枸杞多糖检测方法研究

枸杞多糖检测方法研究姓 名 ： 王 畅2010-8-5 内容提要 简 介选 题 背 景研 究 目 的 和 意 义研 究 动 态 与 趋 势拟 采 取 的 研 究 方 法 枸杞多糖简介l 来 源 ： 茄 科 植 物 枸 杞 的 干 燥 果 实l 枸 杞 多 糖 （ Lycium barbarum polysaccharide） 简 称 LBP， 是 以 阿 拉 伯 糖 、 鼠 李 糖 、 木 糖 、 甘 露 糖 、 半乳 糖 、 葡 萄 糖 与 半 乳 糖 醛 酸 组 成 的 酸 性 杂 多 糖 同 多 肽 或 蛋 白质 构 成 的 复 合 多 糖 为 主 ,还 含 有 中 性 杂 多 糖 和 葡 聚 糖 同 多 肽 或蛋 白 质 构 成 的 复 合 多 糖 ， 是 天 然 的 大 分 子 物 质 。 Click to add textClick to add textClick to add textClick to add textClick to add textClick to add textClick to add text白 色 略 带 棕 色絮 状 ， 纤 维 状无 味吸 湿 性理化性质（一）性 状 理化性质（二）溶 解 性 1.溶 于 水 ， 二 甲 基 亚 砜 ， 溶 解 度 随 中性 单 糖 含 量 的 减 少 而 降 低 2.不 溶 于 高 浓 度 乙 醇 ， 乙 醚 ， 丙 酮 ，氯 仿 ， 正 丁 醇 等 有 机 溶 剂 理化性质（三） 常 见 的 化 学 性 质 测 定 试 验 结 果 结 论硫 酸 苯 酚 反 应 阳 性 含 中 性 糖 硫 酸 半 胱 氨 酸 阳 性 含 半 乳 糖 醛 酸卡 玛 斯 亮 蓝 反 应 阳 性 含 有 蛋 白 质斐 林 试 剂 反 应 阴 性 不 含 还 原 糖碘 碘 化 钾 反 应 阴 性 不 含 有 淀 粉 选题背景（一）l生 理 活 性 ： 增 强 免 疫 、 抗 氧 化 、 抗 衰 老 、抗 肿 瘤 、 降 血 糖 血 脂 、 保 肝 ， 可 作 为 第 三代 功 能 性 食 品 的 功 能 因 子l随 着 生 活 水 平 的 提 高 ， 由 以 治 病 为 主 向 防病 为 主 的 观 念 转 变 ， 为 功 能 食 品 的 开 发 带来 了 良 好 机 遇 。 功 效 明 确 的 枸 杞 多 糖 符 合新 一 代 功 能 食 品 的 要 求 ， 枸 杞 多 糖 的 研 究将 推 动 枸 杞 产 品 向 更 高 层 次 发 展 保健食品的区分 第 一 代 保 健 食 品 ： 以 民 间 的 处 方 ， 秘 方 为基 础 ， 根 据 原 材 料 的 功 能 推 断 保 健 品 的 功能 ， 未 经 严 格 的 科 学 检 测 的 保 健 食 品 第 二 代 保 健 食 品 ： 经 过 动 物 实 验 和 人 体 实验 证 明 产 品 具 有 某 项 生 理 调 节 功 能 ， 其 安全 性 ， 功 能 性 都 较 为 可 靠 第 三 代 保 健 食 品 ： 经 过 进 一 步 的 严 格 实 验及 审 核 ， 除 具 备 第 二 代 产 品 的 要 求 外 ， 还要 明 确 功 能 能 因 子 及 其 结 构 ， 含 量 ， 作 用机 理 ， 类 似 于 药 品 的 要 求 选题背景（二）多 糖 一 般 的 检 测 方 法 概 括 如 下 :1 将 无 紫 外 吸 收 的 多 糖 与 显 色 剂 显 色 ， 产 生 紫 外 吸 收 ， 从 而用 紫 外 法 定 量 ,如 硫 酸 -苯 酚 法 、 硫 酸 -蒽 酮 法 ， 3、 5-二 硝 基水 杨 酸 比 色 法 测 定 总 糖 。