固定化酶和固定化细胞

CompanyLOGO Company Logo 固 定 化 酶 的 定 义v所 谓 固 定 化 酶 (immobilized enzyme)， 是 指 在 一 定 的空 间 范 围 内 起 催 化 作 用 ， 并 能 反 复 和 连 续 使 用 的酶 。 Company Logo v1916年 ， Nelson和 Griffin发 现 酶 的 固 定 化 现 象 ；v1969年 ， 千 畑 一 郎 等 将 固 定 化 氨 基 酰 化 酶 应 用 于生 产 L-氨 基 酸 ， 开 创 了 固 定 化 酶 应 用 于 工 业 生 产的 先 例 ；v1971年 召 开 的 第 一 届 国 际 酶 工 程 会 议 上 ， 建 议 采用 统 一 的 英 文 名 称 I mmobilized Enzyme；v1973年 ， 固 定 化 大 肠 杆 菌 菌 体 中 的 天 冬 氨 酸 酶 连续 生 产 L-天 冬 氨 酸 。v1986年 ， 利 用 固 定 化 原 生 质 体 发 酵 生 产 碱 性 磷 酸酶 和 葡 萄 糖 氧 化 酶 等 相 继 获 得 成 功 。酶 固 定 化 技 术 发 展 史 Company Logo v从 目 前 的 发 展 状 况 来 看 ， 尽 管 酶 种 类 繁 多 ， 但 已经 固 定 化 的 酶 却 相 对 有 限 ， 采 用 固 定 化 酶 技 术 大规 模 生 产 的 企 业 尚 属 少 数 ， 真 正 在 工 业 上 使 用 的固 定 化 酶 还 仅 限 于 葡 萄 糖 异 构 酶 、 葡 萄 糖 氧 化 酶和 青 霉 素 酰 化 酶 等 为 数 不 多 的 十 几 个 酶 种 ， 故 仍需 大 力 研 究 开 发 使 更 多 的 固 定 化 酶 和 细 胞 能 适 用于 工 业 规 模 生 产 。 发 展 现 状 Company Logo 固 定 化 酶 的 优 点同 一 批 固 定 化 酶 能 在 工 艺 流 程 中 重 复 多 次 地 使 用 ；固 定 化 后 ， 和 反 应 物 分 开 ， 有 利 于 控 制 生 产 过 程 ，同 时 也 省 去 了 热 处 理 使 酶 失 活 的 步 骤 ；稳 定 性 显 著 提 高 ；可 长 期 使 用 ， 并 可 预 测 衰 变 的 速 度 ；提 供 了 研 究 酶 动 力 学 的 良 好 模 型 。 Company Logo 固 定 化 酶 的 制 备 原 则v（ 1） 必 须 注 意 维 持 酶 的 构 象 ， 特 别 是 活 性 中 心 的 构 象 。v（ 2） 酶 与 载 体 必 须 有 一 定 的 结 合 程 度 。 酶 的 固 定 化 既 不 影响 酶 的 原 有 构 象 ， 又 能 使 固 定 化 酶 能 有 效 回 收 贮 藏 ， 利 于 反复 使 用 。v（ 3） 固 定 化 应 有 利 于 自 动 化 、 机 械 化 操 作 。 这 要 求 用 于 固定 化 的 载 体 必 须 有 一 定 的 机 械 强 度 ， 才 能 使 之 在 制 备 过 程 中不 易 破 坏 或 受 损 。 Company Logo v（ 4） 固 定 化 酶 应 有 最 小 的 空 间 位 阻 。v（ 5） 固 定 化 酶 应 有 最 大 的 稳 定 性 。 在 应 用 过 程 中 ，所 选 载 体 应 不 和 底 物 、 产 物 或 反 应 液 发 生 化 学 反应 。v（ 6） 固 定 化 酶 的 成 本 适 中 。 