《氨基酸生产工艺》PPT课件

第 十 章 初 级 代 谢 产 物 本章主要内容第一节、氨基酸生产工艺第二节、有机酸生产工艺第三节、有机溶剂生产工艺第四节、核苷类物质生产工艺第五节、维生素生产工艺第六节、再生能源 第一节 氨基酸生产工艺一、氨基酸简介二、发酵法生产氨基酸三、谷氨酸发酵机制及工艺 一、氨基酸简介 氨 基 酸 发 酵 氨基酸：合成法、抽提法 氨基酸工业起源于日本 1909年面筋酸水解生产谷氨酸 1956年由发酵法生产谷氨酸 我国氨基酸发酵工业1964年上海投产 赖氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸等12种氨基酸 一. 氨基酸的用途 （一）食品工业 甜味剂：甘氨酸、丙氨酸 酸味剂：天门冬氨酸、谷氨酸等 鲜味剂：天门冬氨酸钠、谷氨酸钠等 甘氨酸：可用于清凉饮料 赖氨酸：加强食品、饲料 天冬甜肽（Aspartom）： L-Asp和L-phe合成 美国Searle公司30年前低热量营养性甜味剂 口感近似蔗糖，甜度为蔗糖的2530倍，热量仅为蔗糖的1/160，全球总销量已1.5万吨阿丽泰(Alitame)：由天冬氨酸与丙氨酸合成 甜味更纯正，耐热性更好，最适用于面包、饼干、蛋糕等焙烤食品 聚赖氨酸：食品保鲜剂、肉类、家禽、海产、面包饼干和各种谷物食品的防腐保鲜；高级吸水性聚合物：婴儿尿片等产品日本年产已达1千多吨 聚谷氨酸：绿色塑料食品包装到一次性餐具和其它各种工业用途它在自然界中可迅速降解不环境污染日本已开发成功并有产品上市 （二） 医药工业 1. 氨基酸混合液：高营养液 2. 治疗用： 1）肝脏治疗：精氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、 天冬氨酸用以降低血氨 异亮氨酸、亮氨酸等纠正血浆氨基酸失衡 蛋氨酸、胱氨酸用于治疗脂肪肝 2）消化道疾病治疗：谷氨酰胺、苏氨酸治疗消化道溃疡, 亮氨酸、 谷氨酸调节胃液酸度 3）脑病治疗： L-谷氨酸与L-谷氨酰胺改善脑出血后遗症的记忆障碍 -氨基酸治疗癫痫等 左旋多巴用于震颤性麻痹等 4）心血管治疗 天冬氨酸用于心率失常 （三）化妆品 胱氨酸用于护发 丝氨酸用于雪花膏 谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸与脂肪酸形成的表面活性剂有洗净、抗菌作用 谷氨酸碱盐、精氨酸碱盐：化妆品对皮肤无刺激性 （四）其他 甘氨酸为除草剂成分 聚谷氨酸是合成皮革原料和表面活性剂原料 四大饲料氨基酸：蛋氨酸、赖氨酸、苏氨酸、色氨酸 色氨酸：提高猪的瘦肉率，减少脂肪使猪肉味道更鲜美聚精氨酸： 农用地膜 作为洗涤剂、废水处理剂等工业用途 氨基酸的生产方法：1.抽提法半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸的生产由于没有其他适当方法，目前还是用抽提法。2.直接发酵法按照菌株的特性，直接发酵法可分为四类 .使用野生型菌株或野生菌株的诱变株直接由糖和铵盐发酵生产氨基酸谷氨酸丙氨酸缬氨酸 .使用营养缺陷型突变株直接由糖和铵盐发酵生产氨基酸赖氨酸苏氨酸苯丙氨酸酪氨酸亮氨酸缬氨酸鸟氨酸瓜氨酸脯氨酸缺失 限制E的浓度，解除反馈抑制 .由氨基酸结构类似物抗性突变株直接由糖和铵盐发酵生产氨基酸赖氨酸苏氨酸苯丙氨酸酪氨酸色氨酸亮氨酸异亮氨酸缬氨酸鸟氨酸瓜氨酸精氨酸脯氨酸蛋氨酸 .使用营养缺陷型兼抗性突变株生产氨基酸赖氨酸苏氨酸苯丙氨酸酪氨酸色氨酸异亮氨酸亮氨酸鸟氨酸瓜氨酸精氨酸高丝氨酸 3. 