫外吸收法，原理是H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活力。请你查阅资料设计一个应用该方法测定过氧化氢酶活力的实验。