《植物组织培养技术》PPT课件

掌 握 培 养 基 配 制 、 培 养 条 件 的 控 制第 四 章 植 物 组 织 培 养 的 培 养 条 件知 识 目 标 ：能 力 目 标 ： ：会 配 制 培 养 基 培 养 基 ： 是 植 物 组 织 培 养 的 重 要 基 质 。 在 离 体 培 养 条件 下 ， 不 同 种 植 物 的 组 织 对 营 养 有 不 同 的 要 求 ， 甚 至 同 一种 植 物 不 同 部 位 的 组 织 对 营 养 的 要 求 也 不 相 同 ， 只 有 满 足了 它 们 各 自 的 特 殊 要 求 ， 它 们 才 能 很 好 地 生 长 。 因 此 ， 没有 一 种 培 养 基 能 够 适 合 一 切 类 型 的 植 物 组 织 或 器 官 ， 在 建立 一 项 新 的 培 养 系 统 时 ， 首 先 必 须 找 到 一 合 适 的 培 养 基 ，培 养 才 有 可 能 成 功 。 营 养 条 件 培 养 基 (culture medium)A 概 念 B 培 养 基 的 种 类 培 养 基 有 许 多 种 类 ， 根 据 不 同 的 植 物 和 培 养 部 位 及 不 同 的 培 养目 的 需 选 用 不 同 的 培 养 基 。 培 养 基 的 产 生 最 早 是 Sacks(1680)和 Knop(1681)， 他 们 对 绿 色植 物 的 成 分 进 行 了 分 析 研 究 ， 根 据 植 物 从 土 中 主 要 是 吸 收 无 机 盐营 养 ， 设 计 出 了 由 无 机 盐 组 成 的 Sacks和 Knop溶 液 ， 至 今 仍 在 作为 基 本 的 无 机 盐 培 养 基 得 到 广 泛 应 用 。 以 后 根 据 不 同 目 的 进 行 改良 产 生 了 多 种 培 养 基 ， White培 养 基 在 40年 代 用 得 较 多 ， 现 在 还常 用 。 而 到 60和 70年 代 则 大 多 采 用 MS等 高 浓 度 培 养 基 ， 可 以 保 证培 养 材 料 对 营 养 的 需 要 ， 并 能 生 长 快 、 分 化 快 ， 且 由 于 浓 度 高 ，在 配 制 、 消 毒 过 程 中 某 些 成 分 有 些 出 入 ， 也 不 致 影 响 培 养 基 的 离子 平 衡 。 培 养 基 的 名 称 ， 一 直 根 据 沿 用 的 习 惯 。 多 数 以 发 明 人 的 名 字 来 命名 ， 如 White培 养 基 ， Murashige和 Skoog培 养 基 (简 称 MS培 养 基 )， 也 有 对 某 些 成 分 进 行 改 良 称 作 改 良 培 养 基 。 (1)MS培 养 基 它 是 1962年 由 Murashige和 Skoog为 培 养 烟 草 细 胞 而 设 计 的 。特 点 是 无 机 盐 和 离 子 浓 度 较 高 ， 为 较 稳 定 的 平 衡 溶 液 。 其 养 分 的 数 量 和比 例 较 合 适 ， 可 满 足 植 物 的 营 养 和 生 理 需 要 。 它 的 硝 酸 盐 含 量 较 其 他 培养 基 为 高 ， 广 泛 地 用 于 植 物 的 器 官 、 花 药 、 细 胞 和 原 生 质 体 培 养 ， 效 果良 好 。 有 些 培 养 基 是 由 它 演 变 而 来 的 。 (2)B5培 养 基 是 1968年 由 Galmborg等 为 培 养 大 豆 根 细 胞 而 设 计 的 。 其 主要 特 点 是 含 有 较 低 的 铵 ， 这 可 能 对 不 少 培 养 物 的 生 长 有 抑 制 作 用 。 从 实践 得 知 有 些 植 物 在 B5培 养 基 上 生 长 更 适 宜 ， 如 双 子 叶 植 物 特 别 是 木 本 植 物 。 (3)White培 养 基 是 1943年 由 White为 培 养 番 茄 根 尖 而 设 计 的 。 1963年 又作 了 改 良 ， 称 作 White改 良 培 养 基 ， 提 高 了 MsSO4的 浓 度 和 增 加 了 硼 素 。 其特 点 是 无 机 机 盐 数 量 较 低 ， 适 于 生 根 培 养 。 （ 4） N 6培 养 基 是 1974年 朱 至 清 等 为 水 稻 等 禾 谷 类 作 物 花 药 培 养 而 设 计 的 。其 特 点 是 成 分 较 简 单 ， KNO3和 （ NH4） 2SO4含 量 高 。 在 国 内 已 广 泛 应 用 于 小麦 、 水 稻 及 其 他 植 物 的 花 药 培 养 和 其 他 组 织 培 养 。 (5)KM 8P培 养 基 它 是 1974年 为 原 生 质 体 培 养 而 设 计 的 。 其 特 点 是 有 机成 分 较 复 杂 ， 它 包 括 了 所 有 的 单 糖 和 维 生 素 ， 广 泛 用 于 原 生 质 融 合 的 培养 。 目 前 国 际 上 流 行 的 培 养 基 有 几 十 种 ， 常 用 的 培 养 基 及 特 点 如 下 ： C 培 养 基 的 成 分 培 养 基 的 成 分 主 要 可 以 分 水 、 无 机 盐 、 有 机 物 、天 然 复 合 物 、 培 养 体 的 支 持 材 料 等 五 大 类 。 是 植 物 原 生 质 体 的 组 成 成 分 ， 也 是 一 切 代 谢 过 程的 介 质 和 溶 媒 。 它 是 生 命 活 动 过 程 中 不 可 缺 少 的物 质 。 配 制 培 养 基 母 液 时 要 用 蒸 馏 水 ， 以 保 持 母液 及 培 养 基 成 分 的 精 确 性 ， 防 止 贮 藏 过 程 发 霉 变质 。 大 规 模 生 产 时 可 用 自 来 水 。 但 在 少 量 研 究 上尽 量 用 蒸 馏 水 ， 以 防 成 分 的 变 化 引 起 不 良 效 果 。 