添加中间产物的发酵以氨基酸的中间产物为原料，用微生物转化相应的氨基酸，这样可以避免氨基酸生物合成途径中的反馈抑制作用。丝氨酸色氨酸蛋氨酸异亮氨酸 4. 酶法 应用完整菌体或自微生物细胞抽提出酶类制造氨基酸丙氨酸天冬氨酸酪氨酸多巴（二羟基苯丙氨酸）色氨酸 5-羟基色氨酸赖氨酸 5. 合成法丙氨酸天冬酰胺甘氨酸蛋氨酸丝氨酸色氨酸苯丙氨酸 二、发酵法生产氨基酸 由于发酵法生产氨基酸，其原料廉价易得，生产条件温和，并且随着微生物代谢调节理论研究的发展，目前大部分氨基酸都以发酵法进行生产。 典型的代谢控制发酵 发酵产物氨基酸：中间代谢产物 积累：要求微生物正常代谢的抑制 关键：控制机制被解除，打破微生物正常代谢调节氨基酸发酵 氨基酸发酵的代谢控制氨 基 酸 发 酵 工 艺 控 制 和 选 育 氨 基 酸 高 产 菌 株的 依 据 有 以 下 几 个 方 面 ： 1.控制发酵环境条件 2. 控制细胞渗透性氨基酸发酵必须考虑的重要因素 细胞内生物素水平高，谷氨酸不能通过细胞膜表面活性剂增加细胞膜通透性青霉素影响细胞壁合成 表 面 活 性 剂引起细胞膜的脂肪酸成分的改变，改变其通 透性抑 制 合 成 3. 控制旁路代谢 4. 降低反馈作用物浓度目的产物缺失酶 5. 消除终产物的反馈抑制与阻遏作用目的产物 6.促进ATP积累，以利于氨基酸的生成-酮 戊 二 酸谷 氨 酸-谷 氨 酰 磷 酸谷 氨 酸 半 缩 醛1-吡 咯 啉 -5-羧 酸 脯 氨 酸 草 酰 乙 酸天 冬 氨 酸天 冬 氨 酰 磷 酸天 冬 氨 酸 半 缩 醛高 丝 氨 酸 苏 氨 酸-酮 基 丁 酸 异 亮 氨 酸 赖 氨 酸蛋 氨 酸ATPADP 苏 氨 酸 脱 水 酶反馈抑制缺失天冬氨酸激酶高丝氨酸激酶黄 色 短 杆 菌 （ 异 亮 氨 酸 缺 陷 型 ） 的 脯 氨 酸 发 酵 机 制 氨 基 酸 发 酵 的 代 谢 控 制1. 控 制 发 酵 环 境 条 件2. 控 制 细 胞 渗 透 性3. 控 制 旁 路 代 谢4. 降 低 反 馈 作 用 物 浓 度5. 消 除 终 产 物 的 反 馈 抑 制 与 阻 遏 作 用6. 促 进 ATP积 累 ， 以 利 于 氨 基 酸 的 生 成 三、谷氨酸发酵 （ 一 ） 、 谷 氨 酸 发 酵 机 制.谷 氨 酸 的 生 物 合 成 途 径 主 要 包 括 ： EMP途径 HMP途径 TCA循环乙醛酸循环 CO2固定反应 总 反 应 途 径 糖 经 过 EMP途 径 和 HMP生 成 丙 酮 酸 。 一 方 面 丙 酮 酸 氧 化 脱 羧 生 成 乙 酰 -CoA； 另 一 方 面 ， 经 CO2固 定 作 用 生 成 草 酰乙 酸 ； 两 者 合 成 柠 檬 酸 进 入 TCA循 环 ，由 三 羧 酸 循 环 的 中 间 产 物 -酮 戊 二 酸 ，在 谷 氨 酸 脱 氢 酶 的 催 化 下 ， 还 原 氨 基化 合 成 谷 氨 酸 。 CO2 总 反 应 式 和 理 论 转 化 率总反应式 C6H12O6+NH3+3/2O2 C5H9O4N +CO2+3H2O理论转化率： （147/180） 100%=81.7% EMP途 径 和 HMP途 径1. EMP途径葡 萄 糖 丙 酮 酸 生 成 不 同 产 物2. HMP途径6-磷 酸 葡 萄 糖 -磷 酸 葡 萄 糖 酸 5-磷 酸 戊 糖 2C化 合 物5-磷 酸 戊 糖 3C化 合 物 TCA循 环6-磷酸葡萄糖脱氢酶 戊糖代谢分解 