RNA指导的DNA复制(逆转录)及病毒的复制

RNA replicationReverse transcription=replication 逆转录酶 （reverse transcription) 1964年 ， Temin发 现 Rous肉 瘤 病 毒 等 RNA病 毒所 造 成 的 感 染 可 被 DNA合 成 抑 制 剂 遏 制 。 表 明 ： RNA肿 瘤 病 毒 的 RNA复 制 过 程 中 要 合 成DNA。 Temin又 发 现 放 线 菌 素 D能 抑 制 致 癌 RNA病 毒的 复 制 ， 但 不 能 抑 制 一 般 RNA病 毒 的 复 制 。 表 明 ： 转 录 对 于 RNA病 毒 增 殖 是 必 需 的 。 Temin提 出 前 病 毒 假 说 ： 原 病 毒 DNA是RNA肿 瘤 病 毒 在 复 制 和 致 癌 中 的 中 间 物 。 1970年 ， Temin 在 Rouse肉 瘤 病 毒 、Baltimore在 白 血 病 病 毒 中 发 现 逆 转 录 酶 。 多功能酶：1、 RNA指 导 的 DNA聚 合 酶 活 性2、 RNA酶 H（ RNaseH） 活 性 ： 水 解RNA-DNA杂 交 体 上 的 RNA3、 DNA指 导 的 DNA聚 合 酶 活 性 ： 合 成 互补 DNA。4、 没 有 35外 切 酶 活 性 。 特点：1. 含 有 Zn2+（ 是 否 有 锌 指 结 构 、 DNA结 合功 能 ？ ）2. DNA合 成 反 应 要 求 有 模 板 和 引 物 。3. 需 适 当 浓 度 的 二 价 阳 离 子 （ Mg2+、 Mn2+）4. 5 3合 成 方 向 逆转录病毒的基因组复制过程 第 一 阶 段 ： 合 成 负 股 cDNA的 大 部 分 第 二 阶 段 ： 以 负 股 DNA为 模 板 合 成 一 小部 分 正 股 DNA链 。 第 三 阶 段 ： 完 成 cDNA的 全 部 复 制 。 乙肝病毒基因组的复制 其 复 制 需 通 过 逆 转 录 过 程 经 RNA中 间 体实 现 ， 其 DNA聚 合 酶 也 是 一 种 逆 转 录 酶 。 逆 转 录 病 毒 ： RNA DNA RNA 乙 肝 病 毒 ： DNARNA DNA 试管内cDNA的合成 常 用 于 获 得 或 研 究 真 核 生 物 基 因 的 方 法 。提 取 某 一 种 特 定 的 mRNA， 经 逆 转 录 生成 的 cDNA可 代 表 某 一 特 定 基 因 。 常 用 的 逆 转 录 酶 有 两 种 ：* 来 自 鸟 类 成 髓 细 胞 瘤 逆 转 录 病 毒 称 为 AMV-RT；* 来 自 鼠 白 血 病 毒 称 为 MMLV-RT。 病毒RNA复制的主要方式 1、 病 毒 含 有 正 链 RNA， 如 灰 质 炎 病 毒 。 RNA（ +） 蛋 白 质 （ 酶 ） RNA复 制 2、 病 毒 含 有 负 链 RNA和 复 制 酶 如 狂 犬 病 毒 。RNA（ -） RNA（ +） 蛋 白 质 、 复 制 病 毒RNA（ -） 。 3、 病 毒 含 有 双 链 RNA和 复 制 酶 。 如 呼 肠 孤 病毒 。 双 链 RNA RNA（ +） 蛋 白 质 RNA（ -） 双 链 RNA 4、 逆 转 录 病 毒 。 讨论题 如 何 知 道 DNA复 制 中 先 要 有 RNA引 物 的合 成 ？ (原 料 /新 合 成 DNA序 列 分 析 /专 一 核 酸 酶水 解 ) 病毒的复制 病 毒 在 活 细 胞 内 ， 以 其 基 因 为 模 板 ， 在 酶 的 作 用 下 ，分 别 合 成 病 毒 基 因 及 蛋 白 质 ， 再 组 装 成 完 整 的 病 毒 颗粒 ， 这 种 方 式 称 为 复 制 （ replication)。 从 病 毒 进 入 宿 主 细 胞 开 始 ， 经 过 基 因 组 复 制 和 病 毒 蛋白 合 成 ， 至 释 放 出 子 代 病 毒 的 全 过 程 ， 称 为 一 个 复 制周 期 。 病 毒 的 复 制 周 期 主 要 包 括 吸 附 和 穿 入 、 脱 壳 、 生 物 合成 、 组 装 和 释 放 四 个 连 续 步 骤 。 复 制 周 期 病 毒 的 一 步 生 长 曲 线病 毒 的 一 步 生 长 曲 线 ： 以 感 染 时 间 为 横 坐 标 ， 病 毒 效 价 为 纵 坐 标 ， 绘 制 出 的 病 毒 特 征 曲 线 。 一 、 吸 附 和 穿 入（ 一 ） 吸 附 (adsorption)分 两 个 阶 段 ：1. 静 电 吸 附 ： 病 毒 体 与 细 胞 接 触 ， 进 行 静 电 结 合 。非 特 异 性 、 可 逆 。2. 真 正 的 吸 附 ： 病 毒 体 表 面 位 点 （ 蛋 白 质 结 构 ） 与宿 主 细 胞 膜 上 相 应 的 受 体 结 合 。 