Company Logo 固 定 化 酶 （ 细 胞 ） 的 制 备 方 法 酶 和 细 胞 固 定 化 方 法 载 体 结 合 法 交 联 法 包 埋 法 网 格 型 微 囊 型物 理 吸 附 法 离 子 结 合 法 共 价 结 合 法 热 处 理 （ 细 胞 ） Company Logo Company Logo 1、 吸 附 法v通 过 载 体 表 面 和 酶 分 子 表 面 间 的 次 级 键 相 互 作 用而 达 到 固 定 目 的 的 方 法 ， 是 固 定 化 中 最 简 单 的 方法 。v吸 附 法 又 可 分 为 物 理 吸 附 法 和 离 子 吸 附 法 。 Company Logo v物 理 吸 附 法 (physical adsorption)是 通 过 非 特 异 性 物 理吸 附 作 用 将 酶 直 接 吸 附 在 水 不 溶 性 载 体 表 面 上 而使 酶 固 定 化 的 方 法 。 包 括 范 德 华 力 、 疏 水 相 互 作用 、 氢 键 。v物 理 吸 附 法 常 用 的 载 体 ：有 机 载 体 ： 纤 维 素 、 胶 原 、 淀 粉 及 面 筋 等 ；无 机 载 体 ： 活 性 炭 、 氧 化 铝 、 皂 土 、 多 孔 玻 璃 、硅 胶 、 二 氧 化 钛 、 羟 基 磷 灰 石 等 。物 理 吸 附 法 Company Logo v离 子 吸 附 法 (ion adsorption)是 通 过 离 子 键 使 酶 与 含有 离 子 交 换 基 团 的 水 不 溶 性 载 体 相 结 合 的 固 定 化方 法 。v此 法 固 定 的 酶 有 葡 萄 糖 异 构 酶 、 糖 化 酶 、 -淀 粉酶 、 纤 维 素 酶 等 ， 在 工 业 上 用 途 较 广 。离 子 吸 附 法 Company Logo v离 子 吸 附 法 常 用 的 载 体 ：v阴 离 子 交 换 剂 ： DEAE-纤 维 素 、 四 乙 氨 基 乙 基(TEAE)-纤 维 素 等 ；v阳 离 子 交 换 剂 有 羧 甲 基 (CM)-纤 维 素 、 纤 维 素 柠 檬酸 盐 、 Dowex-50等 。v其 吸 附 容 量 一 般 大 于 物 理 吸 附 剂 。 离 子 吸 附 法 具有 操 作 简 便 、 条 件 温 和 、 酶 活 力 不 易 丧 失 等 优 点 。此 外 ， 吸 附 过 程 同 时 可 以 纯 化 酶 。 Company Logo 2、 包 埋 法v包 埋 法 （ entrapment） 是 将 酶 包 埋 在 高 聚 物 的 细 微凝 胶 网 格 中 或 高 分 子 半 透 膜 内 的 固 定 化 方 法 。 前者 又 称 为 凝 胶 包 埋 法 ， 酶 被 包 埋 成 网 格 型 ； 后 者又 称 为 微 胶 囊 包 埋 法 ， 酶 被 包 埋 成 微 胶 囊 型 。 Company Logo v（ 1） 凝 胶 包 埋 法 将 聚 合 物 的 单 体 与 酶 溶 液 混 合 ， 再 借 助 于 聚 合促 进 剂 (包 括 交 联 剂 )的 作 用 进 行 聚 合 ， 酶 被 包埋 在 聚 合 物 中 以 达 到 固 定 化 。 凝 胶 包 埋 法 常 用 的 载 体 有 海 藻 酸 钠 凝 胶 、 角 叉菜 胶 、 明 胶 、 琼 脂 凝 胶 、 卡 拉 胶 等 天 然 凝 胶 以及 聚 丙 烯 酰 胺 、 聚 乙 烯 醇 和 光 交 联 树 脂 等 合 成凝 胶 或 树 脂 。 Company Logo v（ 2） 微 胶 囊 包 埋 法 微 胶 囊 包 埋 即 将 酶 包 埋 在 各 种 高 聚 物 制 成 的 半透 膜 微 胶 囊 内 的 方 法 。 