2 直 接 测 糖 法 ， 折 光 法 测 定 多 糖 ， 主 要 是 水 溶 性 糖 。 原 理 是 用折 射 计 测 得 的 折 射 指 数 值 (糖 度 )代 表 着 溶 液 中 可 溶 性 物 质 的 含量 高 低 ， 若 溶 液 中 的 溶 质 是 糖 物 质 或 以 糖 为 主 的 糖 物 质 ,则 折 射指 数 值 就 反 映 着 糖 含 量 的 高 低 。3 多 糖 检 测 的 HPLC法 也 是 基 于 上 面 的 思 路 ， 要 么 衍 生 化 后 使用 紫 外 或 荧 光 检 测 器 ， 要 么 使 用 通 用 型 检 测 器 ， 这 类 检 测 器 主 要 有 示 差 检 测 器 。 蒽酮-硫酸法 多 糖 在 浓 硫 酸 作 用 下 先 水 解 成 单 糖 ,并 迅 速 脱 水 生 成 糠 醛或 羟 甲 基 糠 醛 ,而 生 成 的 糠 醛 或 羟 甲 基 糠 醛 与 蒽 酮 脱 水 缩合 ,形 成 糠 醛 的 衍 生 物 ,反 应 后 溶 液 呈 蓝 绿 色 在 620nm处 有最 大 吸 收 ， 在 10100ug范 围 内 其 颜 色 的 深 浅 与 可 溶 性 糖质 量 浓 度 成 正 比 其 主 要 反 应 式 为 选题背景（三）l质 量 不 易 控 制 枸 杞 多 糖 是 一 个 水 溶 性 的 大 分 子 物质 , 不 能 如 小 分 子 物 质 那 样 , 通 过 熔 点 测 定 、 元 素分 析 , 四 大 光 谱 等 鉴 定 后 , 制 定 质 量 标 准 。l 分 子 量 测 定 决 定 了 枸 杞 多 糖 的 生 物 活 性 ， 分 子 量过 大 不 易 透 过 细 胞 膜 ， 影 响 活 性 ， 分 子 量 小 一 般是 没 有 活 性 的 ， 因 此 分 子 量 数 据 可 以 作 为 枸 杞 多糖 质 量 标 准 的 重 要 指 标 。l多 糖 的 单 糖 组 成 分 析 是 进 行 多 糖 质 量 控 制 和 获 取多 糖 基 本 信 息 的 重 要 环 节 。 单 糖 组 分 及 其 摩 尔 比可 以 作 为 质 量 标 准 的 重 要 指 标 。 l分 子 量 测 定 高 分 子 物 质 的 分 子 量 测 定 有 渗透 压 法 、 蒸 气 压 法 , 凝 胶 色 谱 法 、 超 速 离心 法 等 ， 但 已 有 的 报 导 大 多 集 中 在 有 机 溶剂 体 系 的 高 分 子 聚 合 物 如 各 种 塑 料 产 品 、人 工 橡 胶 等 ， 水 体 系 大 分 子 物 质 如 蛋 白 质 、多 糖 的 分 子 量 测 定 很 少 报 导l单 糖 组 成 测 定 方 法 主 要 有 TLC、 GC 、HPLC、 CE等 ,但 是 关 于 枸 杞 多 糖 柱 前 衍 生化 高 效 液 相 色 谱 法 测 单 糖 组 成 还 未 见 报 道 。 