1 水 2 无 机 元 素 (inorganic element) (1)N 是 蛋 白 质 、 酶 、 叶 绿 素 、 维 生 素 、 核 酸 、 磷 脂 、 生 物 碱 等的 组 成 成 分 ， 是 生 命 不 可 缺 少 的 物 质 。 在 制 备 培 养 基 时 以 NO3N和 NH 4N两 种 形 式 供 应 。 大 多 数 培 养 基 既 含 有 N03N又 含NH 4N。 NH 4N对 植 物 生 长 较 为 有 利 。 供 应 的 物 质 有 KNO3、NH 4NO3等 。 有 时 ， 也 添 加 氨 基 酸 来 补 充 氮 素 。 (2)P 是 磷 脂 的 主 要 成 分 。 而 磷 脂 又 是 原 生 质 、 细 胞 核 的 重 要 组成 部 分 。 磷 也 是 ATP、 ADP等 的 组 成 成 分 。 在 植 物 组 织 培 养 过 程中 ， 向 培 养 基 内 添 加 磷 ， 不 仅 增 加 养 分 、 提 供 能 量 ， 而 且 也 促 进对 N的 吸 收 ， 增 加 蛋 白 质 在 植 物 体 中 的 积 累 。 常 用 的 物 质 有 KH 2P04或 NaH 2P04等 。大 量 元 素 ： 指 浓 度 大 于 0.5mmol L的 元 素 。 其 作 用 是 ： (3)K 对 碳 水 化 合 物 合 成 、 转 移 、 以 及 氮 素 代 谢 等 有 密 切关 系 。 K增 加 时 ， 蛋 白 质 合 成 增 加 ， 维 管 束 、 纤 维 组 织 发达 ， 对 胚 的 分 化 有 促 进 作 用 。 但 浓 度 不 易 过 大 ， 一 般 为1 3mg L为 好 。 制 备 培 养 基 时 ， 常 以 KCI、 KN03等 盐 类 提供 。 (4)Mg、 S和 Ca、 Mg 是 叶 绿 素 的 组 成 成 分 ， 又 是 激 酶 的 活化 剂 ； S是 含 S氨 基 酸 和 蛋 白 质 的 组 成 成 分 。 它 们 常 以MgSO4 7H20提 供 。 用 量 为 1 3mg l较 为 适 宜 ； Ca是 构 成细 胞 壁 的 一 种 成 分 ， Ca对 细 胞 分 裂 、 保 护 质 膜 不 受 破 坏 有显 著 作 用 ， 常 以 CaCl 2 2H2O提 供 。 铁 是 一 些 氧 化 酶 、 细 胞 色 素 氧 化 酶 、 过 氧 化 氢 酶 等 的 组 成 成分 。 同 时 ， 它 又 是 叶 绿 素 形 成 的 必 要 条 件 。 培 养 基 中 的 铁 对胚 的 形 成 、 芽 的 分 化 和 幼 苗 转 绿 有 促 进 作 用 。 在 制 做 培 养 基 时 不 用 Fe2SO4， 和 FeCl3(因 其 在 pH值 5 2以 上 ，易 形 成 Fe(OH)3的 不 溶 性 沉 淀 )， 而 用 FeSO4 7H20和 Na2 EDTA结 合 成 合 物 使 用 。 B， Mn， Zn， Cu， Mo， Co等 ， 也 是 植 物 组 织 培 养 中 不 可 缺 少 的元 素 ， 缺 少 这 些 物 质 会 导 致 生 长 、 发 育 异 常 现 象 。 微 量 元 素 ： 指 小 于 0.5mmol L的 元 素 ， Fe， B， Mn， Cu， Mo， Co等 。 3 有 机 化 合 物 (organic compound) 培 养 基 中 若 只 含 有 大 量 元 素 与 微 量 元 素 ， 常 称 为基 本 培 养 基 （ basic medium)。 为 不 同 的 培 养 目 的 往 往 要 加 入 一 些 有 机 物 以 利 于快 速 生 长 。 常 加 入 的 有 机 成 分 主 要 有 以 下 几 类 ： 高 压 灭 菌 时 ， 一 部 分 糖 会 发 生 分 解 ， 制 定 配 方 时 要 给 予 考 虑 。1） 碳 水 化 合 物 最 常 用 的 碳 源 是 蔗 糖 ， 葡 萄 糖 和 果 糖 也 是 较 好 的 碳 源 ， 可 支 持 许多 组 织 很 好 的 生 长 。蔗 糖 使 用 浓 度 在 2% 3%， 常 用 3%， 即 配 制 一 升 培 养 基 称 取 30g蔗糖 ， 有 时 可 用 2.5%， 但 在 胚 培 养 时 采 用 4%-15%的 高 浓 度 ， 因 蔗 糖对 胚 状 体 的 发 育 起 重 要 作 用 。不 同 植 物 不 同 组 织 的 糖 类 需 要 量 也 不 同 ， 实 验 时 要 根 据 配 方 规 定按 量 称 取 ， 不 能 任 意 取 量 。在 大 规 模 生 产 时 ， 可 用 食 用 的 绵 白 糖 代 替 。 VB1对 愈 伤 组 织 的 产 生 和 生 活 力 有 重 要 作 用 ， VB6能 促 进 根 的 生长 ， Vpp与 植 物 代 谢 和 胚 的 发 育 有 一 定 关 系 。 Vc有 防 止 组 织 变褐 的 作 用 。 2） 维 生 素 (vitamin)这 类 化 合 物 在 植 物 细 胞 里 主 要 是 以 各 种 辅 酶 的 形 式 参 与 多 种 代 谢活 动 ， 对 生 长 、 分 化 等 有 很 好 的 促 进 作 用 。主 要 有 VBl(盐 酸 硫 胺 素 )、 VB6(盐 酸 吡 哆 醇 )、 Vpp(烟 酸 )、 Vc（ 抗 坏 血 酸 ） 、 有 时 还 使 用 生 物 素 、 叶 酸 、 VB12等 。一 般 用 量 为 0 11 0mg L。 3） 肌 醇 (myoinosltol)在 糖 类 的 相 互 转 化 中 起 重 要 作 用 。 用 于 构 建 细 胞 壁 、 细 胞 膜 。使 用 浓 度 一 般 为 lOOmg L。 4） 氨 基 酸 (almino acide)是 很 好 的 有 机 氮 源 ， 可 直 接 被 细 胞 吸 收 利 用 。培 养 基 中 最 常 用 的 氨 基 酸 是 甘 氨 酸 。用 量 在 10-1000mg L之 间 。由 于 它 们 营 养 丰 富 ， 极 易 引 起 污 染 。 