《生物化学检测技术》PPT课件.ppt

生 物 检 测 技 术韶 关 学 院 生 命 科 学 学 院易 道 生Office： 英 东 楼 B-301Mp： 13927862492,662492Email： 内 容主 要 由 六 个 模 块 构 成 ：生 物 化 学 检 测 技 术免 疫 学 检 测 技 术细 胞 学 检 测 技 术分 子 生 物 学 检 测 技 术微 生 物 学 检 测 技 术生 物 检 测 仪 器 第 一 章 生 物 化 学 检 测 技 术 内 容第 一 节 电 泳 技 术第 二 节 光 谱 分 析 技 术第 三 节 生 物 大 分 子 含 量 测 定第 四 节 色 谱 分 析 技 术第 五 节 干 化 学 分 析 技 术 目 标掌 握 琼 脂 糖 电 泳 、 SDS-聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 的原 理 和 操 作 要 点 。掌 握 可 见 光 和 紫 外 光 的 分 光 光 度 技 术 的 原 理 和方 法 。理 解 各 种 蛋 白 质 含 量 测 定 技 术 的 原 理 和 优 缺 点 。理 解 各 种 核 酸 含 量 测 定 技 术 的 原 理 和 优 缺 点 。 第 一 节 电 泳 检 测 技 术电 泳 ： 1937年 瑞 典 科 学 家 Tiselius建 立 了 “ 移 界 电 泳 法 ” ， 成 功 地 分 离 血 清蛋 白 质 各 成 分 。 50年 代 ， 改 进 电 泳 仪 ， 寻 找 合 适 的 电 泳 支 持 介 质 ， 先 后 找 到 滤 纸 、 醋酸 纤 维 素 薄 膜 、 淀 粉 及 琼 脂 作 为 支 持 物 。 60年 代 ， 找 到 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 作 为 电 泳 支 持 物 ， 在 此 基 础 上 发 展 了SDS-聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 、 等 电 聚 焦 电 泳 、 双 向 电 泳 和 印 迹 转 移 电 泳等 技 术 。 这 些 技 术 具 有 设 备 简 单 ， 操 作 方 便 ， 分 辨 率 高 等 优 点 。 目 前 ， 电 泳 技 术 已 成 为 生 物 化 学 与 分 子 生 物 学 以 及 与 其 密 切 相 关 学 科分 析 中 必 不 可 少 的 手 段 。 电 泳 槽 和 大 分 子 分 离 结 果 淀粉凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 凝胶支持物区带电泳 纸电泳醋酸纤维薄膜电泳薄层电泳 非凝胶支持物电泳 用支持物区带电泳 显微电泳 等电聚焦电泳 等速电泳 不用支持物电泳 是否用支持物 从 实 际 和 实 用 出 发 的 分 类根 据 分 离 样 品 样 品 的 数 量 和 目 的 分 制 备 和 分 析 电 泳根 据 结 合 配 套 的 技 术 分 免 疫 、 层 析 、 等 电 聚 焦 、 转 移 、 双向 、 脉 冲 梯 度 电 场 、 垂 直 交 替 凝 胶 电 泳 等根 据 使 用 电 压 分 常 压 （ 500） 和 高 压 电 泳 。根 据 电 泳 系 统 pH连 续 与 否 分 连 续 和 不 连 续 pH电 泳根 据 介 质 使 用 与 否 分 自 由 和 区 带 电 泳 （ 滤 纸 、 薄 层 、 凝 胶电 泳 ）根 据 电 泳 槽 的 形 式 分 有 垂 直 的 、 水 平 的 、 柱 状 的 、 板 状的 、 毛 细 管 的 、 湿 小 室 及 幕 状 的 。毛 细 管 电 泳 是 20世 纪 80年 代 研 制 出 的 一 种 新 型 的 区 带电 泳 方 法 ， 具 有 分 辨 率 好 、 灵 敏 度 高 、 检 测 快 捷 等 特点 。 自 由 电 泳 可 分 为 ： 显 微 电 泳 （ 也 称 细 胞 电 泳 ） ， 是 在显 微 镜 下 观 察 细 胞 或 细 菌 的 电 泳 行 为 ； 移 界 电 泳 ； 柱电 泳 ； 自 由 流 动 幕 电 泳 ； 等 速 电 泳 等 。 支 持 物 电 泳 根 据 支 持 物 的 特 点 又 可 分 为 ： 纸 电 泳 薄 层 电 泳 醋 酸 纤 维 素 薄 膜 电 泳 非 凝 胶 性 支 持 物 区 带 电 泳 (支 持 物 有 ： 淀 粉 、 纤 维 素 粉 、 玻 璃 粉 、 硅 胶 等 ) 凝 胶 区 带 电 泳 ： 淀 粉 凝 胶 电 泳 、 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 、 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 。 