研究目的建 立 一 个 枸 杞 多 糖 的 质 量 标 准 定 量 鉴 别 方 法 ：(1)通 过 HPLC法 测 定 枸 杞 多 糖 的 分 子 量(2)通 过 柱 前 衍 生 化 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 枸 杞 多 糖的 单 糖 组 成 及 其 摩 尔 比 在 多 糖 的 分 子 量 测 定 方 法 、 尤 其 是 枸 杞多 糖 的 测 定 方 法 尚 未 确 立 标 准 ， 无 据 可依 的 情 况 下 ， 继 承 传 统 保 健 理 论 的 同 时结 合 现 代 科 学 检 测 技 术 ， 找 出 枸 杞 多 糖的 最 优 检 测 方 法 ， 制 订 枸 杞 多 糖 的 检 测标 准 ， 为 以 后 的 枸 杞 多 糖 检 测 提 炼 提 供依 据 。 研 究 意 义 研究动态常 见 的检 测 方 法 化 学 方 法物 理 方 法 苯 酚 -硫 酸 法 ， 高 碘 酸 氧 化 ，Smith降 解 ， 甲 基 化 分 析比 旋 光 仪 、 紫 外 分 光 光 度 计 、红 外 光 谱 仪 、 液 相 色 谱 仪 、气 相 色 谱 仪 、 质 谱 、 核 磁 共 振 从 所 得 到 的 数 据 来 看 ， 国 内 对 枸 杞 多 糖 的 分 离 纯 化 ， 含 量 测 定 分 离 提 取 、分 级 纯 化 组 分 鉴 定 及 其 分 子 量 、 结 构 、 基 本 性 质 等 方 面 有 大 量 成 果 报 道 ,但研 究 者 所 得 出 的 枸 杞 多 糖 分 子 量 、 组 成 、 结 构 、 等 研 究 结 果 各 不 相 同 枸杞多糖相对分子量的检测方法蒸汽压法 凝胶过滤法HPLC渗透压法光散射法 粘度法a f eb c d 分子量的测定方法 凝 胶 过 滤 法1. 将 已 知 分 子 量 的 葡 聚 糖 标 准 品 进 行 凝 胶 层系 ， 洗 脱 收 集 ， 用 硫 酸 -蒽 酮 法 检 测 多 糖 ，分 别 求 得 相 应 的 洗 脱 体 积 Ve 2. 用 蓝 色 葡 聚 糖 上 柱 求 得 外 水 体 积 Vo.以Ve/Vo为 纵 坐 标 ， lgMr为 横 坐 标 ， 得 到 分 子量 的 标 准 曲 线 。3.取 枸 杞 多 糖 进 行 一 样 的 操 作 求 得 Ve/Vo查 标准 曲 线 可 求 得 多 糖 的 分 子 量 LBP- ， LBP- ， LBP- ， LBP相 对 分 子 量 均 大 于 200001 LBPA3,LBPB1,LBPC2， LBPC4分 子 量 分 别为 66000， 18000， 12000， 100002 Duan 分 离 得 到 了 4 个 均 一 枸 杞 多 糖 ,其分 子 量 在 82 115 kDa 之 间3 黄 等 分 离 得 到 三 类 LbGP， 其 分 子 量 分 别 为925000， 2148000， 2370004王 建 华 通 过 SDS-不 连 续 体 系 凝 胶 电 泳 法测 得 LBP2a分 子 量 为 77482 5 多糖中单糖的组成及其摩尔比的测定方法对 微 量 物 质 的 检 出体 现 了 高 分 辨 率 的特 点 ， 但 是 所 测 样品 具 有 一 定 的 挥 发性 ， 衍 生 化 操 作 烦杂 、 费 时GC 分 离 速 度 快 ， 分 离效 果 好 ， 重 现 性 好 ，不 破 坏 样 品 ， 前 处理 简 单 HPLC操 作 方 便 ， 灵 活 但是 灵 敏 度 不 高 ， 对含 量 微 小 的 物 质 不易 检 出 ， 且 无 法 确定 单 糖 摩 尔 比TLC 组成成分l单 糖 ： 阿 拉 伯 糖 ， 鼠 李 糖 ， 木 糖 ， 甘 