是 决 定 病 毒 感 染 的真 正 开 始 。 裸露病毒的吸附 囊 膜 病 毒 的 吸 附 （ 二 ） 穿 入 (penetration) 病 毒 体 吸 附 在 宿 主 细 胞 膜 上 后 ， 可 通 过 数 种 穿入 方 式 进 入 细 胞 ：1.无 囊 膜 的 病 毒 一 般 经 过 细 胞 膜 吞 入 ， 称 为 病 毒 胞 饮 ,如 腺病 毒 、 小 RNA病 毒 等 病毒胞饮 2. 有 囊 膜 的 病 毒 囊 膜 与 宿 主 细 胞 膜 融 合 ， 病 毒 的 核 衣 壳 直 接 进 入 细 胞 浆 内 病 毒 胞 饮 : 细 胞 膜 吞 入 (1) 膜融合后进入 (2) 病毒胞饮 二 、 脱 壳 (uncoating) 不 同 病 毒 脱 壳 方 式 不 一 ， 多 数 在 宿 主 细 胞 溶 酶 体 酶作 用 下 脱 壳 ， 释 放 出 基 因 组 核 酸 。 三 、 生 物 合 成 (biosynthesis) 病 毒 基 因 组 一 旦 从 衣 壳 中 释 放 后 ， 就 利 用 宿 主 细 胞 提供 的 低 分 子 物 质 合 成 大 量 的 病 毒 核 酸 和 结 构 蛋 白 。 早 期 ， 根 据 病 毒 基 因 组 转 录 成 mRNA、 指 令 合 成 转 录合 成 所 必 需 的 复 制 酶 和 一 些 抑 制 蛋 白 ； 生 物 合 成 阶 段 ， 病 毒 处 于 隐 蔽 期 病 毒 的 生 物 合 成 过 程 可 基 本 归 为 6大 类 ： 双 股 DNA病毒 、 单 股 DNA病 毒 、 单 正 股 RNA病 毒 、 单 负 股 RNA病 毒 、 逆 转 录 病 毒 和 双 股 RNA病 毒 。 病 毒 DNA早 期 mRNA早 期 蛋 白 （ 酶 等 ） 子 代 病 毒 DNA 晚 期 mRNA病 毒 结 构 蛋 白子 代 病 毒 子双 股 DNA病 毒 复 制宿 主 细 胞转 录 酶 单 链 正 股 RNA病 毒（ -）ssRNA亲 代 病 毒 （ +） ssRNA 早 期 蛋 白（ +） ssRNAdsRNA复 制 中 间 型（ -）ssRNA （ +） ssRNA大 量 子 代 （ +） ssRNA 晚 期 蛋 白 装 配 子 代 病 毒 单 股 负 股 RNA病 毒病 毒 自 身 携 带 依 赖 RNA的 RNA多 聚 酶 。亲 代 （ -ssRNA） （ +） mRNA 蛋 白 质（ +） ssRNA子 代 （ -） sRNA子 代 病 毒 多 聚 酶 逆 转 录 病 毒病 毒 RNA 逆 转 录 酶 双 股 DNA整 合 至 宿 主 细 胞 （ 前 病 毒 ）mRNA 病 毒 RNA结 构 蛋 白 装 配 子 代 病 毒RNA:DNA转 录 酶 聚 合 酶 四 、 组 装病 毒 核 酸 与 衣 壳 装 配 在 一 起 ， 形 成 病 毒 子 。绝 大 多 数 DNA病 毒 均 在 细 胞 核 内 组 装 ;RNA病 毒 和 痘 病 毒 在 细 胞 浆 内 组 装 。 绝 大 多 数 无 囊 膜 病 毒 释 放 ， 一 次 同 步 ， 破 坏 宿 主 细胞 膜 ， 细 胞 裂 解 释 放 病 毒 颗 粒 ， 细 胞 迅 速 死 亡 。绝 大 多 数 有 囊 膜 病 毒 以 出 芽 方 式 释 出 时 包 上 细 胞 核膜 或 细 胞 膜 而 成 为 成 熟 病 毒 。 逐 个 释 出 ， 非 一 次 同步 ， 细 胞 死 亡 缓 慢 。五 、 释 放 Virus Obtaining Its Envelope from Host Cell Membrane by Budding 复 制 周 期 思考题1 某 种 病 毒 DNA的 碱 基 组 成 （ 摩 尔 百 分 比 ）如 下 ： A=32； G=16； T=40； C=12 该 病 毒 DNA的 特 点 如 何 ？ 思考题2 简 要 说 明 怎 样 进 行 构 建 cDNA文 库 ？ 思考题3 组 织 培 养 的 哺 乳 动 物 细 胞 S期 长 达 5 小 时 ，经 放 射 自 显 影 测 定 DNA复 制 的 速 度 是 0.5微 米 /分 ， 已 知 哺 乳 动 物 细 胞 DNA全 长 1.2米 ， 计 算 染 色 体 复 制 时 共 有 多 少 复 制 叉在 复 制 ？ 8 103（ 如 何 分 析 ？ ） 思考题4 已 知 抹 香 鲸 和 猪 的 胰 岛 素 具 有 相 同 的 氨基 酸 序 列 ， 然 而 某 些 抗 血 清 却 能 将 它 们区 别 开 来 ， 这 岂 不 与 “ 蛋 白 质 的 一 级 结构 决 定 其 高 级 结 构 ” 的 理 论 相 矛 盾 吗 ？你 如 何 解 释 ？ 思考题5 将 某 种 纯 蛋 白 1mg进 行 氨 基 酸 分 析 ， 得19.5ug的 异 亮 氨 酸 （ 分 子 量 =131.2） ，那 么 该 蛋 白 质 的 最 小 分 子 量 是 多 少 ？