它 使 酶 存 在 于 类 似 细 胞内 的 环 境 中 ， 可 以 防 止 酶 的 脱 落 ， 防 止 微 囊 外的 环 境 直 接 接 触 ， 从 而 增 加 了 酶 的 稳 定 性 。 常用 于 制 造 微 胶 囊 的 材 料 有 聚 酰 胺 、 火 棉 胶 、 醋酸 纤 维 素 等 。 Company Logo 3、 共 价 键 结 合 法v共 价 键 结 合 法 (covalent binding） 是 将 酶 与 聚 合 物 载体 以 共 价 键 结 合 的 固 定 化 方 法 。 Company Logo v（ 1） 酶 蛋 白 N末 端 的 -氨 基 或 赖 氨 酸 残 基 的 -氨 基 。v（ 2） 酶 蛋 白 C末 端 的 -羧 基 、 天 门 冬 氨 酸 残 基 的 -羧 基 以 及 谷 氨 酸 残 基 的 -羧 基 。v（ 3） 苯 丙 氨 酸 和 酪 氨 酸 残 基 的 苯 环 。v（ 4） 其 他 ： 半 胱 氨 酸 残 基 的 巯 基 ； 丝 氨 酸 、 苏 氨 酸 和 酪氨 酸 残 基 的 羟 基 ； 组 氨 酸 残 基 的 咪 唑 基 ； 色 氨 酸 残 基 的 吲哚 基 。 酶 蛋 白 上 可 供 载 体 结 合 的 功 能 基 团v酶 共 价 偶 联 的 载 体 的 功 能 基 团 ： 芳 香 氨 基 、 羟 基 、 羧基 和 羧 甲 基 等 。 Company Logo 载 体 活 化 的 主 要 反 应v重 氮 法v叠 氮 法v溴 化 氰 法v芳 香 烃 化 法 Company Logo v（ 1） 重 氮 法 重 氮 法 是 将 酶 蛋 白 与 水 不 溶 性 载 体的 重 氮 基 团 通 过 共 价 键 相 连 接 而 固 定 化 的 方 法 ，是 共 价 键 法 中 使 用 最 多 的 一 种 。v常 用 的 载 体 有 多 糖 类 的 芳 族 氨 基 衍 生 物 、 氨 基 酸的 共 聚 体 和 聚 丙 烯 酰 胺 衍 生 物 等 。 Company Logo v（ 2） 叠 氮 法 即 载 体 活 化 生 成 叠 氮 化 合 物 ， 再 与酶 分 子 上 的 相 应 基 团 偶 联 成 固 定 化 酶 。v含 有 羟 基 、 羧 基 、 羧 甲 基 等 基 团 的 载 体 都 可 用 此法 活 化 。 如 CMC、 CM-sephadex（ 交 联 葡 聚 糖 ） 、聚 天 冬 氨 酸 、 乙 烯 -顺 丁 烯 二 酸 酐 共 聚 物 等 都 可 用此 法 来 固 定 化 酶 。 其 中 使 用 最 多 的 是 羧 甲 基 纤 维素 叠 氮 法 。 Company Logo v（ 3） 溴 化 氰 法 即 用 溴 化 氰 将 含 有 羟 基 的 载 体 ， 如纤 维 素 、 葡 聚 糖 凝 胶 、 琼 脂 糖 凝 胶 等 ， 活 化 生 成 亚氨 基 碳 酸 酯 衍 生 物 ， 然 后 再 与 酶 分 子 上 的 氨 基 偶 联 ，制 成 固 定 化 酶 。v任 何 具 有 连 位 羟 基 的 高 聚 物 都 可 用 溴 化 氰 法 来 活 化 。 Company Logo v（ 4） 烷 基 化 和 芳 基 化 法 以 卤 素 为 功 能 团 的 载 体可 与 酶 蛋 白 分 子 上 的 氨 基 、 巯 基 、 酚 基 等 发 生 烷基 化 或 芳 基 化 反 应 而 使 酶 固 定 化 。v此 法 常 用 的 载 体 有 卤 乙 酰 、 三 嗪 基 或 卤 异 丁 烯 基的 衍 生 物 。 