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第 19单 元 生 物 技 术 实 践 1、 培 养 基 的 成 分 一 般 都 含 有 碳 源 （ 提 供 碳 元 素 的 物 质 ） 、 氮 源（ 提 供 氮 元 素 的 物 质 ） 、 水 和 无 机 盐 等 营 养 物 质 ； 另 外 还 需 要 满 足 微 生 物 生 长 对 pH、 特 殊 营 养 物 质 ，例 如 ： 生 长 因 子 (即 细 菌 生 长 必 需 ， 而 自 身 不 能 合 成的 化 合 物 ,如 维 生 素 、 某 些 氨 基 酸 、 嘌 呤 、 嘧 啶 )以 及氧 气 、 二 氧 化 碳 、 渗 透 压 等 的 要 求 。 考 点 1 微 生 物 的 利 用一 、 微 生 物 的 实 验 室 培 养 课 题 1 2、 培 养 基 种 类 及 用 途划 分标 准 培 养 基种 类 特 点 用 途物 理性 质 液 体 不 加 凝 固 剂 工 业 生 产半 固 体 加 凝 固 剂 ， 如 琼 脂 观 察 微 生 物 的 运 动 、 分 类 鉴 定固 体 微 生 物 分 离 、 鉴 定 、 计 数化 学性 质 天 然 含 化 学 成 分 不 明 确 的 天 然 物 质 工 业 生 产合 成 培 养 基 成 分 明 确 分 类 鉴 定用 途 选 择 培 养 基 中 加 入 某 种 化 学 物 质 ， 以 抑 制 不 需 要 的 微 生 物 的 生 长 ，促 进 所 需 的 微 生 物 的 生 长 培 养 、 分 离 出 特 定 微 生 物 (如 培 养酵 母 菌 和 霉 菌 ， 可 在 培 养 基 中 加入 青 霉 素 ) 鉴 别 根 据 微 生 物 的 代 谢 特 点 ， 在 培养 基 中 加 入 某 种 指 示 剂 或 化 学药 品 鉴 别 不 同 种 类 的 微 生 物 ， 如 用伊 红 美 篮 培 养 基 鉴 别 饮 用 水或 乳 制 品 中 是 否 有 大 肠 杆 菌 P211 课 题 1 教 材 P26 旁 栏 信 息 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 是 一 种 应 用 最 广 泛 和 最 普 通 的 细 菌 基 础 培 养 基 ， 有时 又 称 为 普 通 培 养 基 ， 由 于 这 种 培 养 基 中 含 有 一 般 细 菌生 长 繁 殖 所 需 要 的 最 基 本 的 营 养 物 质 ， 所 以 可 供 微 生 物生 长 繁 殖 。 基 础 培 养 基 含 有 牛 肉 膏 、 蛋 白 胨 、 NaCl和 琼 脂 。 牛 肉 膏 为 微 生 物 提 供 碳 源 、 能 源 、 磷 酸 盐 和 维 生 素 ,蛋 白 胨 主 要 提 供 氮 源 和 维 生 素 ， 而 NaCl提 供 无 机 盐 。 由 于 此 培 养 基 多 用 于 培 养 细 菌 ， 因 此 要 用 稀 酸 或 稀碱 将 其 pH调 至 中 性 或 微 碱 性 (7.0-7.2)， 以 利 于 细 菌 的 生长 繁 殖 。物 质 牛 肉 膏 蛋 白 胨 NaCl 琼 脂 水重 量 5g 10g 5g 20g 定 溶 至 100mL 菊 花 的 组 织 培 养 哺 乳 动 物 细 胞 培 养培 养 基 类 型培 养 环 境营 养 物 质特 殊 物 质温 度pH光 照气 体 选 一 P33 选 三 P46MS固 体 培 养 基 液 体 培 养 基无 菌 、 无 毒 的 环 境 葡 萄 糖 、 氨 基 酸 、促 生 长 因 子 、 无 机 盐 、微 量 元 素 等矿 质 元 素 ： 大 量 元 素 和微 量 元 素 ； 有 机 物 ： 维生 素 、 甘 氨 酸 、 烟 酸 、肌 醇 、 蔗 糖 、 琼 脂 ；生 长 素 和 细 胞 分 裂 素 多 以 36.5 0.5 为 宜多 数 为 7.2-7.495 空 气 +5 的 CO25.8左 右18-22每 日 光 照 12h 不 同 植 物对 各 种 条件 的 要 求往 往 不 同 煮 沸 消 毒 法 ： 可 以 杀 死 微 生 物 细 胞 和 部 分 芽 孢 。 巴 式 消 毒 法 ： 可 杀 死 牛 奶 中 的 微 生 物 ， 不 会 破 坏 其 营 养 成 分 。 化 学 药 剂 消 毒 ： 用 75%酒 精 擦 手 ， 用 氯 气 消 毒 水 源 。3、 无 菌 技 术 灭 菌 的 方 法 ： 灼 烧 灭 菌 ： 各 种 金 属 用 具 直 接 在 酒 精 灯 火 焰 的 充 分 燃烧 层 灼 烧 。 干 热 灭 菌 ： 用 于 能 耐 高 温 的 、 需 要 保 持 干 燥 的 物 品 。 高 压 蒸 汽 灭 菌 ： 主 要 用 于 能 耐 高 温 的 物 品 ， 如 金 属器 械 、 玻 璃 、 橡 胶 及 一 些 药 物 的 灭 菌 。 