《蛋白质工程》课件

蛋白质工程与食品产业 内容n一、蛋白质的功能与结构n二、蛋白质工程的诞生n三、蛋白质工程的基本步骤和改造方法n四、蛋白质工程在食品产业中的应用 一、蛋白质的功能与结构n 1.1蛋白质的功能n 1.2蛋白质的结构 1.1蛋白质的功能n (1)蛋 白 质 是 构 成 生 命 的 重 要 物 质 之 一n 蛋 白 质 是 一 类 重 要 而 复 杂 的 生 物 大 分 子 ， 它 广 泛 地 存 在于 所 有 生 物 界 的 机 体 之 中 ， 具 有 许 多 重 要 的 作 用 ：n 构 成 生 物 体 新 陈 代 谢 的 几 乎 全 部 的 化 学 反 应 都 是 在 活 性蛋 白 质 -酶 的 催 化 下 进 行 的 ；n 高 等 动 物 的 免 疫 反 应 ， 也 主 要 是 通 过 蛋 白 质 即 抗 原 和 抗体 来 完 成 的 ； n 运 动 时 的 肌 肉 收 缩 靠 的 是 某 些 蛋 白 质 的 相 互 作 用 来 完 成的 ；n 运 输 氧 和 二 氧 化 碳 的 是 血 红 蛋 白 ；n 具 有 代 谢 和 调 节 功 能 的 是 多 种 蛋 白 质 激 素 。 n (2) 蛋 白 质 的 应 用n 蛋 白 质 是 人 类 赖 以 维 持 生 命 的 重 要 营 养 来 源 之一 。 人 们 需 要 从 各 种 肉 、 蛋 、 奶 、 豆 类 等 主 要 食 品中 获 得 所 需 的 蛋 白 质 营 养 。n 用 蛋 白 质 诊 断 和 治 疗 某 些 疾 病 。 淀 粉 酶 、 脂 肪酶 、 蛋 白 酶 用 于 帮 助 消 化 ， 治 疗 某 些 消 化 不 良 性 疾病 ； 胰 岛 素 用 于 治 疗 严 重 的 糖 尿 病 ； 转 氨 酶 作 为 肝病 变 的 指 标 等 。n 食 品 工 业 和 轻 工 业 中 主 要 应 用 蛋 白 质 或 利 用 蛋白 质 的 性 质 制 造 各 种 产 品 。 例 如 ， 酿 造 业 要 用 蛋 白酶 来 增 加 酱 油 的 鲜 味 等 。 用 于 人 类 衣 着 的 羊 毛 、 纺织 品 和 皮 革 主 要 组 成 是 蛋 白 质 。 1.2蛋白质的结构n 氨 基 酸 是 蛋 白 质 的 基 本 结 构 单 位 ， 各 种 氨 基 酸 之 间 通 过肽 键 彼 此 按 直 线 形 头 尾 相 连 ， 构 成 不 同 长 短 的 肽 链 。肽 键 的 形 成 n 肽 链 又 以 一 定 方 式 折 叠 盘 绕 成 独 特 的 空 间 结 构 ， 这 时 才 产 生 具 有生 物 活 性 的 天 然 蛋 白 质 。n 多 肽 链 的 折 叠 可 分 为 四 种 不 同 层 次 的 结 构 。 一 级 结 构 ： 仅 指 肽 链中 的 氨 基 酸 线 型 排 列 顺 序 ， 不 考 虑 空 间 的 排 列 。 牛 胰 岛 素 的 氨 基 酸 序 列 n 二 级 结 构 ： 主 链 原 子 的 局 部 空 间 排列 ， 不 包 括 侧 链 构 象 和 与 其 他 链 段的 相 互 关 系 ， 如 -螺 旋 、 -折 叠 等主 链 构 象 单 元 就 是 二 级 结 构 。 -螺 旋 三 级 结 构 ： 蛋 白 质 的 多 肽 链 在 各 种 二 级 结 构 的 基 础 上 再进 一 步 盘 曲 或 折 叠 形 成 具 有 一 定 规 律 的 三 维 空 间 结 构 。 