Company Logo v优 点 ： 共 价 键 的 键 能 高 ， 酶 和 载 体 之 间 的 结 合 相 当 牢 固 ，即 使 用 高 浓 度 底 物 溶 液 或 盐 溶 液 ， 也 不 会 使 酶 分 子 从 载 体上 脱 落 下 来 ， 具 有 酶 稳 定 性 好 、 可 连 续 使 用 较 长 时 间 的 优点 。 v缺 点 ： 载 体 活 化 的 难 度 较 大 ， 操 作 复 杂 ， 反 应 条 件 较 剧 烈 ，制 备 过 程 中 酶 直 接 参 与 化 学 反 应 ， 易 引 起 酶 蛋 白 空 间 构 象变 化 。 Company Logo 4、 交 联 法v交 联 法 （ cross-linking） 是 使 用 双 功 能 或 多 功 能 试 剂使 酶 分 子 之 间 相 互 交 联 呈 网 状 结 构 的 固 定 化 方 法 。v常 用 的 双 功 能 试 剂 有 戊 二 醛 、 己 二 胺 、 异 氰 酸 衍生 物 等 。v戊 二 醛 和 酶 蛋 白 中 的 游 离 氨 基 发 生 Schiff反 应 ， 形成 薛 夫 碱 ， 从 而 使 酶 分 子 之 间 相 互 交 联 形 成 固 定化 酶 。 Company Logo Company Logo 5、 选 择 性 热 变 性 法v专 用 于 细 胞 固 定 化 。 是 将 细 胞 在 适 当 的 温 度 下 处理 使 细 胞 膜 蛋 白 变 性 ， 但 不 使 酶 变 性 而 使 酶 固 定于 细 胞 内 的 方 法 。 Company Logo 6、 固 定 化 活 细 胞v将 活 细 胞 限 制 或 定 位 于 特 定 空 间 位 置 的 方法 。 Company Logo v无 需 进 行 酶 的 分 离 和 纯 化 ， 减 少 酶 的 活 力 损 失 ，同 时 大 大 降 低 了 成 本 ；v保 持 了 酶 的 原 始 状 态 ， 比 固 定 化 酶 的 稳 定 性 更 高 ，对 污 染 的 抵 抗 力 更 强 ；v细 胞 本 身 含 多 酶 系 统 ， 可 催 化 一 系 列 反 应 ， 且 不需 添 加 辅 助 因 子 ；v细 胞 生 长 停 滞 时 间 短 ， 细 胞 多 ， 反 应 快 等 。固 定 化 活 细 胞 的 优 越 性 Company Logo v缺 点必 须 保 持 菌 体 的 完 整 ， 需 防 止 菌 体 的 自 溶 ， 否 则影 响 产 物 的 纯 度 ；必 须 抑 制 细 胞 内 蛋 白 酶 对 目 的 酶 的 分 解 ；胞 内 多 酶 的 存 在 ， 会 形 成 副 产 物 ；载 体 、 细 胞 膜 或 细 胞 壁 会 造 成 底 物 渗 透 与 扩 散 的障 碍 等 。 Company Logo 制 备 方 法v固 定 化 活 细 胞 的 制 备 条 件 比 固 定 化 酶 更 要 温 和 ，其 制 备 方 法 主 要 有 物 理 吸 附 法 和 包 埋 法 两 种 。 CompanyLOGO 固 定 化 酶 的 特 性 Company Logo 固 定 化 酶 的 形 状v固 定 化 酶 的 形 式 多 样 ， 依 不 同 用 途 有 颗 粒 状 、 纤维 状 、 酶 膜 和 酶 管 等 形 状 。v其 中 颗 粒 占 绝 大 多 数 ， 它 和 纤 维 状 主 要 用 于 工 业发 酵 生 产 ， 如 装 成 酶 柱 用 于 连 续 生 产 ， 或 在 反 应器 中 进 行 批 式 搅 拌 反 应 。 