如 在 培 养 中 无 特 别 需 要 ，以 不 用 为 宜 。 4 天 然 复 合 物 其 成 分 比 较 复 杂 ， 大 多 含 氨 基 酸 、 激 素 、 酶 等 一些 复 杂 化 合 物 。 它 对 细 胞 和 组 织 的 增 殖 与 分 化 有明 显 的 促 进 作 用 ， 但 对 器 官 的 分 化 作 用 不 明 显 。它 的 成 分 大 多 不 清 楚 ， 所 以 一 般 应 尽 量 避 免 使 用 。 1)椰 乳 是 椰 子 的 液 体 胚 乳 。 它 是 使 用 最 多 、 效 果 最 大 的 一 种 天 然 复 合物 。 一 般 使 用 浓 度 在 10% 20%， 与 其 果 实 成 熟 度 及 产 地 关 系 也 很 大 。 它 在愈 伤 组 织 和 细 胞 培 养 中 有 促 进 作 用 。 在 马 铃 薯 茎 尖 分 生 组 织 和 草 莓 微 茎 尖培 养 中 起 明 显 的 促 进 作 用 ， 但 茎 尖 组 织 的 大 小 若 超 过 1nun时 ， 椰 乳 就 不 发生 作 用 。 2 香 蕉 用 量 为 150-200ml L。 用 黄 熟 的 小 香 蕉 ， 加 入 培 养 基 后 变 为 紫 色 。对 pH值 的 缓 冲 作 用 大 。 主 要 在 兰 花 的 组 织 培 养 中 应 用 ， 对 发 育 有 促 进 作 用 。 3)马 铃 薯 (potato) 去 掉 皮 和 芽 后 ， 加 水 煮 30min， 再 经 过 过 滤 ， 取 其滤 液 使 用 。 用 量 为 150 200g L。 对 pH值 缓 冲 作 用 也 大 。 添 加 后 可 得 到 健壮 的 植 株 。 4)水 解 酪 蛋 白 为 蛋 白 质 的 水 解 物 ， 主 要 成 分 为 氨 基 酸 ， 使 用 浓 度 为100 200mg L。 受 酸 和 酶 的 作 用 易 分 解 ， 使 用 时 要 注 意 。 5)其 他 酵 母 提 取 液 (YE)(0.01%-0.05%)， 主 要 成 分 为 氨 基 酸 和 维 生 素 类 ；麦 芽 提 取 液 (0.01% 0.5%)、 苹 果 和 番 茄 的 果 汁 、 黄 瓜 的 果 实 、 未 熟 玉 米 的胚 乳 等 。 遇 热 较 稳 定 ， 大 多 在 培 养 困 难 时 使 用 ， 有 时 有 效 。 5 植 物 生 长 调 节 物 (hormone) 植 物 激 素 是 植 物 新 陈 代 谢 中 产 生 的 天 然 化 合 物 ，它 能 以 极 微 小 的 量 影 响 到 植 物 的 细 胞 分 化 、 分 裂 、发 育 ， 影 响 到 植 物 的 形 态 建 成 、 开 花 、 结 实 、 成熟 、 脱 落 、 衰 老 和 休 眠 以 及 萌 发 等 许 许 多 多 的 生理 生 化 活 动 ， 在 培 养 基 的 各 成 分 中 ， 植 物 生 长 调节 物 是 培 养 基 的 关 键 物 质 ， 对 植 物 组 织 培 养 起 着决 定 性 作 用 。 1） 生 长 素 类 (auxin)在 组 织 培 养 中 ， 生 长 素 主 要 被 用 于 诱 导 愈 伤 组 织 形 成 ， 诱 导 根 的分 化 和 促 进 细 胞 分 裂 、 伸 长 生 长 。在 促 进 生 长 方 面 ， 根 对 生 长 素 最 敏 感 。 在 极 低 的 浓 度 下 ， (10-510-8rng L)就 可 促 进 生 长 ， 其 次 是 茎 和 芽 。天 然 的 生 长 素 热 稳 定 性 差 ， 高 温 高 压 或 受 光 条 件 易 被 破 坏 。 在 植物 体 内 也 易 受 到 体 内 酶 的 分 解 。组 织 培 养 中 常 用 人 工 合 成 的 生 长 素 类 物 质 。 IAA(indo acetic acid吲 哚 乙 酸 )是 天 然 存 在 的 生 长 素 ， 亦 可 人 工合 成 ， 其 活 力 较 低 ， 是 生 长 素 中 活 力 最 弱 的 激 素 ， 对 器 官 形 成的 副 作 用 小 、 ， 高 温 高 压 易 被 破 坏 ， 也 易 被 细 胞 中 的 1AA分 解酶 降 解 ， 受 光 也 易 分 解 。 NAA(naphthalene acetic acid萘 乙 酸 )在 组 织 培 养 中 的 起 动 能 力要 比 IAA高 出 3-4倍 ， 且 由 于 可 大 批 量 人 工 合 成 ， 耐 高 温 高 压 ，不 易 被 分 解 破 坏 ， 所 以 应 用 较 普 遍 。 NAA和 IBA广 泛 用 于 生 根 ，并 与 细 胞 分 裂 素 互 作 促 进 芽 的 增 殖 和 生 长 。 IBA(indolebutyri acid吲 哚 丁 酸 )是 促 进 发 根 能 力 较 强 的 生 长 调节 物 质 。 2， 4D(2， 4二 氯 苯 氧 乙 酸 )起 动 能 力 比 IAA高 10倍 ， 特 别 在促 进 愈 伤 组 织 的 形 成 上 活 力 最 高 ， 但 它 强 烈 抑 制 芽 的 形 成 ， 影响 器 官 的 发 育 。 适 宜 的 用 量 范 围 较 狭 窄 ， 过 量 常 有 毒 效 应 。 在 培 养 基 中 添 加 细 胞 分 裂 素 有 三 个 作 用 ： 诱 导 芽 的 分 化 促 进 侧 芽 萌 发 生 长 。 促 进 细 胞 分 裂 与 扩 大 。 抑 制 根 的 分 化 。 因 此 ， 细 胞 分 裂 素 多 用 于 诱 导 不 定 芽 的 分 化 和茎 、 苗 的 增 殖 ， 而 在 生 根 培 养 时 使 用 较 少 或 用 量 较 低 。2） 细 胞 分 裂 素 类 ( cytokinin )这 类 激 素 是 腺 嘌 吟 的 衍 生 物 ， 包 括 6BA(6苄 基 氨 基 嘌 呤 )、 Kt (kinetin 激 动 素 )、 Zt (zeatin 玉 米 素 )等 。 