4、 用 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 进 行 大 肠 杆 菌 纯化 培 养 的 基 本 操 作 程 序 计 算 称 量 溶 化 灭 菌 倒 平 板 (1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基高 压 蒸 汽 灭 菌 4、 用 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 进 行 大 肠 杆 菌 纯化 培 养 的 基 本 操 作 程 序(1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基 (2)纯化大肠杆菌微 生 物 接 种 最 常 用 的 方 法 ： 平 板 划 线 法 和 稀 释 涂 布 平 板 法 。1.平 板 划 线 法 通 过 接 种 环 在 琼 脂 固 体 培 养 基 表 面 连 续 划 线 的 操 作 ， 将 聚集 的 菌 种 逐 步 稀 释 分 散 到 培 养 基 的 表 面 。 在 数 次 划 线 后 可 以 分 离 到 由 一 个 细 胞 繁 殖 而 来 的 肉 眼 可 见的 子 细 胞 群 体 称 菌 落 。 平 板 划 线 法 2.稀 释 涂 布 平 板 法 将 菌 液 进 行 一 系 列 的 梯 度 稀 释 ， 然 后 将 不 同 稀 释 度 的 菌 液分 别 涂 布 到 琼 脂 固 体 培 养 基 的 表 面 进 行 培 养 。 在 稀 释 度 足 够 高 的 菌 液 里 ， 聚 集 在 一 起 的 微 生 物 将 分 散 成单 个 细 胞 ， 从 而 能 在 培 养 基 表 面 形 成 单 个 的 菌 落 。 稀 释 涂 布 平 板 法 操 作 过 程 分 两 个 步 骤 ： 即 系 列 稀 释 操 作 和涂 布 平 板 操 作 。系 列 稀 释 操 作涂 布 平 板 操 作微 生 物 接 种 的 核 心 是 防 止 杂 菌 的 污 染 ， 保 证 培 养 物 的 纯 度 例 、 【 名 师 P214跟 踪 训 练 2】 在 微 生 物 的 实 验 室 纯 化 培养 时 ， 下 列 操 作 与 杀 灭 细 菌 无 关 的 是 （ ）A.接 种 前 用 肥 皂 洗 双 手 ， 再 用 酒 精 擦 拭 双 手 B.接 种 前 用 火 焰 灼 烧 接 种 针 （ 环 ） C.培 养 基 在 50 左 右 搁 置 斜 面 D.在 酒 精 灯 的 火 焰 旁 完 成 倒 平 板 的 操 作【 解 析 】 培 养 基 搁 置 斜 面 其 实 是 增 大 接 种 面 积 ，是 在 无 菌 处 理 后 进 行 的 步 骤 ， 与 杀 灭 细 菌 无 关 。C 例 、 【 名 师 P214跟 踪 训 练 4】 （ 双 选 ） 下 列 有 关 微 生 物 的接 种 方 法 的 叙 述 ， 正 确 的 是 （ ）A.微 生 物 接 种 方 法 只 有 平 板 划 线 法 和 稀 释 涂 布 平 板 法B.平 板 划 线 法 是 通 过 接 种 环 在 琼 脂 固 体 培 养 基 表 面 连 续划 线 的 操 作 C.稀 释 涂 布 平 板 法 中 的 稀 释 是 指 将 菌 液 进 行 一 系 列 梯 度的 稀 释 D.平 板 划 线 操 作 时 ， 接 种 环 在 一 次 灭 菌 后 可 以 连 续 划 线【 解 析 】 A.微 生 物 接 种 的 方 法 很 多 ， 题 中 的 方 法 是 最 常 用 的 两 种方 法 ， 除 此 之 外 ， 还 有 斜 面 接 种 和 穿 刺 接 种 等 ； D.在 进 行 平 板 划 线 时 ， 在 操 作 的 第 一 步 及 每 次 划 线 之 前 都 要 将接 种 环 灼 烧 灭 菌 ， 且 划 线 操 作 结 束 时 ， 仍 然 需 要 灼 烧 接 种 环 。BC 二 、 土 壤 中 分 解 尿 素 细 菌 的 分 离 与 计 数 课 题 21.筛 选 菌 株 的 原 理 与 方 法(1)原 理 ： 微 生 物 的 选 择 培 养(2)方 法 ：根 据 目 的 菌 株 对 生 存 环 境 的 要 求 ， 到 相 应 环 境 去 寻 找 。本 实 验 提 供 的 选 择 培 养 基 (尿 素 是 培 养 基 中 唯 一 的 氮 源 )。例 、 【 名 师 P214跟 踪 训 练 5】 下 列 所 述 环 境 条 件 下 的 微生 物 ， 能 正 常 生 长 繁 殖 的 是 （ ） A.在 加 入 尿 素 和 葡 萄 糖 的 选 择 培 养 基 上 的 尿 素 细 菌 B.在 人 体 表 皮 擦 伤 部 位 的 破 伤 风 杆 菌 C.在 新 配 制 的 植 物 矿 质 培 养 液 中 的 酵 母 菌 D.在 灭 菌 后 的 动 物 细 胞 培 养 液 中 的 禽 流 感 病 毒A 二 、 土 壤 中 分 解 尿 素 细 菌 的 分 离 与 计 数 课 题 22 统 计 菌 体 数 目 的 原 理 及 方 法(1)间 接 计 数 法 (或 活 菌 计 数 法 )：最 常 用 的 稀 释 涂 布 平 板 法利 用 特 定 细 菌 计 数 板 或 血 细 胞 计 数 板(2)直 接 计 数 法 ： 设 置 重 复 组 ： 为 使 结 果 接 近 真 实 值 ， 需 将 同 一 稀 释 度 加 到 三 个或 三 个 以 上 的 平 板 上 ， 经 涂 布 、 培 养 ， 计 算 出 菌 落 的 平 均 数 。 为 了 保 证 结 果 准 确 ， 一 般 选 菌 落 数 在 30-300个 平 板 进 行 计 数 。 