露 糖 ， 半 乳糖 ， 葡 萄 糖l半 乳 糖 醛 酸 -硫 酸 -半 胱 氨 酸 反 应 定 性l蛋 白 质 -斐 林 -酚 法 枸杞多糖中单糖的组成及其摩尔比名 称 单 糖 组 成 摩 尔 比LBP-6 Ara： Rha： Xyl： Man： Gal： Glc 4 .8 3 :0 .1 7 ： 0 .2 3 ： 0 1 9 :1 :1LBP- Ara： Rha： Xyl： Man： Gal： Glc 1 :3 .1 5 :0 .4 8 :0 .8 4 :5 .1 7 :4 .1 3LBP- Ara： Rha： Xyl： Man： Gal： Glc 1 :3 .5 7 :0 .0 2 :0 .2 2 :1 .5 3 :1 .0 3LBP- Ara： Rha： Xyl： Man： Gal： Glc 2 .4 3 :4 .2 2 :0 .9 5 :0 .3 8 :0 .3 8 :1LBP- Ara： Rha： Xyl： Man： Gal： Glc 2 .5 3 :3 .5 7 :1 .3 3 :0 .2 9 :1 :0 .8 6蛋 白 多糖 G Ara： Rha： Xyl： Man： Gal： Glc 2 .8 :0 .2 :0 .0 8 :0 .2 :2 .6 :1 .0LBP-V Ara： Gal： Glc 2 .5 :1 .0 :1 0 LBNP Ara： Xyl： Man： Gal： Glc 1 .0 ： 1 0 .0 ： 1 .0 :6 .7 :4 .0LBPC2 Xyl： Rha： Man 8 .8 ： 2 .3 ： 1LBPC4 Glc 红 外 光 谱 法方 法 ： KBr压 片 法 波 长 范 围 ： 4000650cm-1目 的 ： 主 要 是 确 定 吡 喃 糖 的 苷 键 构 型 及 常 规 观 察 其 他 官能 团 。 枸杞多糖常见官能团红外光谱解析 紫 外 检 测在 200nm处 有 多 糖的 特 征 吸 收 峰 在 260nm处 没 有 吸 收 峰 ，说 明 不 含 核 酸在 280nm处 吸 收 峰 不 明 显 ，说 明 蛋 白 质 含 量 低 发展趋势 1) 枸 杞 多 糖 结 构 与 活 性 、 功 能 的 关 系 方 面 得 到 明确 ， 市 场 上 将 有 更 多 以 枸 杞 多 糖 为 主 要 成 分 的 新药 ， 并 且 都 是 采 用 现 代 生 物 技 术 ， 从 分 子 、 细 胞 、器 官 等 分 子 生 物 水 平 上 研 究 活 性 因 子 的 结 构 、 含量 及 其 作 用 机 理 ， 准 确 评 价 其 功 效 。 2） 因 为 有 统 一 的 质 量 标 准 ， 明 确 的 结 构 证 明 其 新颖 性 ， 创 新 性 ， 实 用 性 ， 中 国 除 了 主 要 围 绕 枸 杞多 糖 的 提 取 方 法 、 纯 化 工 艺 、 分 离 技 术 、 制 备 治疗 脂 肪 肝 胃 溃 疡 药 物 应 用 等 专 利 以 外 ， 还 将 得 到更 多 关 于 枸 杞 多 糖 的 组 分 结 构 、 作 用 机 制 、 药 理功 效 等 方 面 的 专 利 。 