其 中 Zt活 性 最 强 ， 但 非常 昂 贵 ， 常 用 的 是 6BA。 有 20多 种 ， 培 养 基 中 添 加 的 是 GA3。 主 要 用 于 促 进 幼 苗 茎 的 伸 长 生 长 ， 促 进 不 定 胚发 育 成 小 植 株 。 赤 霉 素 和 生 长 素 协 同 作 用 ， 对 形 成 层 的 分 化 有影 响 ， 当 生 长 素 赤 霉 素 比 值 高 时 有 利 于 木 质部 分 化 ， 比 值 低 时 有 利 于 韧 皮 部 分 化 。GA ( gibberellic acid赤 霉 素 ) 激 素 配 比 模 式 高 有 利 于 根 的 形 成 和 愈 伤 组 织 的 形 成 生 长 素 /细 胞 分 裂 素 适 中 有 利 于 根 芽 的 分 化 低 有 利 于 芽 的 形 成生 长 素 与 细 胞 分 裂 素 的 比 例 决 定 着 发 育 的 方 向 ， 是 愈 伤 组 织 、 长 根 还 是 长 芽 。 如 为 了 促 进 芽 器 官 的 分 化 ， 应 除 去 或 降 低 生 长 素 的 浓 度 ， 或 者 调 整 培 养 基 中 生 长 素 与 细 胞 分 裂 素 的 比 例 。 在 组 织 培 养 中 一 般 生 长 素 浓 度 的 使 用 为 0.05-5mg L， 细 胞 分 裂 素 0.0510mg L。生 长 调 节 物 质 的 使 用 甚 微 ， 一 般 用 mg L表 示 浓 度 。 G rowth medium is optimised for regeneration of plantlets No sucrose (0%)Sucrose reduced to 1% Sucrose increased to 5%The explant is completely covered with green shoots, and roots are developing on the lower surface Very few shoots have developed on the explant. No roots and no callus.Shoots developed on edges of upper surface, and some root development has occured Shoots have developed over the surface of the explant, along with roots from the lower surface. The result is comparable with the control mediumtissue culture in the African Violet No BAP BAP reduced to 0.1 mg. l-1 No NAA Poor shoot development and no roots. Extensive callus generationPoor shoot development and no roots NAA reduced to 0.1 mg. l-1 More balanced development of roots and shoots. However, undifferentiated callus is developing at the edges of the explantProfuse development of roots and a reduced number of shoots. Undifferentiated callus is developing at the edges of the explant NAA increased to 5.0 mg. l-1Profuse development of roots over the explant upper and lower surface, and few shoots. Some callus No MS saltsNo sign of regeneration from explant at all. MS salts reduced to 0.47 g. l -1 Some root growth but reduced development of shoots MS salts increased to 9.52 g. l-1 Shoots developed on upper surface of explant. No roots or callus. 6 培 养 材 料 的 支 持 物 琼 脂 是 一 种 由 海 藻 中 提 取 的 高 分 子 碳 水 化 合 物 ， 本 身 并 不 提 供 任何 营 养 。 琼 脂 能 溶 解 在 热 水 中 ， 成 为 溶 胶 ， 冷 却 至 40C即 凝 固 为固 体 状 凝 胶 。 琼 脂 的 用 量 在 6 10g L之 间 ， 若 浓 度 太 高 ， 培 养 基 就 会 变 得 很硬 ， 营 养 物 质 难 以 扩 散 到 培 养 的 组 织 中 去 。 若 浓 度 过 低 ， 凝 固 性不 好 。 新 买 来 的 琼 脂 最 好 先 试 一 下 它 的 凝 固 力 。 一 般 琼 脂 以 颜 色 浅 、 透 明 度 好 、 洁 净 的 为 上 品 。 琼 脂 的 凝 固 能 力除 与 原 料 、 厂 家 的 加 工 方 式 有 关 外 ， 还 与 高 压 灭 菌 时 的 温 度 、 时间 、 pH值 等 因 素 有 关 ， 长 时 间 的 高 温 会 使 凝 固 能 力 下 降 ， 过 酸 过碱 加 之 高 温 会 使 琼 脂 发 生 水 解 ， 丧 失 凝 固 能 力 。 时 间 过 久 ， 琼 脂 变 褐 ， 也 会 逐 渐 丧 失 凝 固 能 力 。 