生 物 素 充 足 ： H MP途 径 所 占 比 例 为 38%生 物 素 亚 适 量 ： H MP途 径 所 占 比 例 为 26% TCA、 DCA循 环 和 CO2固 定1.TCA循环丙 酮 酸 乙 酰 CoA丙 糖 -3-磷 酸 草 酰 乙 酸 柠 檬 酸 TCA氧 化 CO2固 定 CO2氧化-酮 戊 二 酸 脱 氢 酶 -酮 戊 二 酸 脱 氢 酶 -酮戊二酸脱氢酶在谷氨酸生物合成中非常重要谷氨酸高产菌应丧失或仅有微弱的-酮戊二酸脱氢酶活力-酮 戊 二 酸 琥 珀 酰 CoA 琥 珀 酸-酮 戊 二 酸 脱 氢 酶若 -酮 戊 二 酸 脱 氢 酶 活 力 很 弱 ， 就 使 糖 代 谢 流 进 入 TCA循 环 后 受 阻 在-酮 戊 二 酸 处-酮 戊 二 酸 NH 4+、 谷 氨 酸 脱 氢 酶 谷 氨 酸 2.DCA循环乙酰CoA草酰乙酸柠檬酸异柠檬酸琥珀酸乙醛酸乙酰CoA苹果酸异 柠 檬 酸裂 解 酶苹 果 酸 合 成 酶苹 果 酸 脱 氢 酶柠 檬 酸合 成 酶 CO2 DCA循环的生理意义作为TCA循环有缺陷时C4二羧酸的补充，特别是以醋酸和乙醇为原料的谷氨酸发酵，它是C4二羧酸的唯一补充来源作为能量供给来源的末端氧化系 TCA循环和DCA循环以醋酸为唯一碳源的菌体实验表明：菌体内有机酸浓度低到需要DCA循环运转时，由异柠檬酸裂解酶催化生成的乙醛酸与细胞内的草酰乙酸共同抑制异柠檬酸脱氢酶；由于DCA循环运转，TCA循环有机酸过剩，异柠檬酸裂解酶被抑制，乙醛酸浓度下降，解除对异柠檬酸脱氢酶的抑制，TCA循环运转 有 机 酸 浓 度 低 乙 醛 酸 、 草 酰 乙 酸异 柠 檬 酸 脱 氢 酶 抑 制DCA循 环 运 转 DCA循 环 运 转TCA循 环 有 机 酸 过 剩异 柠 檬 酸 裂 解 酶 抑 制乙 醛 酸 浓 度 降 低异 柠 檬 酸 脱 氢 酶 抑 制 解 除 TCA循 环 运 转 在 糖 质 原 料 的 谷 氨 酸 发 酵 中 ， 在 谷 氨 酸 生 成 期 ，如 果 葡 萄 糖 先 转 化 为 醋 酸 ， 再 由 DCA循 环 提供 C4二 羧 酸 合 成 谷 氨 酸 ， 谷 氨 酸 对 糖 的 转 化率 就 大 为 减 少 。3C6H12O6 6丙酮酸 6醋酸6醋酸 +2NH3+3O2 2C5H9O4N+2CO2+6H2O转化率：2 147/（ 3 180） 100%=54.4%在以葡萄糖为原料的谷氨酸发酵中，特别是谷氨酸生成期DCA循环应该关闭 3.CO2固 定在 谷 氨 酸 产 生 菌 中 已 检 出 两 种 CO2固 定 酶 ：磷 酸 烯 醇 丙 酮 酸 （ PEP） 羧 化 酶 和 苹 果 酸 酶PEP+CO2+G DP 草酰乙酸+G TPPEP羧化酶丙酮酸 苹果酸 草酰乙酸苹果酸脱氢酶苹果酸酶CO 2 NAD+ NADH+H+ CO2CO2PEP +PEP羧化酶丙 酮 酸 激 酶1，6-二磷酸果糖PEP羧 化 酶 对 PEP的 表 现 亲 和 力 约 是 丙 酮 酸 激 酶 的 1/10 与二磷酸果糖共同激活PEP羧化酶PEP浓 度 低 PEP易 进入 分 解 途径 乙 酰 -CoA浓 度 增 加转 向 CO2固 定草 酰 乙 酸TCA循 环 中间 产 物 浓 度增 加 抑 制PEP羧化 酶防 止过 剩乙 酰 -CoA氧 化ATP水 平 提 高 抑 制 丙 酮酸 激 酶所 以 在 谷 氨 酸 发 酵中 ， 糖 的 分 解 代 谢途 径 与 CO2固 定 的适 当 比 例 是 提 高 谷氨 酸 对 糖 收 率 的 关键 问 题 。