拟采取的研究方法及可行性分析(1)通 过 HPLC法 测 定 枸 杞 多 糖 的 分 子 量 可 行 性 分 析 ： 严 邦 干 曾 采 用 此 法 测 定 香 菇 多 糖 的 分 子 量 ，该 方 法 较 其 他 多 糖 测 定 法 具 有 迅 速 ， 简 便 ， 准 确 的 特 点 ，是 目 前 较 为 行 之 有 效 的 测 定 方 法 . (2)通 过 柱 前 衍 生 化 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 枸 杞多 糖 的 单 糖 组 成 及 其 摩 尔 比 可 行 性 分 析 ： 采 用 3-甲 基 -1-苯 基 -2-吡 唑 啉 酮 (PMP)在碱 性 条 件 下 与 单 糖 定 量 缩 合 生 成 单 糖 PMP 衍 生 物 ,用 常 规的 紫 外 检 测 器 和 C 18烷 基 键 合 柱 ,建 立 适 于 多 糖 单 糖 组 成测 定 的 HPLC新 方 法 ,达 到 灵 敏 、 快 速 、 准 确 、 方 便 和 可在 线 大 批 量 分 析 的 目 标 。 HPLC法测分子量 色 谱 柱 ： protein kw-804 检 测 器 ： 示 差 折 光 检 测 器 温 度 ： 室 温 流 动 相 ： 醋 酸 钠 缓 冲 溶 液 以 不 同 分 子 质 量 的 标 准 右 旋 糖 酐 分 子 的 分 离 保 留时 间 与 相 应 的 分 子 质 量 建 立 分 子 质 量 对 数 值 绘 制标 准 坐 标 曲 线 ， 待 测 得 枸 杞 多 糖 经 分 离 后 得 到 不同 分 子 质 量 峰 的 保 留 时 间 值 ， 通 过 标 准 曲 线 即 可计 算 枸 杞 多 糖 的 分 子 质 量 分 布 （ 由 分 子 质 量 计 算辅 助 软 件 自 行 运 行 ） HPLC检测单糖组分和含量直 接 进 样 检 测 ：l柱 子 ： carbohydrate 柱 氨 基 键 合 相 柱 （ Spherisorb NH2 ， Hypersil NH2）l检 测 器 ： 示 差 检 测 器l缺 点 ： 柱 子 成 本 高 ， 氨 基 键 合 柱 易 与 还 原糖 生 成 希 夫 碱 ， 缩 短 柱 子 的 寿 命l示 差 检 测 器 灵 敏 度 低 ， 不 适 用 于 梯 度 洗 脱 柱前衍生化HPLC测枸杞多糖中的单糖组成前 处 理 ：1.样 品 水 解 ：a.硫 酸 适 合 于 中 性 糖 的 水 解b.三 氟 醋 酸 适 用 于 植 物 细 胞 壁 多 糖 ， 糖 蛋 白 ， 糖 胺聚 糖 的 水 解（ 1） 多 糖 的 水 解 常 用 硫 酸 ， 其 用 量 不 易 控 制 ， 过 多会 导 致 多 糖 样 品 的 炭 化 ， 而 产 生 杂 质 峰 ， 过 少 又会 水 解 不 完 全 。 本 法 采 用 三 氟 醋 酸 可 较 好 的 实 现多 糖 的 水 解 。 （ 2） 实 验 中 要 尽 量 减 少 样 品 的 水 分 含 量 ， 以 免 影 响衍 生 化 的 结 果 ， 在 衍 生 化 时 ， 适 当 加 大 无 水 醋 酸酐 的 用 量 也 可 减 小 水 分 的 影 响 。 柱前衍生化1.糖 类 衍 生 的 试 剂 ： 2 - 氨 基 苯 甲 酸 、 对 甲 氧 基 苯 胺 、 2 -氨 基吡 啶 、 6 -氨 基 喹 啉 、 对 硝 基 苯 甲 酰 氯 和 3-甲 基 -1-苯 基 -2-吡 唑 啉 酮 (PMP)2.步 骤 ：a.对 照 品 各 种 单 糖 标 准 品 Ara， Rha， Xyl，Man， Gal， Glc， Fuc按 等 量 混 合 衍 生 化b.