Company Logo 固 定 化 酶 的 性 质v酶 活 力v酶 稳 定 性v酶 学 特 性 Company Logo 固 定 化 酶 的 酶 活 力v固 定 化 酶 的 活 力 在 多 数 情 况 下 比 天 然 酶 的 活 力 低 ，其 原 因 可 能 是 ： 酶 活 性 中 心 的 重 要 氨 基 酸 残 基 被 载 体 结 合 ； 高 级 结 构 和 空 间 构 象 的 改 变 ； 空 间 位 阻 的 影 响 ； 内 扩 散 阻 力 ； 半 透 膜 的 隔 离 。v个 别 情 况 下 ， 酶 经 固 定 化 后 其 活 力 升 高 。 Company Logo 固 定 化 酶 的 稳 定 性 v操 作 稳 定 性 ： 体 内 半 衰 期v贮 藏 稳 定 性 ： 低 温 放 置v热 稳 定 性 ： 耐 热 性 提 高v对 蛋 白 酶 的 稳 定 性 ： 空 间 位 阻v其 他 ： 对 有 机 溶 剂 、 pH、 酶 抑 制 剂 等 的 稳 定 性 均有 提 高 。 Company Logo 固 定 化 酶 的 酶 学 特 性v底 物 特 异 性 ： 对 高 分 子 底 物 的 活 性 明 显 下 降 ；v最 适 pH： 最 适 pH和 pH曲 线 常 会 发 生 偏 移 ；v最 适 温 度 ： 多 数 较 游 离 酶 高 ；v动 力 学 常 数 ： Km均 增 大 ， 增 大 幅 度 视 情 况 而 定 ；v最 大 反 应 速 度 ： 与 游 离 酶 大 多 数 是 相 同 或 相 近 。 CompanyLOGO 酶 反 应 器 及 其 类 型 Company Logo 酶 反 应 器 的 定 义v以 酶 为 催 化 剂 进 行 反 应 所 需 要 的 设 备 称 之 为 酶 催化 反 应 器 ， 简 称 酶 反 应 器 。 Company Logo 酶 反 应 器 的 类 型v间 歇 式 搅 拌 罐 反 应 器 ， BSTRv连 续 流 动 搅 拌 罐 反 应 器 ， CSTRv填 充 床 反 应 器 ， PBRv流 化 床 反 应 器 ， FBRv连 续 搅 拌 罐 -超 滤 膜 反 应 器 ， CSTR/UFRv循 环 式 反 应 器 ， RCR CompanyLOGO 反 应 器 的 结 构 特 点 Company Logo v这 类 反 应 器 结 构 简 单 ， 造 价 较 低 ， 传 质 阻力 很 小 ， 反 应 能 迅 速 达 到 稳 态 ， 主 要 应 用在 饮 料 和 食 品 工 业 中 。 其 缺 点 是 操 作 麻 烦 ，在 反 复 回 收 过 程 中 固 定 化 酶 容 易 损 失 ， 所以 工 业 规 模 的 固 定 化 酶 很 少 采 用 。 常 用 于游 离 酶 。 BSTR 间 歇 式 搅 拌 罐 反 应 器 ， BSTR Company Logo v这 种 反 应 器 在 运 转 过 程 中 ， 底物 以 恒 定 的 流 速 流 入 反 应 器 ，与 此 同 时 ， 反 应 液 则 以 同 样 的流 速 流 出 反 应 器 。 反 应 桶 内 装有 搅 拌 器 ， 使 反 应 组 分 与 固 定化 酶 颗 粒 混 合 均 一 ， 出 口 处 有过 滤 膜 ， 可 使 不 断 补 充 新 鲜 底物 与 反 应 液 流 量 维 持 动 态 平 衡 。连 续 流 动 搅 拌 罐 反 应 器 ， CSTR CSTR Company Logo 优 点 ： 反 应 液 混 合 良 好 ， 各 部 位 的 成 分 相 同 ， 并 与 流出 液 的 组 成 也 一 致 。 CSTR的 开 放 结 构 使 得 调 换 固 定 化酶 比 较 容 易 ， 而 且 有 利 于 控 制 温 度 和 调 节 pH， 还 能 够处 理 胶 态 或 不 溶 性 底 物 ， 受 底 物 抑 制 的 固 定 化 酶 采 用CSTR有 较 高 的 转 化 率 。 