每 克 土 壤 样 品 菌 数 = 某 稀 释 倍 数 的 菌 落 平 均 数 稀 释 倍 数 细 菌 培 养 时 所 用 的 稀 释 液 体 积最 常 用 的 显 微 镜 直 接 计 数 法 (1)对 分 离 的 菌 种 作 进 一 步 的 鉴 定 ， 还 需 要 借助 生 物 化 学 的 方 法 。(2)在 细 菌 分 解 尿 素 的 化 学 反 应 中 ， 细 菌 合 成的 将 尿 素 分 解 成 了 。 氨 会 使 培 养 基 的碱 性 ， pH 。 因 此 ， 我 们 可 以 通 过 检 测培 养 基 变 化 来 判 断 该 化 学 反 应 是 否 发 生 。(3)在 以 为 唯 一 氮 源 的 培 养 基 中 加 入 指示 剂 。 培 养 某 种 细 菌 后 ， 如 果 pH升 高 ， 指 示剂 将 变 ， 说 明 该 细 菌 能 够 。3、 课 题 延 伸 - 能 分 解 尿 素 的 细 菌 的 鉴 定 ：脲 酶 氨增 强 升 高pH尿 素 酚 红红 分 解 尿 素 教 材 P26 三 、 分 解 纤 维 素 的 微 生 物 的 分 离 课 题 3 纤 维 素 是 一 种 由 葡 萄 糖 首 尾 相 连 而 成 的 高 分 子 化合 物 ， 广 泛 地 存 在 于 植 物 的 根 、 茎 、 叶 等 器 官 中 。 纤 维 素 酶 由 微 生 物 分 泌 的 一 种 复 合 酶 ， 包 括酶 、 酶 和 葡 萄 糖 苷 酶 ， 由 于 它 们 的 协 同 作 用 ， 最终 将 纤 维 素 分 解 成 葡 萄 糖 。纤 维 素酶酶纤 维 二 糖葡萄糖苷 酶葡 萄 糖1、 纤 维 素 与 纤 维 素 酶 ： 纤 维 素 是 地 球 上 含 量 最 丰 富 的 多 糖 类 物 质 。 其中 棉 花 是 自 然 界 中 纤 维 素 含 量 最 高 的 天 然 产 物 。 三 、 分 解 纤 维 素 的 微 生 物 的 分 离 课 题 32、 实 验 原 理(1)刚 果 红 染 色 法 筛 选 的 原 理 ：(2)选 择 培 养 基 与 鉴 别 培 养 基 的 应 用 刚 果 红 是 一 种 染 料 ， 它 可 以 与 纤 维 素 形 成 红 色 复 合 物 ， 但并 不 和 纤 维 二 糖 、 葡 萄 糖 发 生 这 种 反 应 。 当 纤 维 素 被 纤 维 素酶 分 解 后 刚 果 红 纤 维 素 的 复 合 物 就 无 法 形 成 ， 培 养 基 中 会出 现 以 纤 维 素 分 解 为 中 心 的 透 明 圈 。 这 样 我 们 可 以 通 过 是 否产 生 透 明 圈 来 筛 选 纤 维 素 分 解 菌 。 三 、 分 解 纤 维 素 的 微 生 物 的 分 离 课 题 33、 实 验 设 计 与 操 作 步 骤 刚 果 红 的 染 色 法 有 两 种 ： 先 培 养 微 生 物 ， 再 加 入 刚 果 红进 行 颜 色 反 应 ； 在 倒 平 板 时 就 加 入 刚 果 红 。 统 计 微 生 物 菌 落 数 目 的 方 法 微 生 物 接 种 方 法常 见 的 有 平 板 划 线 法 和 稀 释 涂 布 平 板 法 。(1)稀 释 涂 布 平 板 法(2)显 微 镜 直 接 计 数 法 利 用 特 定 细 菌 计 数 板 或 血 细 胞 计 数 板 ， 在 显 微 镜 下计算一定容积样品中微生物的数量， 但 不 能 区 分 细 菌 的死 活 。 排 除 实 验 组 中 非 测 试 因 素 对 实 验 结 果 的 影 响 ,提 高 实 验 结 果 的 可 信 度 。 (课 本 P22)4 对 照 实 验 的 目 的 及 种 类(1)概 念 ：(2)目 的 ：(3)常 用 的 对 照 方 式 有 ： 空 白 对 照 ： 空 白 对 照 是 不 给 对 照 组 任 何 处 理 因 素 。 标 准 对 照 ： 不 设 对 照 组 ， 而 是 用 标 准 值 或 正 常 值 做 对 照的 方 式 。 阳 性 对 照 ： 是 给 予 对 照 组 以 已 经 证 明 是 一 种 有 效 因 素 的处 理 因 素 。 自 身 对 照 ： 对 照 和 实 验 均 在 同 一 对 象 上 进 行 相 互 对 照 ： 不 设 对 照 组 ， 而 是 几 个 实 验 组 相 互 对 照 ， 这种 实 验 又 称 轮 组 实 验 法 。 名 师 P212指 除 被 测 条 件 (自 变 量 )外 ， 其 他 条 件 (无 关变 量 )都 相 同 的 实 验 。 例 、 【 名 师 P215跟 踪 训 练 6】 用 来 判 断 选 择 培 养 基 是 否起 到 了 选 择 作 用 ， 需 要 设 置 的 对 照 是 （ ） A 未 接 种 的 选 择 培 养 基 B 未 接 种 的 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 C 接 种 了 的 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 D 接 种 了 的 选 择 培 养 基【 解 析 】 将 菌 液 稀 释 相 同 的 倍 数 ， 在 牛 肉 膏 蛋 白 胨培 养 基 上 生 长 的 菌 落 数 目 应 明 显 多 于 选 择 培 养 基 上的 数 目 ， 因 此 ， 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 可 作 为 对 照 。