琼 脂 (agar) 在 固 体 培 养 时 琼 脂 是 最 好 的 固 化 剂 。 培 养 物 与 培 养 基 的 接 触 (即 吸 收 )面 积 小 ，各 种 养 分 在 琼 脂 中 扩 散 较 慢 ， 影 响 养 分 的 充 分 利 用 ，培 养 物 排 出 的 一 些 代 谢 废 物 ， 聚 集 在 吸 收 表 面 ， 对 组 织 产 生 毒 害 作 用 。市 售 的 各 种 琼 脂 几 乎 都 含 有 杂 质 ， 特 别 是 Ca、 Mg及 其 他 微 量 元 素 。加 入 琼 脂 的 固 体 培 养 基 与 液 体 培 养 基 相 比 优 缺 点 ：优 点 ：在 于 操 作 简 便 ， 通 气 问 题 易 于 解 决 ， 便 于 经 常 观 察 研 究 等 ，缺 点 ： 因 此 在 研 究 植 物 组 织 或 细 胞 的 营 养 问 题 时 ， 则 应 避 免 使 用 琼 脂 。可 在 液 体 培 养 基 表 面 安 放 一 个 无 菌 滤 纸 制 成 的 滤 纸 桥 ， 然 后 在滤 纸 桥 上 进 行 愈 伤 组 织 培 养 。 7 抗 生 物 质 (antibiotic) 抗 生 素 对 植 物 组 织 的 生 长 也 有 抑 制 作 用 ， 可 能 某 些 植 物适 宜 用 青 霉 素 ， 而 另 一 些 植 物 却 不 大 适 应 。 在 工 作 中 不 能 以 为 有 了 抗 菌 素 ， 而 放 松 灭 菌 措 施 。 在 停 止 抗 生 素 使 用 后 ， 往 往 污 染 率 显 著 上 升 ， 这 可 能 是原 来 受 抑 制 的 菌 类 又 滋 生 起 来 造 成 。抗 生 物 质 有 青 霉 素 、 链 霉 素 、 庆 大 霉 素 等 ， 用 量 在 520mg/L之 间 。添 加 抗 生 物 质 可 防 止 菌 类 污 染 ， 减 少 培 养 中 材 料 的 损 失 ， 尤 其 是 快速 繁 殖 中对 于 刚 感 染 的 组 织 材 料 ， 可 向 培 养 基 中 注 入 5%10%的 抗 菌 素 。抗 生 素 各 有 其 抑 菌 谱 ， 要 加 以 选 择 试 用 ， 也 可 两 种 抗 生 素 混 用 。注 意 ： 8 活 性 炭 (active carbon) 活 性 炭 为 木 炭 粉 碎 经 加 工 形 成 的 粉 沫 结 构 ， 有 很 强 的吸 附 作 用 ， 它 的 颗 粒 大 小 决 定 着 吸 附 能 力 、 粒 度 越 小 ，吸 附 能 力 越 大 。 温 度 低 吸 附 力 强 ， 温 度 高 吸 附 力 减 弱 ，甚 至 解 吸 附 。 通 常 使 用 浓 度 为 0.5l0g L。 它 可 以 吸 附 非 极 性 物 质和 色 素 等 大 分 子 物 质 ， 包 括 琼 脂 中 所 含 的 杂 质 ， 培 养物 分 泌 的 酚 、 醌 类 物 质 以 及 蔗 糖 在 高 压 消 毒 时 产 生 的5羟 甲 基 糖 醛 及 激 素 等 。 活 性 炭 的 应 用 茎 尖 初 代 培 养 ， 加 入 适 量 活 性 炭 ， 可 以 吸 附 外 植 体 产 生 的 致 死 性褐 化 物 ， 其 效 力 优 于 Vc和 半 胱 氨 酸 ； 在 新 梢 增 殖 阶 段 ， 活 性 炭 可明 显 促 进 新 梢 的 形 成 和 伸 长 ， 但 其 作 用 有 一 个 阈 值 ， 一 般 为0.1% 0.2%， 不 能 超 过 0.2%。 活 性 炭 在 生 根 时 有 明 显 的 促 进 作 用 ， 其 机 理 一 般 认 为 与 活 性 炭 减弱 光 照 有 关 ， 可 能 是 由 于 根 顶 端 产 生 促 进 根 生 长 的 IAA， 但 IAA易受 可 见 光 的 光 氧 化 而 破 坏 ， 因 此 活 性 炭 的 主 要 作 用 就 在 于 通 过 减弱 光 照 保 护 了 IAA， 从 而 间 接 促 进 了 根 的 生 长 ， 由 于 根 的 生 长 加快 ， 吸 收 能 力 增 强 ， 反 过 来 又 促 进 茎 、 叶 的 生 长 。 此 外 ， 在 培 养 基 中 加 入 0.3%活 性 炭 ， 还 可 降 低 玻 璃 苗 的 产 生 频 率 ，对 防 止 产 生 玻 璃 苗 有 良 好 作 用 。 活 性 炭 在 胚 胎 培 养 中 也 有 一 定 作 用 ， 如 在 葡 萄 胚 珠 培 养 时 向 培 养 基 加 入 0.1%的 活 性 炭 ， 可 减 少 组 织 变 褐 和 培 养 基 变 色 ， 产 生 较 少的 愈 伤 组 织 。 但 是 ， 活 性 炭 具 有 副 作 用 ， 研 究 表 示 ， 每 毫 克 的 活性 炭 能 吸 附 l00ng左 右 的 生 长 调 节 物 质 ， 这 说 明 只需 要 极 少 量 的 活 性 炭 就 可 以 完 全 吸 附 培 养 基 中 的 调节 物 质 。 大 量 的 活 性 炭 加 入 会 削 弱 琼 脂 的 凝 固 能 力 ，因 此 要 多 加 一 些 琼 脂 。 很 细 的 活 性 炭 也 易 沉 淀 ， 通常 在 琼 脂 凝 固 之 前 ， 要 轻 轻 摇 动 培 养 瓶 。 总 之 ， 那种 随 意 抓 一 撮 活 性 炭 放 人 培 养 基 ， 会 带 来 不 良 的 后果 。 因 此 ， 在 使 用 时 要 有 其 量 的 意 识 ， 使 活 性 炭 发挥 其 积 极 作 用 。 D 培 养 基 的 制 备 所 谓 母 液 是 欲 配 制 液 的 浓 缩 液 ， 这 样 不 但 可 以 保 证 各 物质 成 分 的 准 确 性 及 配 制 时 的 快 速 移 取 ， 而 且 还 便 于 低 温保 藏 。 一 般 母 液 配 成 比 所 需 浓 度 高 10-200倍 。 