碳 酸 酐 酶 的 多 肽 骨 架 示 意 图 n 四 级 结 构 ： 具 有 二 条 或 二 条 以 上 独 立 三 级 结 构 的 多 肽链 组 成 的 蛋 白 质 ， 其 多 肽 链 间 通 过 次 级 键 相 互 组 合 而形 成 的 空 间 结 构 。 其 中 ， 每 个 具 有 独 立 三 级 结 构 的 多肽 链 单 位 称 为 亚 基 。 四 级 结 构 实 际 上 是 指 亚 基 的 立 体排 布 、 相 互 作 用 及 接 触 部 位 的 布 局 。 如 血 红 蛋 白 分 子中 四 个 亚 基 之 间 的 空 间 关 系 。血 红 蛋 白 的 结 构 内容n一、蛋白质的功能与结构n二、蛋白质工程的诞生n三、蛋白质工程的基本步骤和改造方法n四、蛋白质工程在食品产业中的应用 二、蛋白质工程的诞生n 蛋 白 质 工 程 是 指 基 于 蛋 白 质 结 构 功 能 的研 究 结 果 ， 通 过 基 因 工 程 技 术 ， 改 造 现有 蛋 白 质 和 设 计 制 造 新 蛋 白 质 ， 因 而 也称 为 第 二 代 基 因 工 程 。 n 美 国 斯 坦 福 大 学 的 Charles Yanofsky教 授 ， 在 1987年 的 美 国 微生 物 学 会 的 年 会 上 说 ， 生 物 理 论 和 技 术 在 下 列 九 方 面 的 发展 促 进 了 蛋 白 质 工 程 的 诞 生 。 新 的 克 隆 技 术 ， 特 别 是 完整 的 cDNA的 克 隆 技 术 ； 快 速 测 定 DNA序 列 的 方 法 ； 从DNA序 列 推 算 蛋 白 质 序 列 的 较 好 的 计 算 机 程 序 系 统 ； 蛋白 质 序 列 数 据 库 的 建 立 ， 使 一 级 结 构 相 似 的 蛋 白 质 能 被 很快 地 鉴 定 出 来 ， 并 由 此 研 究 其 功 能 上 的 相 似 性 ； 对 原 核生 物 和 真 核 生 物 基 因 表 达 调 控 的 进 一 步 深 入 了 解 ； 用 于基 因 体 外 诱 变 的 化 学 、 酶 学 和 合 成 技 术 的 进 展 ； X-光 晶体 学 的 进 展 ， 包 括 较 好 的 长 晶 体 策 略 、 同 步 辐 射 的 应 用 、电 子 区 域 检 测 器 的 出 现 ， 以 及 计 算 机 辅 助 的 数 据 分 析 ； 用 计 算 机 图 像 系 统 为 工 具 直 接 观 察 晶 体 数 据 ； 核 磁 共 振技 术 的 改 进 ， 使 溶 液 中 的 原 子 分 布 能 得 到 直 接 检 测 。 内容n一、蛋白质的功能与结构n二、蛋白质工程的诞生n三、蛋白质工程的基本步骤和改造方法n四、蛋白质工程在食品产业中的应用 三、蛋白质工程的基本步骤和改造方法n 3.1 蛋白质工程研究的基本步骤n 3.2 蛋白质改造方法 3.1 蛋白质工程研究的基本步骤n 分 离 纯 化 目 的 蛋 白 ， 使 之 结 晶 并 作 X晶 体 衍 射 分 析 ， 结合 核 磁 共 振 等 其 他 方 法 的 分 析 结 果 ， 得 到 其 空 间 结 构的 尽 可 能 多 的 信 息 。n 对 目 的 蛋 白 的 功 能 作 详 尽 的 研 究 ， 确 定 它 的 功 能 域 。