对 照 实 验 应 遵 循 的 原 则 之 一 是 单 一 变 量 原 则 ， 所 以应 与 选 择 培 养 基 一 样 接 种 、 培 养 。 C 果 酒 果 醋 腐 乳 泡 菜发 酵菌 种 酵 母 菌 醋 酸 菌 毛 霉 乳 酸 菌代 谢类 型 异 养兼 性 厌 氧 型 异 养需 氧 型 异 养需 氧 型 异 养厌 氧 型18-25 , pH呈 酸 性无 氧 条 件重 铬 酸 钾与 其 反 应呈 灰 绿 色 30-35 ,氧 气 充 足品 尝 、 pH试 纸 检 测 15-18 接种 ,酒 精 含量 控 制 在12%左 右 常 温 ， 无 氧 条 件pH检 测 ,亚硝 酸 盐 的检 测 方 法考 向 2 传 统 发 酵 工 程 技 术 的 应 用1、 果 酒 与 果 醋 制 作 的 比 较 1、 果 酒 与 果 醋 制 作 的 比 较果 酒 果 醋 腐 乳 泡 菜 、 酸 奶发 酵菌 种 酵 母 菌 醋 酸 菌 毛 霉 乳 酸 菌代 谢类 型 异 养兼 性 厌 氧 型 异 养需 氧 型 异 养需 氧 型 异 养厌 氧 型C6H12O6+6O2+6H2O 6CO2+12H2O+能 量酶C 6H12O6 2C2H5OH(酒 精 )+2 CO2+能 量酶C6H12O6 C H O酶 (乳 酸 )+能 量 【 例 】 (双 选 )小 李 尝 试 制 作 果 酒 ， 他 将 葡 萄 汁 放 入 已灭 菌 的 发 酵 装 置 中 进 行 试 验 (见 图 )， 恰 当 的 做 法 是 A 加 入 适 量 的 酵 母 菌 B 一 直 打 开 阀 b通 气 C 一 直 关 紧 阀 a， 偶 尔 打 开 阀 b几 秒 钟 D 把 发 酵 装 置 放 到 4 冰 箱 中 进 行 试 验AC 例 （ 10江 苏 卷 ） 、 下 图 表 示 果 酒 和 果 醋 制 作 过 程 中 的物 质 变 化 过 程 ， 下 列 叙 述 正 确 的 是 A.过 程 和 都 只 能 发 生 在 缺 氧 条 件 下 B.过 程 和 都 只 发 生 在 酵 母 细 胞 的 线 粒 体 中 C.过 程 和 都 需 要 氧 气 的 参 与 D.过 程 - 所 需 的 最 适 温 度 基 本 相 同 C 解 析 ： 过 程 、 、 为 酵 母 菌 的 呼 吸 作 用 ， 最 适 宜 温 度约 为 20 左 右 ； 的 最 适 宜 温 度 为 3035 果 酒 发 酵 装 置 ： 排 出 CO2 便 于 取样 检 查和 放 出发 酵 液 排 气 口 胶 管 长 而 弯 曲 的 作 用 ？ 防 止 空 气 中 微 生 物 的 污 染果 酒 的 发 酵 装 置 示 意 图使 用 该 装 置 制 酒 时 ， 应 该 关 闭 。充 气 口制 醋 时 ， 应 将 充 气 口 。连 接 气 泵 ， 输 入 氧 气在 醋 酸 发 酵 时 连接 充 气 泵 进 行 充气 用 的 。 葡 萄 汁 2、 腐 乳 的 制 作(1)毛 霉 在 腐 乳 制 作 中 的 作 用 ： 在 豆 腐 的 发 酵 过 程 中 ， 毛霉 等 微 生 物 产 生 的 能 将 豆 腐 的 蛋 白 质 分 解成 ， 脂 肪 酶 可 将 脂 肪 水 解为 。 蛋 白 酶小 分 子 的 肽 和 氨 基 酸甘 油 和 脂 肪 酸(2)毛 霉 的 来 源 :传 统 腐 乳 的 生 产 中 ， 豆 腐 块 上 生 长 的 毛霉 来 自 ， 而 现 代 的 腐 乳 生 产 是在 的 条 件 下 ， 将 在豆 腐 上 ,这 样 可 以 避 免 ， 保 证 产 品 的 质 量 .(3)腐 乳 的 发 酵 有 多 种 微 生 物 的 协 同 作 用 ， 如 、 、 、 等 ， 其 中 起 主 要 作 用 的 是 。优 良 毛 霉 菌 种 直 接 接 种其 他 菌 种 的 污 染 空 气 中 的 毛 霉 孢 子严 格 无 菌 青 霉酵 母 曲 霉 毛 霉 毛 霉(4)操 作 的 注 意 ： 盐 的 用 量 ， 在 瓶 口 表 面 铺 盐 厚 些 ， 以 抑 制 微 生 物 的 生 长 。 卤 汤 中 酒 精 含 量 控 制 在 12 左 右 为 宜 。 防 止 杂 菌 的 污 染 。 3、 制 作 泡 菜 并 检 测 亚 硝 酸 盐 含 量 (1)乳 酸 菌 是 异 养 厌 氧 型 细 菌 ， 在 无 氧 条 件 下 ， 将葡 萄 糖 分 解 成 乳 酸 。 常 见 的 乳 酸 菌 有 乳 酸 链 球 菌 和 乳酸 杆 菌 ， 乳 酸 杆 菌 常 用 于 制 作 酸 奶 。 (2)在 盐 酸 酸 化 条 件 下 ， 亚 硝 酸 盐 通 过 显 色 反 应 ，与 已 知 浓 度 的 标 准 液 对 比 ， 即 可 估 算 样 品 中 的 亚 硝 酸盐 含 量 。 例 、 【 名 师 P207跟 踪 训 练 2】 在 一 个普 通 的 锥 形 瓶 中 加 入 含 有 酵 母 菌 的葡 萄 糖 溶 液 ， 如 右 图 所 示 。 下 图 所示 的 坐 标 图 中 不 正 确 的 是 （ ）【 解 析 】 葡 萄 糖 的 量 是 一 定 的 ， 且 在 发 酵 的 后 期 酵 母菌 将 会 进 行 无 氧 呼 吸 ， 产 生 酒 精 ， 故 酵 母 菌 的 数 量 不可 能 无 限 增 加 。 B 例 、 （ 2010山 东 高 考 理 综 ） 34. 