过氧化氢酶活性的测定

过 氧 化 氢 酶 活 性 的 测 定 碘 量 法实 验 三 学 时 ： 3 生 物 体 内 重 要 的 三 种 氧 化 酶 类 ， 其 作 用 均 是清 除 体 内 自 由 基 ：POD： 过 氧 化 物 酶SOD： 超 氧 化 物 歧 化 酶CAT： 过 氧 化 氢 酶 1、 掌 握 碘 量 法 测 定 过 氧 化 氢 酶 活 性 的 原理 和 方 法 ； 2、 了 解 过 氧 化 氢 酶 的 作 用 。 一 、 实 验 目 的 ： 植 物 在 逆 境 下 或 衰 老 时 ， 由 于 体 内 活 性 氧 代 谢 加 强 而 使 H2O2发 生 累 积 。 H2O2可 进 一 步 生 成 氢 氧 自 由 基 （ OH） 。 氢 氧 自 由 基 （ OH） 是 化 学 性 质 最 活 泼 的 活 性 氧 ， 可 以 直 接 或间 接 地 氧 化 细 胞 内 核 酸 ， 蛋 白 质 等 生 物 大 分 子 ， 并 且 有 非 常高 的 速 度 常 数 ， 破 坏 性 极 强 ， 可 使 细 胞 膜 遭 受 损 害 ， 加 速 细胞 的 衰 老 和 解 体 。 过 氧 化 氢 酶 (catalase； CAT)可 以 清 除 H2O2、 分 解 氢 氧 自 由 基 ，保 护 机 体 细 胞 稳 定 的 内 环 境 及 细 胞 的 正 常 生 活 ， 因 此 CAT是植 物 体 内 重 要 的 酶 促 防 御 系 统 之 一 ， 其 活 性 高 低 与 植 物 的 抗逆 性 密 切 相 关 。二 、 实 验 原 理 : CAT活 性 大 小 以 一 定 时 间 内 分 解 的 H2O2量 来 表 示 ： 在 一 定 条 件 下 ， CAT能 把 H2O2分 解 为 H2O和 O2。 当 CAT与H2O2反 应 一 定 时 间 (t)后 ， 再 用 碘 量 法 测 定 未 分 解 的 H2O2， 以钼 酸 铵 作 催 化 剂 ， H2O2与 KI反 应 ， 放 出 游 离 碘 ， 然 后 用 硫 代硫 酸 钠 滴 定 碘 ， 反 应 式 为 ： H2O2（ 余 ） +2KI+H2SO4- I2+K2SO4+2H2O I2 +2Na2S2O3 - 2NaI+Na2S4O6（ 连 二 硫 酸 钠 ） 用 硫 代 硫 酸 钠 分 别 滴 定 空 白 液 (可 求 出 总 的 H 2O2量 )和 反 应液 (可 求 出 未 分 解 的 H2O2量 )， 再 根 据 二 者 滴 定 值 之 差 求 出 分解 的 H2O2量 。 二 、 实 验 原 理 : 1、 实 验 材 料 ： 三 叶 草2、 仪 器 ： (1) 滴 定 管 (2)研 钵 (3) 容 量 瓶 (4)移 液 管 (5)三 角 瓶 (100ml) 3、 试 剂 ： （ 1） 0.05M H2O2 （ 2） 0.2M Na2S2O3 （ 3） 1.8M H2SO4 （ 4） 1.5%淀 粉 溶 液 （ 5） 10%（ NH4)6Mo7O24 （ 6） 20% KI （ 7） CaCO3， 石 英 砂 三 、 实 验 材 料 、 仪 器 和 试 剂 ： 1、 酶 液 提 取 ： 称 取 0.5g三 叶 草 ， 加 少 量 石 英 砂 ， CaCO3， 2ml水 ， 研 成 匀 浆 ，移 入 50ml容 量 瓶 ， 冲 洗 研 钵 数 次 ， 定 容 ， 静 置 ， 过 滤 。 2、 酶 促 反 应 ： （ 1） 取 锥 形 瓶 2个 ， 编 号 A， B， 各 加 入 10ml酶 液 ， 之 后 立 即 向 A瓶中 加 入 1.8mol/L H2SO45ml， 终 止 酶 活 性 ， 作 空 白 滴 定 。（ 2） 向 A， B两 瓶 各 加 H2O2 5ml， 摇 匀 ， 在 加 入 B瓶 那 一 刻 起 ， 记 录 时 间 ， 5分 钟 后 迅 速 向 B瓶 中 加 入 1.8mol/LH2SO45ml， 终 止 酶 活 性 。3、 滴 定 ： 向 A， B两 瓶 各 加 1ml 20% KI和 3滴 （ NH 4） 6Mo7O24， 摇 匀 后 迅速 加 入 5滴 1.5%淀 粉 溶 液 ， 用 Na2S2O3进 行 滴 定 至 蓝 色 恰 好 消 失 ，记 录 两 次 消 耗 Na2S2O3的 体 积 VA(空 白 )， VB(反 应 液 )。 四 、 实 验 步 骤 ： 酶 活 性 测 定管号 酶液(ml) 1.8M H2SO4(ml) 0.05MH2O2 保温 1.8MH2SO4(ml) 20% KI溶液 (ml) 钼 酸铵 溶液 (滴 ) 淀 粉溶 液(滴 ) 0.2MNa2S2O3溶 液 的滴 定 量A空白 10 5 5 5分钟 - 1 3 5 VA(空 白 )=B反应 10 - 5 5 1 3 5 VB(反 应液 ) = 1、 被 分 解 的 H2O2量 （ mg） =（ 空 白 滴 定 值 -样 品 滴 定 值 ） Na2S2O3摩 尔 浓 度 172、 CAT活 性 （ mg.g-1.min-1） = 被 分 解 的 H2O2量 （ mg） (总 体 积 测 定 取 液 量 ) 样 品 重 （ g） 时 间 （ min）五 、 实 验 结 果 与 计 算 ： 六 、 思 考 题 ：1、 本 实 验 中 影 响 CAT活 性 测 定 的 因 素 有 哪 些 ？