生物合成和需能反应ATP浓度降低解除抑制丙酮酸激酶 氨 的 导 入氨 的 导 入 方 式 ：糖代谢中间体-酮戊二酸还原氨基化生成谷氨酸天冬氨酸或丙氨酸通过氨基转移作用将氨基转给-酮戊二酸而生成谷氨酸合成酶途径 柠 檬 酸异 柠 檬 酸 -酮 戊 二 酸 谷氨酸NADPH +H + NADPNH 4+糖代谢中间体-酮戊二酸还原氨基化生成谷氨酸异 柠 檬 酸 脱 氢 酶 ： 需 NADP为 辅 酶 ， 催 化 -酮 戊 二 酸的 生 成 （ 谷 氨 酸 的 前 体 ） ，并 为 谷 氨 酸 脱 氢 酶 提 供 辅 酶谷 氨 酸 脱 氢 酶 ： 需 NADPH +H+为 辅 酶活 细 胞 中 ， 异 柠 檬 酸 脱 氢酶 活 性 小 于 谷 氨 酸 脱 氢 酶活 性 ， 所 以 NADP浓 度 是实 际 上 的 限 速 因 子异柠檬酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶 黄 色 短 杆 菌 中 ， 谷 氨 酸 脱 氢 酶 对 -酮 戊 二 酸 和谷 氨 酸 表 现 出 同 促 相 互 作 用 ， 低 浓 度 的 -酮 戊 二 酸 和 谷氨 酸 对 此 酶 有 显 著 的 激 活 作 用 。 当 谷 氨 酸 浓 度 为 100mmol/L时 ， 抑 制 酶 活 65 ， 浓 度 为400mmol/L时 抑 制 90 ， 这 比 其 他 的 反 馈 抑 制 要 明 显 的 弱， 因 而 在 谷 氨 酸 发 酵 中 菌 体 内 游 离 出 来 的 谷 氨 酸 浓 度 就 要高 ， 可 以 认 为 这 个 调 节 机 制 对 谷 氨 酸 生 产 发 挥 着 很 好 的 调节 作 用 。调节机制 调节机制生物素 细胞膜通透性葡萄糖磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸乙酰-CoA草酰乙酸柠檬酸 -酮戊二酸谷氨酸天冬氨酸反馈抑制增强反馈抑制逆转反馈抑制反馈抑制优先合成生物素亚适量使得最后一代细菌细胞变形、拉长，改变了细胞膜的通透性，引起代谢失调，使谷氨酸得以积累 调节机制 谷 氨 酸 发 酵 中 ， 糖 代 谢 除 受 到 生 物 素 控 制外 ， 也 受 到 NH4+的 影 响 。 使 用 生 物 素 缺 乏 菌 ， 在 NH4+存 在 时 ， 葡 萄糖 以 很 快 的 消 耗 速 度 和 高 的 收 率 生 成 谷 氨酸 。 当 NH4+不 存 在 时 ， 糖 的 消 耗 速 度 很 慢 ， 生成 物 是 -酮 戊 二 酸 、 丙 酮 酸 、 醋 酸 和 琥 珀酸。 （二）、谷氨酸生产的工艺流程 微生物生长动力学模型的建立培养基的配制与灭菌菌种的扩大培养菌体浓度限制性基质浓度建立微生物生长动力学模型发酵过程中主要参数的检测 生化反应器重要参数KLa的检测亚硫酸钠氧化法动态法(溶氧电极法)发酵动力学实验 上罐实消培养基的配制三角瓶培养冷却接种固体斜面培养发 酵 发 酵 液发酵过程参数的控制OD值pH温度搅拌速度、 DO值发酵过程参数测定还原糖的测定谷氨酸的测定菌体形态观察菌体浓度测定 谷氨酸生产工艺流程pH7.0，流加尿素调节（0.40.6）测定菌体密度，OD值不再上升时，菌体分裂完成，约12h前期(012h) 3335 ; 中后期(35h)3638通气比：1: (0.080.1) 100吨罐32 ,pH7.0,OD=1.0 32 ,pH7.0,1824h