生 物 柴 油 是 一 种 可 再 生 的 清 洁 能 源 ，其 应 用 在 一 定 程 度 上 能 够 减 缓 人 类 对 化 石 燃 料 的 消 耗 ， 科 学 家 发 现 ，在 微 生 物 M产 生 的 脂 肪 酶 作 用 下 ， 植 物 油 与 甲 醇 反 应 能 够 合 成 生 物 柴油 （ 如 下 图 ） 。 （ 1） 用 于 生 产 生 物 柴 油 的 植 物 油 不 易 挥 发 ， 宜 选 用 _、 _方 法 从 油 料 作 物 中 提 取 。（ 2） 筛 选 产 脂 肪 酶 的 微 生 物 M时 ， 选 择 培 养 基 中 的 添 加 的 植 物 油 为微 生 物 生 长 提 供 _， 培 养 基 灭 菌 采 用 的 最 适 方 法 是 _法 。（ 3） 测 定 培 养 液 中 微 生 物 数 量 ， 可 选 用 _法 直 接 计数 ； 从 微 生 物 M分 离 提 取 的 脂 肪 酶 通 常 需 要 检 测 _， 以 确 定其 应 用 价 值 ； 为 降 低 生 物 柴 油 生 产 技 术 ， 可 利 用 _技 术 使 脂 肪 酶 能 够 重 复 使 用 。 （ 4） 若 需 克 隆 脂 肪 酶 基 因 ， 可 应 用 耐 热 DNA聚 合 酶 催 化 的 _技术 。 PCR压 榨 萃 取碳 源 高 压 蒸 汽 灭 菌显 微 镜 直 接 计 数酶 活 性（ 或 ： 固 定 化 细 胞 ） 固 定 化 酶 果 胶 是 植 物 细 胞 壁 及 的 主 要 成 分 之 一 ，它 是 由 聚 合 而 成 的 一 种 高 分 子 化 合 物 ，不 溶 于 水 。 在 果 汁 加 工 中 ， 果 胶 不 仅 会 影 响 出 汁 率 ，还 会 使 果 汁 。一 、 果 胶 酶 在 果 汁 生 产 中 的 作 用 课 题 3 1、 基 础 知 识 果 胶 酶 的 作 用 ： 能 够 分 解 果 胶 ， 瓦 解 植 物 的 及 ， 使 榨 取 果 汁 变 得 更 容 易 ， 而 将果 胶 分 解 成 可 溶 性 的 。 胞 间 层半 乳 糖 醛 酸浑 浊细 胞 壁 半 乳 糖 醛 酸（ 1） 果 胶 和 果 胶 酶 胞 间 层 果 胶 酶 的 组 成 ： 包 括 、 和 等 ， 因 此 果 胶 酶 并 不 是一 种 酶 ， 而 是 分 解 果 胶 的 一 类 酶 的 总 称 。 多 聚 半 乳 糖 醛 酸 酶果 胶 分 解 酶 果 胶 酯 酶 纤 维 素 酶 由 微 生 物 分 泌 的 一 种 复 合 酶 ， 包 括 酶 、 酶 和 葡萄 糖 苷 酶 ， 由 于 它 们 的 协 同 作 用 ， 最 终 将 纤 维 素 分 解 成 葡 萄 糖 。考 向 3 酶 的 应 用 酶 反 应 速 度 用 单 位 时 间 内 、 单 位 体 积 中 反 应物 的 或 产 物 的 来 表 示 。2、 酶 的 活 性 与 影 响 酶 活 性 的 因 素主 要 有 、 和 酶 的 等 。 （ 1） 酶 的 活 性 ：是 指 酶 催 化 的 能 力 ，一 定 化 学 反 应 减 少 量 增 加 量 温 度 pH 抑 制 剂 其 高 低 可 以 用 在 一 定 条 件 下 ， 酶 所 催 化 的某 一 化 学 反 应 的 速 度 （ 速 率 ） 来 表 示 。（ 2） 影 响 酶 活 性 的 因 素 ：(3)果 胶 酶 的 用 量 生 产 果 汁 时 ， 为 了 使 果 胶 酶 得 到 充 分 的 利 用 ，节 约 成 本 ， 需 要 控 制 好 酶 的 用 量 。 3、 探 究 温 度 、 pH对 果胶 酶 活 性 的 影 响 及 果胶 酶 用 量 的 实 验 设 计（ 1） 原 理 ： 一 系 列 不 同 温 度 梯 度或 pH梯 度 或 者 不 同 含 量 的果 胶 酶 溶 液 ， 探 究 果 胶 酶的 最 适 温 度 、 pH或 果 胶 酶用 量 。 在 实 验 中 必 须 遵 循单 一 变 量 原 则 。（ 2） 设 计 方 案 及 流程 （ 如 图 ） （ 3） 在 实 际 的 操 作 过 程 中 ， 需 要 注 意 的 事 项 可 以 选 用 10 或 以 5 作 为 温 度 梯 度 。 苹 果 、 橙 子 和 葡 萄 等 水 果 都 可 以 作 为 反 应 物 ， 水 果 不 用 去 皮 。 果 泥 的 用 量 可 以 采 用 5mL左 右 ， 果 胶 酶 的 用 量 可 采 用 质 量 浓 度为 2%的 果 胶 酶 溶 液 2mL。 水 浴 时 间 可 以 为 20 30min。 过 滤 果 汁 时 ， 漏 斗 中 应 放 置 滤 纸 。 探 究 pH 对 果 胶 酶 活 性 的 影 响 ， 只 须 将 温 度 梯 度 改 成 pH 梯 度 ， 并选 定 一 个 适 宜 的 温 度 进 行 水 浴 加 热 。 反 应 液 中 的 pH 可 以 通 过 体积 分 数 为 0.1%的 氢 氧 化 钠 或 盐 酸 溶 液 进 行 调 节 。 探 究 果 胶 酶 的 用 量 是 建 立 在 探 究 最 适 温 度 和 pH 对 果 胶 酶 活 性 影响 的 基 础 之 上 的 。 此 时 ， 研 究 的 变 量 是 果 胶 酶 的 用 量 ， 其 他 因素 都 应 保 持 不 变 。 