母 液 配 制 时 可 分 别 配 成 大 量 元 素 （ 浓 缩 20倍 )、 微 量 元素 (浓 缩 200倍 ） 、 铁 盐 （ 浓 缩 200倍 ） 、 除 蔗 糖 以 外 的有 机 物 质 （ 浓 缩 200倍 ） 和 激 素 类 （ 1g/L） 等 5种 。一 、 母 液 (stock solution)的 配 制 和 保 存1 什 么 是 母 液 ？ 配 制 母 液 时 要 用 蒸 馏 水 或 重 蒸 馏 水 。 药 品 应 选 取 等 级 较 高 的 化 学 纯 或 分 析 纯 。 药 品 的 称 量 及 定 容 都 要 准 确 。 各 种 药 品 先 以 少 量 水 让 其 充 分 溶 解 ， 然 后 依 次 混 合 。 母 液 配 好 后 都 应 贮 存 于 适 当 的 塑 料 瓶 或 玻 璃 瓶 中 ， 置 冰 箱 内 低温 保 存 ， 用 时 再 按 比 例 稀 释 。 铁 盐 贮 备 液 必 须 贮 存 于 棕 色 玻 璃瓶 中 。 母 液 在 使 用 之 前 必 须 轻 轻 摇 动 瓶 子 ， 如 发 现 其 中 有 沉 淀 悬 浮 物或 微 生 物 污 染 ， 必 须 立 即 将 其 淘 汰 。2 母 液 配 制 的 注 意 事 项 ： 生 长 素 配 制 时 可 先 用 少 量 95%酒 精 助 溶 。 2， 4 D可 用 O 1mol L的 NaOH或 KOH助 溶 ， 加 入 温 水 定 容 。 生 长 素 常 配 成 1mg ml的 溶 液贮 于 冰 箱 中 备 用 。 细 胞 分 裂 素 类 一 般 先 用 少 量 1N盐 配 溶 解 后 ， 再 加 入 温 水 冷 却 后 定容 ， 贮 于 冰 箱 中 备 用 。 铁 盐 配 法 （ MS为 例 ） ： 在 装 有 400ml 蒸 馏 水 的 烧 杯 中 加 入 2粒 苛性 钠 ， 溶 解 后 加 入 3.73g EDTA-Na2， 加 热 使 其 全 部 溶 解 ， 然 后 边搅 拌 边 慢 慢 加 入 2.78g FeSO4.7H2O直 至 全 部 溶 解 ， 冷 却 后 定 容 至500ml， 置 于 棕 色 瓶 冰 箱 中 备 用 。二 、 母 液 的 配 制 方 法将 培 养 基 配 方 中 的 各 种 成 分 分 别 配 成 一 定 浓 度 的 母 液 。一 般 用 a:b表 示 ， 即 每 b毫 升 溶 液 中 含 有 a毫 克 溶 质 。2 注 意 事 项 ：1单 配 法 ： 三 、 培 养 基 配 制 程 序水 药 品 糖琼 脂 水玻 璃 器 皿 及 其 他 准 备+ + 加 热 融 化混 匀 混 合调 节 PH 值定 容分 装 灭 菌冷 却接 种 称 出 规 定 数 量 的 琼 脂 和 蔗 糖 ， 加 水 直 到 培 养 基 最 终 容 积的 3/4， 加 热 使 之 溶 解 。 在 配 制 液 体 培 养 基 时 则 无 需 加热 。 分 别 加 入 一 定 量 的 各 种 贮 备 液 ， 包 括 生 长 调 节 剂 和 其 他的 特 殊 加 物 。 加 蒸 馏 水 直 至 培 养 基 的 最 终 容 积 。 充 分 混 合 后 ， 用 0.1mol/L的 氢 氧 化 钠 或 盐 酸 调 节 培 养 基的 pH值 （ 6.0） 。 把 培 养 基 分 装 到 所 选 用 的 培 养 容 器 中 ， 每 个 150毫 升 的三 角 瓶 约 装 50毫 升 。 用 适 宜 的 塞 或 盖 封 严 瓶 口 。 灭 菌 。 使 培 养 基 在 室 温 下 冷 却 ， 置 冰 箱 中 在 4 下 保 存 。 做 上标 记 。 灭 菌 后 的 培 养 基 最 好 在 短 期 内 使 用 ， 临 时 可 在 黑 暗 条 件下 低 温 保 存 。 一 般 不 宜 重 复 消 毒 。 移 液 器四 、 常 用 设 备 移 液 管 电 子 天 平 酸 度 计酸 度 计 简 称 pH计 ， 由 电 极 和 电 计 两 部 分 组 成 。 电 炉 E 培 养 基 的 选 择 在 建 立 一 个 新 的 实 验 体 系 时 ， 为 了 能 研 制 出 一 种 适 合 的 培养 基 ， 最 好 先 由 一 种 已 被 广 泛 使 用 的 基 本 培 养 基 (如 Ms培 养基 或 B5培 养 基 )开 始 。 当 通 过 一 系 列 的 实 验 ， 对 这 种 培 养 基做 了 某 些 定 性 和 定 量 的 小 变 动 之 后 ， 即 有 可 能 得 到 一 种 能满 足 实 验 需 要 的 新 培 养 基 ， 选 择 最 佳 培 养 基 。 常 用 试 验 方 法 主 要 有 单 因 子 试 验 、 多 因 子 试 验 及 广 谱 实 验等 。 一 、 单 因 子 试 验 在 单 因 子 试 验 中 由 于 培 养 基 中 其 他 成 分 都 维 持 在 一 般 水 平上 ， 所 以 只 变 动 一 个 因 子 ， 就 可 以 找 出 这 一 因 子 对 试 验 的 影响 和 影 响 的 程 度 。 例 如 Ms基 本 培 养 基 的 其 他 成 分 和 用 量 都 不变 ， 只 变 动 NAA用 量 对 某 一 培 养 物 生 根 的 影 响 ， 这 种 只 研 究一 个 因 素 的 试 验 就 是 单 因 子 试 验 。 生 物 学 试 验 不 同 于 物 理 学 或 化 学 试 验 ， 最 显 著 的 差 别 是 在 生物 学 试 验 中 必 需 设 置 对 照 组 与 试 验 组 ， 试 验 组 可 以 有 一 组 或几 组 ， 随 试 验 的 复 杂 性 而 设 置 ， 对 照 组 也 可 能 有 一 组 以 上 。试 验 中 要 求 对 照 组 与 试 验 组 中 的 试 验 个 体 ， 即 植 物 组 织 块 或其 他 培 养 物 ， 必 须 在 遗 传 性 、 生 理 状 态 、 前 培 养 条 件 等 方 面 ，尽 可 能 完 全 一 致 。 