n 通 过 对 蛋 白 质 的 一 级 结 构 、 空 间 结 构 和 功 能 之 间 的 相互 关 系 的 分 析 ， 找 出 关 键 的 基 团 和 结 构 。n 在 蛋 白 质 结 构 与 功 能 研 究 的 基 础 上 ， 借 助 于 计 算 机 图像 显 示 和 分 子 辅 助 设 计 ， 提 出 对 目 的 蛋 白 分 子 的 改 建或 构 建 方 案 ， 并 用 基 因 工 程 的 方 法 去 实 施 。 n 对 经 过 改 造 的 蛋 白 质 进 行 功 能 性 测 定 ， 看 看 改 造 的 效果 如 何 。 蛋 白 质 工 程 的 程 序 3.2 蛋白质改造方法n 3.2.1 天然蛋白质的改造n 3.2.1.1 基因的定向诱变技术n 3.2.1.2 结构域的拼接 3.2.1.1 基因的定向诱变技术n 一 般 ， 含 有 单 一 或 少 数 几 个 突 变 位 点 的基 因 定 向 改 变 可 以 采 用 M13-DNA寡 聚 核苷 酸 介 导 诱 变 技 术 、 寡 核 苷 酸 介 导 的PCR诱 变 技 术 、 随 机 诱 变 技 术 和 盒 式 突变 技 术 。 （1）M13-DNA寡聚核苷酸介导诱变技术.将 要 改 造 的 蛋 白 质 的 目 的 基 因 插 入 到 M13单 链 DNA中作 为 模 板 ， 以 含 有 要 改 变 的 碱 基 的 一 段 寡 聚核 苷 酸 作 为 引 物 ， 在 体 外 用 DNA聚 合 酶 进 行双 链 DNA的 合 成 ， 用 DNA连 接 酶 连 接 成 环状将 杂 合 DNA双 链 再 转 入 大 肠 杆 菌 中 将 含 突 变 目 的 基 因 的 M13噬 菌 体 筛 选 出 来 ，提 取 它 们 的 DNA， 用 限 制 性 内 切 酶 把 突 变 目的 基 因 切 下 ， 并 重 组 到 表 达 质 粒 中 （2）寡核苷酸介导的PCR诱变技术将目的基因克隆到质粒载体上设计两对引物由于两个反应物中引物的位置不同，PCR扩增后，产物有不同的末端 将两管PCR产物混合、变性、复性、退火，形成有两个切口的环状DNA，转入大肠杆菌。 （3）随机诱变技术将 待 突 变 基 因 克 隆 到 质 粒 上 ， 使 基因 旁 有 两 个 特 殊 的 限 制 性 酶 切 位 点用 大 肠 杆 菌 核 酸 外 切 酶 EIII从3 -凹 陷 端 降 解 DNA 用 修 复 后 的 质 粒 转 化 大 肠 杆 菌 大 肠 杆 菌 DNA聚 合 酶 的 Klenow片 段 是 完 整 的DNA聚 合 酶 的 一 个 片段 ， 只 有 在 5 3聚 合酶 活 性 和 3 5 外 切酶 活 性 ， 失 去 了 5 3外 切 酶 活 性反 应 一 段 时 间 后 终 止 反 应 ， 再 用Klenow片 段 补 平 （4）盒式突变技术在目标基因中选择合适的限制性内切酶位点用含有突变序列的DNA片段来置换目标基因上的一段DNA序列产生突变序列被集中在目标基因的一个特定区域的突变家族 产生突变序列被集中在目标基因的一个特定区域的突变家族 n 进 行 盒 式 突 变 ， 需 要 解 决 两 个 关 键 问 题 ：n 一 个 是 在 目 标 基 因 序 列 中 ， 要 有 适 当 的 限 制 性 内 切酶 识 别 位 点 ， 使 得 用 以 取 代 天 然 DNA序 列 的 盒 式 突 变序 列 可 以 有 效 地 插 入 到 目 标 基 因 中 。