实 验 时 可 以 配 制 不 同 浓 度 的 果 胶 酶 溶 液 ， 也可 以 只 配 制 一 种 浓 度 的 果 胶 酶 溶 液 ， 然 后 使 用 不 同 的 体 积 即 可 。 需 要 注 意 的 是 ， 反 应 液 的 pH 必 须 相 同 ， 否 则 将 影 响 实 验 结 果 的准 确 性 。 二 、 探 究 不 同 种 类 的 加 酶 洗 衣 粉 的 洗 涤 效 果 加 酶 洗 衣 粉 除 含 有 普 通 洗 衣 粉 的 成 分 外 ， 目前 常 用 的 酶 制 剂 有 多 种 ： 蛋 白 酶 、 脂 肪 酶 、 淀 粉 酶 、纤 维 素 酶 ， 还 有 复 合 酶 。 其 中 应 用 最 广 泛 、 效 果 最明 显 的 是 碱 性 蛋 白 酶 和 碱 性 脂 肪 酶 。 复 合 酶 实 验 测 定 ， 单 独 使 用 蛋 白 酶 或淀 粉 酶 ， 得 到 的 洗 涤 效 果 远 不 如 把每 种 酶 用 量 减 半 后 放 在 一 起 使 用 的效 果 。 即 给 定 酶 的 用 量 ， 复 合 酶 的效 果 远 远 超 过 单 一 酶 的 效 果 。 原 因 是 淀 粉 酶 分 解 了 污 渍 表 面的 淀 粉 污 垢 ， 使 蛋 白 酶 能 以 更 有 效的 方 式 向 蛋 白 质 污 垢 进 攻 。 实 验 设 计探 究 普 通 洗 衣 粉 和 加 酶 洗 衣 粉 对 衣 物 污 渍 的 洗 涤 效 果(1)实 验 原 理生 活 中 的 各 种 污 渍 主 要 是 蛋 白 质 、 脂 质 、 淀 粉 等 多 种 不溶 于 水 的 有 机 物 ， 这 些 有 机 物 能 在 相 应 的 蛋 白 酶 、 脂 肪酶 和 淀 粉 酶 的 作 用 下 水 解 成 易 溶 于 水 的 小 分 子 有 机 物 。(2)遵 循 原 则 实 验 变 量 为 不 同 种 类 的 洗 衣 粉 ， 设 计 时 应 遵 循单 一 变 量 原 则 、 对 照 原 则 。 有 效 的 控 制 其 他 变 量 ， 如 水 的 用 量 、 污 染 物 的 量 ，所 用 实 验 用 布 的 质 地 、 大 小 ， 两 种 洗 衣 粉 的 用 量 ，搅 拌 及 洗 涤 时 间 。 将 果 胶 酶 与 苹 果 泥 分 装于 不 同 试 管 ， 在 10 水 浴中 恒 温 处 理 10分 钟 (如 图 A)。 将 步 骤 处 理 后 的 果 胶 酶和 苹 果 泥 混 合 ， 再 次 在 10 水 浴 中 恒 温 处 理 10分 钟 (如 图 B)。 将 步 骤 处 理 后 的 混 合 物 过 滤 ,收 集 滤 液 ,测 量 果 汁 量 (如 图 C)。 在 不 同 温 度 条 件 下 重 复 以 上 实 验 步 骤 ,并 记 录 果 汁 量 ,结 果 如 下 表根 据 上 述 实 验 ， 请 分 析 回 答 下 列 问 题 ：(1)果 胶 酶 能 破 除 细 胞 壁 ， 因 为 果 胶 酶 可 促 进 细 胞 壁 中 _的 水 解 。(2)实 验 结 果 表 明 ， 当 温 度 为 _时 果 汁 量 最 多 ， 此 时 果 胶 酶 的活 性 _。 当 温 度 再 升 高 时 ， 果 汁 量 降 低 ， 说 明 _。(3)实 验 步 骤 的 目 的 是 ： _。温 度 / 10 20 30 40 50 60 70 80出 汁 量 /ml 8 13 15 25 15 12 11 10果 胶40最 高 温 度 升 高 ， 降 低 了 酶 的 活 性使 得 酶 与 果 泥 处 于 同 一 温 度 条 件 下 三 、 固 定 化 酶 和 固 定 化 细 胞 的 比 较原 因 ： 细 胞 个 大 ， 酶 分 子 很 小 个 体 大 的 细 胞 难 以 被 吸 附 或 结 合 ， 而个 小 的 酶 容 易 从 包 埋 的 材 料 中 漏 出 实 验 ： 酵 母 细 胞 的 固 定 化(1)酵 母 细 胞 的 活 化 干 酵 母 +蒸 馏 水 摇 匀 ， 放 置 1h(2)配 置 0.05mol/L的 CaCl2溶 液 （ 用 于 使 海 藻 酸 钠 形 成 凝 胶 珠 ）(3)配 制 海 藻 酸 钠 溶 液用 酒 精 灯 小 火 或 者 间 断 加 热 加 热 ， 边 加 热 边 搅 拌 ，反 复 几 次 ， 直 至 完 全 溶 化(4)海 藻 酸 钠 溶 液 和 酵 母 细 胞 混 合将 溶 化 好 的 海 藻 酸 钠 溶 液 冷 却 至 室 温 ， 再 加 入 以 活 化的 酵 母 细 胞 ， 进 行 充 分 搅 拌(5)固 定 化 酵 母 细 胞（ 二 ） 用 固 定 化 酵 母 细 胞 发 酵（ 一 ） 制 备 固 定 化 酵 母 细 胞 葡 萄 糖 溶 液 +固 定 好 的 酵 母 细 胞 ， 置 于 25 下 发 酵 24h， 观 察 。 例 （ 2010江 苏 ） 图 1表 示 制 备 固 定 化 酵 母 细 胞 的 有 关操 作 ， 图 2是 利 用 固 定 化 酵 母 细 胞 进 行 酒 精 发 酵 的 示意 图 下 列 叙 述 正 确 的 是 （ 双 选 ）A 刚 溶 化 的 海 藻 酸 钠 应 迅 速 与 活 化 的 酵 母 菌 混 合 制备 混 合 液B 图 1中 X溶 液 为 CaCl2溶 液 ， 其 作 用 是 使 海 藻 酸 钠 形成 凝 胶 珠C 图 2发 酵 过 程 中 搅 拌的 目 的 是 为 了 使 培 养 液与 酵 母 菌 充 分 接 触D 图 1中 制 备 的 凝 胶 珠可 以 直 接 转 移 到 图 2装 置中 BC 1、 血 红 蛋 白 的 提 取(1)凝 胶 色 谱 法 ：(2)电 泳 ：(3)步 骤 ： 样 品 处 理 粗 分 离 纯 化 纯 度 鉴 定根 据 相 对 分 子 质 量 的 大 小 来 分 离 蛋 白 质 的 有 效 方法 ， 也 称 做 分 配 色 谱 法 。 