以 保 证 试 验 结 果 是 来 源 于 试 验 因 子 ， 而 不是 由 于 试 验 材 料 的 不 一 致 导 致 的 。 试 验 中 各 处 理 一 般 都 要 设 有 一 定 的 重 复 ， 以 取 得 可 靠 的 试 验结 果 。 随 试 验 规 模 和 要 求 不 同 ， 大 多 每 个 项 目 要 有 4 10瓶 ， 每 瓶 至 少 3块 培 养 物 或 3丛 小 幼 苗 。 2种 激 素 5种 浓 度 的 实 验 组 合6-BAmg/L） 0 0.5 2.5 5 10NAA 0 1 2 3 4 5(mg/L) 0.5 6 7 8 9 10 2.5 11 12 13 14 15 5 16 17 18 19 20 10 21 22 23 24 25 对 培 养 基 中 两 个 或 两 个 以 上 因 素 进 行 研 究 的 试 验 称 为 多 因 子 实验 ， 试 验 可 采 用 完 全 试 验 方 案 ， 也 可 选 用 正 交 设 计 方 案 ， 完 全 试验 方 案 具 有 均 衡 完 全 的 特 点 ， 各 个 因 子 的 每 个 水 平 都 相 互 搭 配 ，构 成 了 所 有 可 能 的 处 理 组 合 ， 如 研 究 NAA和 6 BA的 最 佳 浓 度 组 合 ，每 个 因 子 各 设 5个 浓 度 水 平 (0， 0.5， 2.5， 5， 10mg L)， 这 两 种因 子 各 种 浓 度 的 所 有 组 合 ， 就 构 成 了 一 个 具 有 25项 处 理 的 试 验 见表 3 3。 二 、 多 因 子 试 验 三 、 逐 步 添 加 和 逐 步 排 除 的 试 验 方 法 在 植 物 组 织 分 化 与 再 生 的 研 究 中 ， 在 没 有 取 得 可 靠 的 分化 与 再 生 之 前 ， 往 往 添 加 各 种 有 机 营 养 成 分 ， 而 在 取 得了 稳 定 的 再 生 之 后 ， 就 可 以 逐 步 减 少 这 些 成 分 。 在 逐 步 添 加 时 是 使 试 验 成 功 ， 在 逐 步 减 少 时 是 缩 小 范 围 ，以 便 找 到 最 有 影 响 力 的 因 子 ， 或 是 为 了 实 用 上 的 需 要 竭力 使 培 养 基 简 化 ， 以 降 低 成 本 和 利 于 推 广 。 在 寻 求 最 佳 激 素 配 比 时 ， 也 经 常 用 到 这 种 加 加 减 减 的 简单 方 法 。 四 、 广 谱 实 验 法 在 广 谱 实 验 法 中 ， 把 培 养 基 中 所 有 组 分 分 为 4大 类 ： 无 机盐 、 有 机 营 养 物 质 (蔗 糖 、 氨 基 酸 和 肌 醇 等 )、 生 长 素 、 细胞 分 裂 素 。 对 每 一 类 物 质 选 定 低 (L)、 中 (M)、 和 高 (H)3个 浓 度 。 4类物 质 各 3种 浓 度 的 自 由 组 合 即 构 成 了 一 项 包 括 81个 处 理 的实 验 。 在 这 81个 处 理 中 最 好 的 一 个 可 用 4个 字 母 表 示 。 例 如 ， 一个 包 含 中 等 浓 度 无 机 盐 ， 低 等 浓 度 生 长 素 、 中 等 浓 度 细 胞分 裂 素 和 高 等 浓 度 有 机 营 养 物 质 的 处 理 即 可 表 示 为 MLMH。 达 到 这 个 阶 段 ， 再 试 用 不 同 类 型 的 生 长 素 和 细 胞 分 裂 素 即可 找 到 培 养 基 的 最 佳 配 方 。 这 是 因 为 不 同 类 型 的 生 K素 和细 胞 分 裂 素 对 不 同 植 物 的 活 性 有 所 不 同 。 环 境 条 件 在 植 物 组 织 培 养 中 温 度 、 光 照 、 湿 度 等 各 种 环 境条 件 ； 培 养 基 组 成 、 pH 值 、 渗 透 压 等 各 种 化 学 环 境 条件 都 会 影 响 组 织 培 养 育 苗 的 生 长 和 发 育 。 1 温 度 (temperature) 温 度 不 仅 影 响 植 物 组 织 培 养 育 苗 的 生 长 速 度 ， 也 影响 其 分 化 增 殖 以 及 器 官 建 成 等 发 育 进 程 。 不 同 植 物 培 养 的 适 温 不 同 . 不 同 培 养 目 标 采 用 的 培 养 温 度 也 不 同 . 大 多 数 植 物 组 织 培 养 都 是 在 23 27 之 间 进 行 ， 一般 采 用 25 2 。 2 光 照 (light) 一 般 来 说 ， 光 照 强 度 较 强 ， 幼 苗 生 长 的 粗 壮 ， 而 光 照 强度 较 弱 幼 苗 容 易 徒 长 。 离 体 培 养 中 一 般 光 量 在 2000-3000lx。组 培 中 光 照 是 重 要 的 条 件 之 一 ， 主 要 表 现 在 光 强 、 光 质 、 以 及光 照 时 间 方 面 ： 1） 光 照 强 度 (light intensity) 2） 光 质 (light wave) 光 质 对 愈 伤 组 织 诱 导 ， 培 养 组 织 的 增 殖 以 及 器 官 的分 化 都 有 明 显 的 影 响 。 对 苗 再 生 最 有 利 的 光 谱 是 蓝 光 区 ， 根 的 发 生 则 是 红光 区 。 3） 光 周 期 (light period) 试 管 苗 培 养 时 要 选 用 一 定 的 光 暗 周 期 来 进 行组 织 培 养 ， 一 般 每 天 光 照 12-16小 时 。 3 湿 度 (humidity) 容 器 内 主 要 受 培 养 基 水 分 含 量 和 封 口 材 料 的 影 响 。 前 者 又 受 琼 脂含 量 的 影 响 。 在 冬 季 应 适 当 减 少 琼 脂 用 量 ， 否 则 ， 将 使 培 养 基 干硬 ， 以 致 不 利 于 外 植 体 接 触 或 插 进 培 养 基 ， 导 致 生 长 发 育 受 阻 。