缺 点 ： 由 搅 拌 产 生 的 剪 切 力 较 大 ， 易 打 碎 磨 损 固 定 化酶 颗 粒 。 需 改 良 的 CSTR。 Company Logo 填 充 床 反 应 器 ， PBR PBRv又 称 固 定 床 反 应 器 。 可 填 充 多 向 异 性半 透 性 中 空 纤 维 制 成 管 状 ， 内 部 填 充酶 膜 、 酶 片 等 。v在 填 充 床 反 应 器 内 ， 底 物 在 一 定 方 向上 以 恒 定 的 速 度 通 过 固 定 化 酶 柱 ， 以近 似 活 塞 式 流 动 反 应 器 （ Plug Flow Reactor， PFR） 运 转 。 Company Logo 流 化 床 反 应 器 ， FBR FBR vFBR种 装 有 较 小 颗 粒 的 垂 直 塔 式反 应 器 。 反 应 时 ， 底 物 溶 液 以 足 够大 的 流 速 ， 从 反 应 器 底 部 向 上 通 过固 定 化 酶 柱 床 ， 便 能 使 固 定 化 酶 颗粒 始 终 处 于 流 化 状 态 。 其 混 合 程 度介 于 CSTR的 全 混 型 和 PFR的 平 推流 型 之 间 。 由 于 反 应 器 内 混 合 程 度高 ， 因 此 ， 传 热 、 传 质 情 况 良 好 ，可 处 理 粘 性 大 、 含 有 固 体 颗 粒 的 底物 。 Company Logo 连 续 搅 拌 罐 -超 滤 膜 反 应 器 ， CSTR/UFRCSTR/UFRv CSTR UF结 构 是 CSTR与超 滤 装 置 联 用 的 酶 膜 反 应 器 。在 CSTR出 口 处 设 置 一 个 超滤 装 置 ， 通 过 超 滤 装 置 ， 酶可 以 循 环 使 用 。 该 超 滤 器 中的 半 透 性 超 滤 膜 只 允 许 小 分子 产 物 通 过 ， 不 允 许 大 分 子酶 和 底 物 通 过 。v 该 反 应 器 适 用 于 颗 粒 较 细 的固 定 化 酶 、 游 离 酶 和 细 胞 以及 小 分 子 产 物 与 大 分 子 底 物 。 Company Logo 循 环 式 反 应 器 ， RCR外 循 环 反 应 器 内 循 环 反 应 器 循 环 操 作 仍 能 为 底 物 与 酶 提 供 足 够 的 接 触 机 会 ，以 达 到 所 需 的 转 化 率 。 这 种 反 应 器 可 用 于 难 溶 或者 不 溶 性 底 物 的 转 化 反 应 。 Company Logo 酶 反 应 器 的 选 择 依 据v根 据 固 定 化 酶 的 形 状 ： 溶 液 酶 ： BSTR 颗 粒 状 和 片 状 ： CSTR、 PBR 膜 状 和 纤 维 状 ： PBR 容 易 变 形 、 易 粘 结 、 颗 粒 细 小 ： FBRv根 据 底 物 的 物 理 性 质 溶 解 性 和 浊 液 性 底 物 ： 任 何 类 型 颗 粒 状 和 胶 状 底 物 ： CSTR、 FBR、 RCR Company Logo v根 据 酶 反 应 动 力 学 特 性 产 物 对 酶 活 性 抑 制 ： PBR 底 物 对 酶 活 性 抑 制 ： CSTRv根 据 外 界 环 境 对 酶 的 稳 定 性 的 影 响 改 良 的 CSTRv根 据 操 作 要 求 及 反 应 器 费 用 CSTR CompanyLOGO固 定 化 细 胞 法 生 产 6-氨 基 青 霉 烷 酸 Company Logo 基 本 原 理v青 霉 素 G经 青 霉 素 酰 化 酶 作 用 ， 水 解 除 去 侧 链 后的 产 物 称 为 6-氨 基 青 霉 烷 酸 ， 也 称 无 侧 链 青 霉 素 。