利 用 了 待 分 离 样 品 中 各 种 分 子 带 电 性 质 的差 异 以 及 分 子 本 身 的 大 小 ， 形 状 的 不 同 ， 使 带电 分 子 产 生 不 同 的 迁 移 速 度 ， 从 而 实 现 样 品 中各 种 分 子 的 分 离 。考 向 4 生 物 技 术 在 其 他 方 面 的 应 用 单 基 因 遗 传 病 可 以 通 过 核 酸 杂 交 技 术 进 行 早 期 诊 断 。 镰 刀 型 细胞 贫 血 症 是 一 种 在 地 中 海 地 区 发 病 率 较 高 的 单 基 因 遗 传 病 。 已知 红 细 胞 正 常 个 体 的 基 因 型 为 BB、 Bb， 镰 刀 型 细 胞 贫 血 症 患 者的 基 因 型 为 bb。 有 一 对 夫 妇 被 检 测 出 均 为 该 致 病 基 因 的 携 带 者 ，为 了 能 生 下 健 康 的 孩 子 ， 每 次 妊 娠 早 期 都 进 行 产 前 诊 断 。 下 图为 其 产 前 核 酸 分 子 杂 交 诊 断 和 结 果 示 意 图 。 bB A 该 致 病 基 因 在 常 染 色 体 上 B 1的 致 病 基 因 来 自 于 1， 和 2 C 3与 1、 2的 基 因 型 均 相 同 D 4号 为 纯 合 子 的 概 率 是 1 3一 对 等 位 基 因 经 某 种 限 制 性 核 酸 内 切 酶 切 割 后 形 成 的 DNA片 段 长 度 存 在 差 异 ， 用 凝 胶 电 泳 的 方 法 分 离 酶 切 后 的 DNA片 段 ， 并 与 探 针 杂 交 后 可 显 示 出 不 同 的 带 谱 。 根 据 电 泳 所得 到 的 不 同 带 谱 ， 可 将 这 些 DNA片 段 定 位 在 基 因 组 的 某 一位 置 上 。 现 有 一 对 夫 妇 生 了 四 个 孩 子 ， 其 中 4号 个 体 患病 。 该 家 庭 成 员 的 基 因 经 上 述 处 理 后 得 到 的 带 谱 如 右 图 所示 。 据 图 分 析 ， 错 误 的 是D 【 2011广 东 5】 .以 下 关 于 猪 血 红 蛋 白 提 纯 的描 述 ， 不 正 确 的 是A.洗 涤 红 细 胞 时 ， 使 用 生 理 盐 水 可 防 止 红 细胞 破 裂B.猪 成 熟 红 细 胞 中 缺 少 细 胞 器 和 细 胞 核 ， 提纯 时 杂 蛋 白 较 少C.血 红 蛋 白 的 颜 色 可 用 于 凝 胶 色 谱 法 分 离 过程 的 监 测D.在 凝 胶 色 谱 法 分 离 过 程 中 ， 血 红 蛋 白 比 分子 量 较 小 的 杂 蛋 白 移 动 慢D (1)细 胞 内 复 制 DNA的 条 件模 板 ： DNA两 条 母 链原 料 ： 4种 脱 氧 核 苷 酸酶 ： 解 旋 酶 、 DNA聚 合 酶能 量 ： ATP (2)PCR的 反 应 条 件一 定 的 缓 冲 溶 液 -维 持 pH；DNA模 板 (或 目 的 基 因 )；分 别 与 两 条 模 板 链 相 结 合 的两 种 引 物 ；四 种 脱 氧 核 苷 酸 ；耐 热 的 DNA聚 合 酶 ；还 需 要 控 制 温 度2、 生 物 体 内 DNA复 制 与 PCR反 应 的 区 别 3、 植 物 有 效 成 分 的 提 取 方 法 总 结比 较 项 目 实 验 原 理 方 法 步 骤 适 用 范 围水 蒸 气蒸 馏 法萃 取 法压 榨 法 利 用 水 蒸 气 将 挥发 性 较 强 的 植 物芳 香 油 携 带 出 来使 芳 香 油 溶 解 在有 机 溶 剂 中 ， 蒸发 后 得 到 芳 香 油通 过 机 械 加 压 ，压 榨 出 果 皮 中的 芳 香 油 水 蒸 汽 蒸 馏 分 离 油 层 除 水 过 滤 粉 碎 、 干 燥 萃 取 、 过 滤 浓 缩 石 灰 水 浸 泡 、漂 洗 压 榨 过 滤 静 置 再 次 过 滤 适 用 提 取 玫 瑰 精油 、 薄 荷 油 等 挥发 性 强 的 芳 香 油适 用 范 围 广 ， 原料 颗 粒 尽 可 能 细小 ， 能 充 分 浸 泡在 有 机 溶 剂 中适 用 于 柑 橘 、柠 檬 等 易 焦 糊原 料 的 提 取 例 、 （ 09江 苏 卷 ） 下 列 关 于 DNA和 蛋 白 质 提 取 与 分 离 实验 的 叙 述 ， 正 确 的 有 （ 双 选 ） A.提 取 细 胞 中 的 DNA和 蛋 白 质 都 需 用 蒸 馏 水 涨 破 细 胞 B.用 不 同 浓 度 NaCl溶 液 反 复 溶 解 与 析 出 DNA可 去 除 蛋白 质 C.蛋 白 质 提 取 和 分 离 过 程 中 进 行 透 析 可 去 除 溶 液 中的 DNA D.