封 口 材 料 直 接 影 响 容 器 内 湿 度 情 况 ， 但 封 闭 性 较 高 的 封 口 材 料 易引 起 透 气 性 受 阻 ， 也 会 导 致 植 物 生 长 发 育 受 影 响 。 环 境 的 相 对 湿 度 可 以 影 响 培 养 基 的 水 分 蒸 发 ， 一 般 要 求 70% 80%的 相 对 湿 度 ， 常 用 加 湿 器 或 经 常 洒 水 的 方 法 来 调 节 湿 度 。 湿 度 过低 会 使 培 养 基 丧 失 大 量 水 分 ， 导 致 培 养 基 各 种 成 分 浓 度 的 改 变 和渗 透 压 的 升 高 ， 进 而 影 响 组 织 培 养 的 正 常 进 行 。 湿 度 过 高 时 ， 易 引 起 棉 塞 长 霉 ， 造 成 污 染 。 湿 度 的 影 响 包 括 培 养 容 器 保 持 和 环 境 的 湿 度 条 件 4 渗 透 压 (penetrating pressure) 培 养 基 中 由 于 有 添 加 的 盐 类 、 蔗 糖 等 化 合 物 ， 因 此 ， 影响 到 渗 透 压 的 变 化 。 培 养 基 各 种 物 质 中 ， 糖 对 培 养 基 渗 透 压 起 决 定 性 作 用 。因 此 调 节 渗 透 压 往 往 从 调 节 糖 浓 度 着 手 。 5 pH值 (pH value) 不 同 的 植 物 对 培 养 基 最 适 pH值 的 要 求 也 是 不 同 的 (表 2 1)， 大 多在 5-6.5左 右 ， 一 般 培 养 基 皆 要 求 5.8. pH值 适 度 因 材 料 而 异 ， 也 因 培 养 基 的 组 成 而 不 同 。 以 硝 态 氮 作 氮源 和 以 铵 态 氮 作 氮 源 就 不 一 样 ， 后 者 较 高 一 些 。 一 般 来 说 当 pH值高 于 6 5时 ， 培 养 基 全 变 硬 ； 低 于 5时 ， 琼 脂 不 能 很 好 地 凝 固 。 高 温 灭 菌 会 降 低 pH值 (约 0.2 0.3个 pH值 )， 因 此 在 配 制 时 常 提 高pH值 0 2 0 3单 位 。 pH值 大 小 调 整 可 用 0 1M的 NaOH和 0 IM的 HCI来 调 整 。 lml的 NaOH可 使 pH值 升 高 0 2单 位 ， lml的 HCl可 使 pH值 降 低 0 2单 位 。 调 节 时 一 定 要 充 分 搅 拌 均 匀 。 种 类 最 适 pH 值 种 类 最 适 pH 值杜 鹃 4.0 月 季 5.8越 桔 4.5 胡 萝 卜 、 石 刁柏 6.0蚕 豆 5.5 桃 7.0番 茄 5.7 不 同 植 物 的 最 适 pH值 6 氧 气 (oxygen) 氧 气 是 组 织 培 养 中 必 需 的 因 素 ， 瓶 盖 封 闭 时 要 考 虑通 气 问 题 ， 可 用 附 有 滤 气 膜 的 封 口 材 料 。 通 气 最 好的 是 棉 塞 封 闭 瓶 口 ， 但 棉 塞 易 使 培 养 基 干 燥 ， 夏 季易 引 起 污 染 。 固 体 培 养 基 可 加 进 活 性 炭 来 增 加 通 气 度 ， 以 利 于 发根 。 培 养 室 要 经 常 换 气 ， 改 善 室 内 的 通 气 状 况 。 液 体 振 荡 培 养 时 ， 要 考 虑 振 荡 的 次 数 、 振 幅 等 ， 同时 要 考 虑 容 器 的 类 型 、 培 养 基 等 练 习 ： 培 养 基 一 般 包 括 哪 些 基 本 成 分 ？ 起 作 用 是 什么 ？ 培 养 基 的 配 制 步 骤 及 注 意 事 项 ？ 用 于 植 物 组 织 培 养 的 植 物 生 长 调 节 物 质 主 要有 哪 两 种 ？ 他 们 在 组 培 中 各 起 什 么 作 用 ？ 接 种 后 的 离 体 培 养 物 对 光 、 温 度 、 湿 度 等 有何 具 体 要 求 ？ 如 何 调 控 ？ 第 五 章 组 培 苗 的 培 养 、 试 管 苗 的驯 化 与 移 栽 指 把 培 养 材 料 放 在 培 养 室 (有 光 照 、 温 度 条 件 )里 ，使 之 生 长 ， 分 裂 和 分 化 形 成 愈 伤 组 织 或 进 一 步 分 化成 再 生 植 株 的 过 程 。 培 养 一 、 培 养 方 法 (1)固 体 培 养 法 即 用 琼 脂 固 化 培 养 基 来 培 养 植 物 材 料 的 方 法 。 是 现 在 最常 用 的 方 法 。 虽 然 该 方 法 设 备 简 单 ， 易 行 ， 但 养 分 分 布 不 均 ，生 长 速 度 不 均 衡 ， 并 常 有 褐 化 中 毒 现 象 发 生 。 (2)液 体 培 养 法 即 用 不 加 固 化 剂 的 液 体 培 养 基 培 养 植 物 材 料 的 方 法 。 由于 液 体 中 氧 气 含 量 较 少 ， 所 以 通 常 需 要 通 过 搅 动 或 振 动 培 养 液的 方 法 以 确 保 氧 气 的 供 给 ， 采 用 往 复 式 摇 床 或 旋 转 式 摇 床 进 行培 养 ， 其 速 度 一 般 为 50-100r min， 这 种 定 期 浸 没 的 方 法 ， 既能 使 培 养 基 均 一 ， 又 能 保 证 氧 气 的 供 给 。 简 单 ， 一 般 只 要 有 培 养 室 及 接 种 箱 即 可 。优 点 ： 固 体 培 养定 义 ：指 在 培 养 液 中 加 入 一 定 的 凝 固 剂 ， 使 培 养 液 固 化 ，然 后 将 外 植 体 直 接 介 入 此 培 养 液 中 的 培 养适 用 范 围 ：一 般 用 于 组 织 块 、 愈 伤 组 织 、 短 枝 或 茎 尖 等 材 料的 培 养 外 植 体 只 有 底 部 表 面 能 接 触 培 养 基 ， 造 成 细 胞 各部 分 营 养 浓 度 差 异 。 外 植 体 插 入 培 养 基 后 ， 气 体 交 换 不 畅 及 排 泄 物 质积 累 ， 影 响 组 织 吸 收 养 分 和