n 另 一 个 是 ， 如 何 得 到 各 种 合 适 的 、 用 以 取 代 目 标 基因 中 特 定 DNA片 段 的 突 变 DNA片 段 。 值 得 注 意 的 是 ，突 变 序 列 的 两 端 必 须 分 别 具 有 与 目 标 基 因 上 相 匹 配 的的 限 制 性 内 切 酶 识 别 位 点 。 n 盒 式 突 变 技 术 的 实 际 应 用 ：n 加 酶 洗 衣 粉 是 人 们 日 常 生 活 中 常 用 的 东 西 ， 在 洗 衣粉 中 常 加 入 的 酶 是 枯 草 杆 菌 蛋 白 酶 。 枯 草 杆 菌 蛋 白 酶有 一 个 弱 点 ， 一 遇 到 漂 白 剂 ， 就 会 被 破 坏 而 失 去 活 性。 枯 草 杆 菌 酶 氧 化 失 活 的 原 因 是 由 于 第 222位 的 甲 硫 氨酸 的 被 氧 化 造 成 的 ， 但 还 不 知 道 哪 一 种 氨 基 酸 替 换 甲硫 氨 酸 能 维 持 酶 的 活 性 ， 并 同 时 使 它 具 有 抗 氧 化 的 特性 。 使 用 盒 式 突 变 技 术 ， 1985年 发 现 只 有 半 光 氨 酸 取代 的 突 变 酶 活 力 比 原 酶 提 高 138%， 并 可 在 过 氧 化 氢 （一 种 氧 化 剂 ） 存 在 小 时 不 丢 失 酶 活 力 。 这 样 就 制 成了 合 乎 需 要 的 漂 白 加 酶 洗 衣 粉 了 。 3.2.1.2 结构域的拼接n 结 构 域 是 蛋 白 质 构 象 中 二 级 结 构 与 三 级 结 构 之 间 的 一个 层 次 。 在 较 大 的 蛋 白 质 分 子 中 ， 由 于 多 肽 链 上 相 邻的 超 二 级 结 构 紧 密 联 系 ， 形 成 二 个 或 多 个 在 空 间 上 可以 明 显 区 别 它 与 蛋 白 质 亚 基 结 构 的 区 别 。n 结 构 域 拼 接 是 通 过 基 因 操 作 把 位 于 两 种 不 同 蛋 白 质 上的 几 个 结 构 域 连 接 在 一 起 ， 形 成 融 合 蛋 白 ， 它 兼 有 原来 两 种 蛋 白 的 性 质 。 n 金 属 硫 蛋 白 是 一 类 小 分 子 量 的 球 蛋 白 ， 哺 乳 动 物 中 的 金 属硫 蛋 白 分 子 由 61个 氨 基 酸 残 基 组 成 ， 分 为 两 个 结 构 域 ， 分别 叫 结 构 域 和 结 构 域 。 结 构 域 能 结 合 4个 金 属 离 子 ， 趋向 于 与 镉 和 汞 结 合 ； 而 结 构 域 能 结 合 3个 金 属 离 子 ， 趋 向于 与 锌 和 铜 结 合 。 实 验 表 明 ， 结 构 域 结 合 镉 的 能 力 比 结构 域 高 出 1000倍 以 上 。n 用 计 算 机 分 子 模 型 软 件 对 金 属 硫 蛋 白 的 空 间 结 构 进 行 分 析表 明 ， 天 然 金 属 硫 蛋 白 的 两 个 结 构 域 之 间 具 有 较 大 的 独 立性 ， 是 可 以 拆 分 和 构 建 的 ， 因 而 构 建 结 构 域 的 “ 二 倍 体 ”的 设 想 是 可 行 的 。n 用 化 学 合 成 的 方 法 分 别 合 成 结 构 域 和 连 接 肽 段 的 基 因 ， 并设 法 将 它 们 拼 接 起 来 。 