蛋 白 质 和 DNA都 可 以 用 电 泳 的 方 法 进 行 分 离 纯 化 BD 解 析 ： C中 透 析 用 以 除 去 小 分 子 物 质 ， DNA是 大 分 子 物 质 ， D是 常 规 方 法 比 如 用 十 二 烷 基 磺 酸 钠 ， 可 以 根 据 其 分 子大 小 及 所 带 电 荷 性 质 进 行 分 离 纯 化 D项 考 查 凝 胶 色 谱 法 分 离 蛋 白 质 的 原 理 ， 相 对 分 子 质量 越 大 的 通 过 凝 胶 色 谱 柱 的 速 度 越 快 ， 故 D错 误 。A正 确 ， 洗 涤 的 目 的 是 去 除 杂 蛋 白 以 利 于 后 续 步 骤 的分 离 纯 化 ， 加 入 的 是 生 理 盐 水 ， 缓 慢 搅 拌 10min， 低速 短 时 间 离 心 ， 重 复 洗 涤 三 次 ， 直 至 上 清 液 不 再 呈 现黄 色 ， 表 明 红 细 胞 已 洗 涤 干 净 。 B正 确 ， 哺 乳 动 物 成熟 的 红 细 胞 没 有 细 胞 核 与 众 多 的 细 胞 器 ， 提 纯 时 杂 蛋白 较 少 。 C正 确 ， 血 红 蛋 白 是 有 色 蛋 白 ， 因 此 在 凝 胶色 谱 分 离 时 可 以 通 过 观 察 颜 色 来 判 断 什 么 时 候 应 该 收集 洗 脱 液 （ 如 果 操 作 都 正 确 ， 能 清 楚 的 看 到 血 红 蛋 白的 红 色 区 带 均 匀 、 狭 窄 、 平 整 ， 随 着 洗 脱 液 缓 慢 流出 ） 。 这 使 得 血 红 蛋 白 的 分 离 过 程 非 常 直 观 ， 简 化 了操 作 。 例 、 （ 2010安 徽 ） 草 莓 生 产 上 传 统 的 繁 殖 方 式 易 将 所 感 染 的 病毒 传 播 给 后 代 ， 导 致 产 量 降 低 。 品 质 变 差 。 运 用 微 型 繁 殖 技 术可 以 培 育 出 无 病 毒 幼 苗 。 草 莓 微 型 繁 殖 的 基 本 过 程 如 下 ： 外 植 体 愈 伤 组 织 芽 、 根 植 株请 回 答 ：（ 1） 微 型 繁 殖 培 育 无 病 毒 草 莓 苗 时 ， 一 般 选 取 _作 为 外 植 体 ， 其 依 据 是 _ _。（ 2） 在 过 程 中 ， 常 用 的 MS培 养 基 主 要 成 分 包 括 大 量元 素 、 微 量 元 素 和 _， 在 配 制 好 的 培 养 基 中 ， 常常 需 要 添 加 _， 有 利 于 外 植 体 启 动 细 胞 分 裂 形成 愈 伤 组 织 。 接 种 后 2-5d， 若 发 现 外 植 体 边 缘 局 部 污染 ， 原 因 可 能 是 _。（ 3） 在 过 程 中 ， 愈 伤 组 织 在 诱 导 生 根 的 培 养 基 中 未形 成 根 ， 但 分 化 出 了 芽 ， 其 原 因 可 能 是 _。 培 养 基 中 生 长 素 类 与 细 胞 分 裂 素 类 的 物 质 用 量 的 比 值 偏 低茎 尖茎 尖 病 毒 极 少 ， 甚 至 无 病 毒有 机 物植 物 激 素外 植 体 消 毒 不 彻 底 例 、 （ 09广 东 卷 第 38题 ） 材 料 ： 饲 料 原 料 中 的 磷 元 素 有 相 当一 部 分 存 在 于 植 酸 中 ， 猪 、 禽 等 动 物 由 于 缺 乏 有 关 酶 ， 无 法 有效 利 用 植 酸 ， 造 成 磷 源 浪 费 ， 而 且 植 酸 随 粪 便 排 除 后 易 造 成 环境 有 机 磷 污 染 。 植 酸 酶 能 催 化 植 酸 水 解 成 肌 醇 和 磷 酸 ， 因 此 成为 目 前 重 要 的 饲 料 添 加 剂 之 一 。 （ 1） 商 品 化 植 酸 酶 主 要 来 自 微 生 物 。 在 产 酶 菌 株 筛 选 过 程中 ， 常 在 基 本 培 养 基 中 添 加 不 溶 于 水 的 植 酸 钙 制 成 固 体 平 板 ，植 酸 钙 被 植 酸 酶 分 解 后 可 在 平 板 上 产 生 ， 可 根 据 其大 小 选 择 目 的 菌 株 ， 所 得 菌 株 需 要 进 一 步 测 定 植 酸 酶 活 性 。 活性 测 定 可 以 植 酸 钠 作 为 底 物 ， 活 性 可 用 一 定 条 件 下 单 位 时间 表 示 。（ 2） 利 用 上 述 所 得 菌 株 制 备 植 酸 酶 的 流 程 如 下 图 ：透 明 圈植 酸 钠 的 消 耗 量 （ 肌 醇 和 磷 酸 的 生 成 量 ） 中 的 主 要 成 分 为 ； 中 包 含 多 种 酸 酶 等 多种 蛋 白 质 。 请 写 出 一 种 纯 化 得 到 植 酸 酶 的 方 法 及 其 依 据 ：（ 3） 为 建 设 基 因 工 程 菌 ， 可 用 PCR等 技 术 从 上 述 菌 株 中 克 隆 植酸 酶 基 因 。 PCR反 应 包 含 多 次 循 环 ， 每 次 循 环 包 括 三步 ： 。 反 应 过 程 中 打 开 模 板 DNA双链 的 方 法 是 。（ 4） 除 植 酸 酶 外 ， 微 生 物 还 应 用 在 的生 产 中 。（ 2） 利 用 上 述 所 得 菌 株 制 备 植 酸 酶 的 流 程 如 下 图 ：凝 胶 色 谱 法 ： 根 据 蛋 白 质 之 间 分 子 大 小 ， 吸 附 性 质 等 差异 进 行 纯 化 。 （ 或 电 泳 法 ： 根 据 蛋 白 质 之 间 电 荷 ， 分 子大 小 等 差 异 进 行 纯 化 。 ）小 分 子 杂 质变 性 、 复 性 和 延 伸加 热 蛋 白 酶 ， 脂 肪 酶 ，纤 维 素 酶