6-APA结 构 式 Company Logo 工 艺 路 线 大 肠 杆 菌 的 培 养大 肠 杆 菌 固 定 化固 定 化 大 肠 杆 菌 反 应 堆 制 备转 化 反 应6-氨 基 青 霉 烷 酸 的 提 取 Company Logo 工 艺 要 点v大 肠 杆 菌 的 培 养菌 种 ： 大 肠 杆 菌 D816斜 面 培 养 基 ： 普 通 肉 汤 琼 脂 培 养 基发 酵 培 养 基 ： 蛋 白 胨 、 氯 化 钠 、 苯 乙 酸 、 自 来 水发 酵 条 件 ： 通 气 搅 拌 培 养 ， 28 ， pH7.0 Company Logo v大 肠 杆 菌 固 定 化 取 湿 菌 体 100 kg， 置 于 40 反 应 罐 中 ， 在 搅 拌 下 加 入50L10%戊 二 醛 5 升 ， 在 转 移 至 搪 瓷 盘 中 ， 使 之 成 为 3-5 cm厚 的 液 层 ， 室 温 放 置 2 小 时 ， 再 转 移 至 4 冷 库 过 夜 ，待 形 成 固 体 凝 胶 后 ， 通 过 粉 碎 和 过 筛 ， 使 其 成 为 直 径 为 2 mm左 右 的 颗 粒 状 固 定 化 大 肠 杆 菌 细 胞 ， 用 蒸 馏 水 以pH7.5和 0.3mol/L磷 酸 缓 冲 液 先 后 充 分 洗 涤 ， 抽 干 ， 备 用 。 Company Logo v固 定 化 大 肠 杆 菌 反 应 堆 制 备将 上 述 充 分 洗 涤 后 的 固 定 化 大 肠 杆 菌 细 胞 装 填 于带 保 温 夹 套 的 填 充 式 反 应 器 中 ， 即 成 为 固 定 化 大肠 杆 菌 反 应 堆 ， 反 应 器 规 格 为 直 径 70 160 cm。 Company Logo v转 化 反 应v取 20 kg青 霉 素 G钾 盐 ， 加 入 到 1000L配 料 罐 中 ， 用 0.03 mol/L、 pH7.5 的 磷 酸 缓 冲 液 溶 解 并 使 青 霉 素 G钾 盐 浓 度 为3%， 用 2 mol/L氢 氧 化 钠 溶 液 调 pH 至 7.5-7.8， 然 后 将 反 应器 及 pH 调 节 罐 中 反 应 液 温 度 到 0 ， 维 持 反 应 体 系 的 酸 度在 7.5-7.8 范 围 内 ， 以 70L/min流 速 使 青 霉 素 G钾 盐 溶 液 通 过固 定 化 大 肠 杆 菌 反 应 堆 进 行 循 环 转 化 ， 直 至 转 化 液 酸 度 不变 为 止 。 循 环 时 间 一 般 为 3-4h， 反 应 结 束 后 ， 放 出 转 化 液 ，再 进 入 下 一 批 反 应 。 Company Logo v6-氨 基 青 霉 烷 酸 的 提 取 上 述 转 化 液 经 过 滤 澄 清 后 ， 滤 液 用 薄 膜 浓 缩 器 减 压 浓 缩 至100 L左 右 ， 冷 却 至 室 温 后 ， 于 250L搅 拌 罐 中 加 50L醋 酸丁 酯 充 分 搅 拌 提 取 10-15min， 取 下 层 水 相 ， 加 1%活 性 炭于 70 搅 拌 脱 色 30min， 滤 除 活 性 炭 ， 滤 液 用 6mol/L HCl调 pH至 4 左 右 ， 5 放 置 结 晶 过 夜 ， 次 日 滤 取 结 晶 ， 用 少量 冷 水 洗 涤 ， 抽 干 ， 115 烘 2-3h得 成 品 6-氨 基 青 霉 烷 酸 ，收 率 为 70-80%。