再 插 入 载 体 并 转 入 植 物 细 胞 中 ， 使金 属 硫 蛋 白 的 结 构 域 多 倍 体 基 因 在 植 物 中 表 达 。 3.2.2 合成全新蛋白质n 基 于 天 然 蛋 白 质 结 构 改 造 的 蛋 白 质 工 程可 以 优 化 蛋 白 质 的 活 性 ， 而 全 新 蛋 白 质设 计 是 合 成 具 有 新 奇 的 结 构 与 功 能 的 新蛋 白 质 。 从 头 设 计 一 个 蛋 白 质 的 基 本 步 骤 ： 构 建 一 个 多 肽 链 骨 架模 型从 已 知 三 维 结 构 的 数 据 库 中 挑 选 出一 个 合 适 的 片 段 ， 进 行 修 改 和 组 合 依 据 氨 基 酸 残 基 的 统 计 学 数 据 和 排列 的 优 先 顺 序 ， 确 定 每 个 残 基 位 置上 的 氨 基 酸优 化 目 标 蛋 白 的 三 维 模 型 检 验 和 考 核 所 给 定 的 目 标 蛋 白 质 结构 是 否 合 理 ， 对 所 设 计 的 模 型 做 进一 步 修 正 几 轮 的 设 计 、 检 验 和 再 设 计 ， 获 得一 个 正 确 折 叠 和 带 有 人 们 预 期 功 能的 目 标 蛋 白 质 内容n一、蛋白质的功能与结构n二、蛋白质工程的诞生n三、蛋白质工程的基本步骤和改造方法n四、蛋白质工程在食品产业中的应用 四、蛋白质工程在食品产业中的应用n 在 实 际 生 产 中 ， 可 以 应 用 蛋 白 质 工 程 对 一些 生 产 中 重 要 酶 或 蛋 白 质 性 质 加 以 改 造 ，提 高 现 有 酶 或 蛋 白 质 的 工 业 实 用 性 ， 如 提高 酶 的 热 稳 定 性 、 改 变 酶 的 最 适 pH值 条件 、 提 高 酶 的 催 化 活 性 等 。 例 如 ， 通 过 引入 二 硫 键 ， 改 善 酶 的 热 稳 定 性 。 n 溶 菌 酶 是 一 种 广 泛 应 用 于 食 品 工 业 的 酶 制 剂 ， 其 催 化 速 率随 温 度 升 高 而 升 高 ， 因 此 ， 它 的 热 稳 定 性 是 提 高 其 应 用 潜力 的 重 要 标 准 。n 蛋 白 质 晶 体 结 构 研 究 表 明 ， T4溶 菌 酶 分 子 的 一 个 重 要 特 性是 在 第 97位 和 54位 残 基 上 是 两 个 未 形 成 二 硫 键 的 半 胱 氨 酸 ，所 以 ， 设 想 通 过 在 分 子 中 增 加 一 对 或 数 对 二 硫 键 ， 来 提 高酶 热 稳 定 性 。n 研 究 表 明 ， 采 用 定 位 突 变 技 术 使 该 菌 肽 链 第 9位 和 第 164位 氨基 酸 残 基 转 变 为 半 胱 氨 酸 ， 并 形 成 一 对 二 硫 键 ， 获 得 的 突变 体 的 酶 活 性 高 于 天 然 酶 6%， 熔 点 温 度 提 高 6.4度 ， 显 然 ，新 引 入 的 “ 工 程 二 硫 键 ” 能 够 稳 定 两 个 结 构 域 之 间 的 相 对位 置 ， 进 而 稳 定 了 由 两 个 结 构 域 所 形 成 的 活 性 中 心 。 思考题n 1.什 么 是 蛋 白 质 工 程 ？ 它 与 基 因 工 程 有 何关 联 ？n 2.什 么 是 定 位 突 变 技 术 ？ 它 包 括 哪 些 常 用方 法 ？