枸 杞 多 糖 水 解 液 衍 生 化 柱前衍生化反应PMP的 优 点 ：l PMP与 糖 类 物 质 衍 生 时 反 应 条 件 温 和 ,产物 无 立 体 异 构 。 两 分 子 PMP 与 一 分 子 单 糖缩 合 ， 生 成 的 衍 生 物 与 各 单 糖 的 定 量 关 系明 确 ， 线 性 关 系 良 好 。 检 测 灵 敏 度 较 高 ,可同 时 检 测 醛 糖 、 酮 糖 及 糖 醛 酸lPMP衍 生 物 在 250 nm处 有 强 烈 的 紫 外 吸 收 ，克 服 了 单 糖 本 身 没 有 紫 外 吸 收 的 特 点 ， 同时 使 用 紫 外 检 测 器 克 服 了 示 差 检 测 器 灵 敏度 低 ， 不 适 用 于 梯 度 洗 脱 的 缺 点 。 HPLC色谱条件 色 谱 柱 ： C18色 谱 柱 检 测 器 ： 紫 外 检 测 器 检 测 波 长 ： 250nm 柱 温 ： 室 温 进 样 量 ： 20ul 流 动 相 (流 速 ： 1.2ml/min)溶 剂 A： 15%乙 腈 +20mm/L乙 酸 铵 水 溶 液溶 剂 B: 40%乙 腈 +20mm/L乙 酸 铵 水 溶 液梯 度 模 式 ：时 间 梯 度 ： 0min25min50min浓 度 梯 度 ： 0%50%100%溶 剂 B 多糖组成分析及计算方法 计 算 校 正 因 子fx=（ mx/Ax） /(mfuc/Afuc) 计 算 样 品 中 各 种 单 糖 的 比 例 ：m1:m2:m3.mn=A1f1:A2f2:A3f3.Anfn Ax,Afuc分 别 为 对 照 品 单 糖 x衍 生 物 ， 内 标 衍生 物 的 峰 面 积 ;mx,mfuc分 别 为 对 照 品 单 糖 x衍生 物 ， 内 标 衍 生 物 的 浓 度 （ mmol/L） 方法学的考察 线 性 范 围 ： 取 5种 不 同 浓 度 的 标 准 样 品 混 合液 衍 生 化 ， 进 样 记 录 色 谱 图 ， 看 浓 度 和 峰面 积 的 线 性 关 系 精 密 度 实 验 ： 取 标 准 单 糖 混 合 液 衍 生 化 连续 进 样 5次 ， 测 各 单 糖 面 积 之 比 的 进 样 精 密度 稳 定 性 实 验 ： 取 枸 杞 多 糖 水 解 液 衍 生 化 后的 溶 液 隔 两 小 时 进 样 一 次 ， 记 录 峰 面 积 ，测 相 对 误 差 重 复 性 实 验 ： 取 枸 杞 多 糖 ， 依 前 述 衍 生 化和 色 谱 条 件 ， 重 复 测 定 几 次 ， 看 相 对 误 差 指纹图谱的相似度评价 将 不 同 产 地 的 枸 杞 多 糖 按 照 相 同 方 法制 备 供 试 品 溶 液 ， 分 别 进 样 记 录 色 谱图 。 比 较 各 产 地 的 枸 杞 中 提 取 的 枸 杞多 糖 ， 确 定 了 共 有 的 指 纹 峰 ， 并 通 过对 照 品 的 色 谱 图 ， 确 定 了 主 要 的 指 纹峰 采 用 由 国 家 药 典 委 员 会 制 定 的 中 药 色谱 相 似 度 评 价 系 统 计 算 软 件 分 析 ， 将全 谱 导 入 后 ， 经 谱 图 处 理 ， 以 软 件 自动 生 成 的 对 照 图 谱 为 参 照 图 谱 ， 多 点校 正 将 谱 峰 进 行 比 较 ， 得 到 的 相 似 度结 果 ， 查 看 各 样 品 的 相 关 性 和 区 别 。 谢谢！ Q Q: 954570564 TEL:13604512801