2021-4-22 南 京 农 业 大 学 生 命 科 学 学 院11 2021-4-22 南 京 农 业 大 学 生 命 科 学 学 院12 电 泳 基 本 原 理 电 泳 是 不 同 的 物 质 颗 粒 在 一 定 的 电 场 强 度 下 ， 由 于 所 带电 荷 及 颗 粒 大 小 形 状 等 不 同 ， 因 此 向 相 反 电 极 泳 动 速 度不 同 进 而 达 到 分 离 目 的 一 种 方 法 。 在 一 定 pH条 件 下 ， 每 一 种 分 子 都 具 有 特 定 的 电 荷 （ 种类 和 数 量 ） 、 大 小 和 形 状 ， 在 一 定 时 间 内 它 们 在 相 同 电场 中 泳 动 速 度 不 同 ， 各 自 集 中 到 特 定 的 位 置 上 而 形 成 紧密 的 泳 动 带 。 这 就 是 带 电 粒 子 可 以 用 电 泳 技 术 进 行 分 离 、分 析 和 鉴 定 的 基 本 原 理 。 带 电 颗 粒 在 电 场 中 泳 动 的 速 度 称 迁 移 率 或 泳 动 度 。 电 泳 时 ， 带 电 颗 粒 （ 球 形 ） 在 介 质 中 受 力 平 衡 匀 速 运 动 ，则 有 ： v = F阻 /f = FE/f = Eq/f = Eq/(6r) v 泳 动 度 F阻 颗 粒 所 受 阻 力 FE 颗 粒 所 受 电 场 力 f 摩 擦 系 数 由 上 式 可 见 ： 泳 动 度 与 球 形 分 子 半 径 、 介 质 粘 度 、 颗 粒 所带 电 荷 以 及 电 场 强 度 有 关 。 非 球 形 分 子 （ 如 线 状 DNA） 在 电 泳 过 程 中 受 到 更 大 的 阻 力 ， 即 粒 子 的 泳 动 度 与 粒 子 形 状 有 关 。n E 电 场 强 度n q 颗 粒 所 带 电 荷n r 颗 粒 半 径n 介 质 黏 度 相 对 迁 移 率 （ Rf） ： 分 离 区 带 的 泳 动 速 度 可 用 相 对 迁 移 率 来 表 示 。 测 定 迁 移 率 时 ， 在 电 泳 结 束 后 要 先 在 指 示 剂 移 动 的 位 置（ 前 沿 ） 作 一 标 记 （ 通 常 是 插 一 根 短 铜 丝 ） ， 染 色 后 ，量 出 指 示 剂 移 动 的 距 离 和 酶 带 移 动 的 距 离 。Rf 谱 带 迁 移 距 离 / 前 沿 指 示 剂 迁 移 距 离测 量 迁 移 率 时 ， 应 以 谱 带 的 中 部 位 置 为 准 ， 值 得 注 意 的 是 ，交 联 剂 的 浓 度 ， 交 联 剂 和 丙 烯 酰 胺 的 比 例 ， 催 化 剂 浓 度 及 聚胶 时 的 温 度 和 时 间 均 对 凝 胶 柱 结 构 有 影 响 ， 因 而 会 影 响 迁 移率 。 另 外 ， 电 泳 时 电 场 强 度 等 也 会 影 响 带 电 颗 粒 迁 移 速 度 。 为 了使 试 验 重 复 性 好 ， 这 些 因 子 都 应 尽 可 能 保 持 恒 定 。 一 、 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳1、 原 理 ： 琼 脂 糖 是 一 种 天 然 聚 合 长 链 状 分 子 ， 可 以 形 成具 有 刚 性 的 滤 孔 ， 凝 胶 孔 径 的 大 小 决 定 于 琼 脂 糖 的 浓 度 。琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 法 分 离 DNA， 主 要 是 利 用 分 子 筛 效 应 ，迁 移 速 度 与 分 子 量 的 对 数 值 成 反 比 关 系 。 因 而 就 可 依 据DNA分 子 的 大 小 使 其 分 离 。 该 过 程 可 以 通 过 把 分 子 量 标准 参 照 物 和 样 品 一 起 进 行 电 泳 而 得 到 检 测 。DNA分 子 在 碱 性 缓 冲 液 中 带 负 电 荷 ， 在 外 加 电 场 作 用 下向 正 极 泳 动 。DNA分 子 在 琼 脂 糖 凝 胶 中 泳 动 时 ， 有 电 荷 效 应 与 分 子 筛 效应 。 不 同 DNA的 分 子 量 大 小 及 构 型 不 同 ， 电 泳 时 的 泳 动率 就 不 同 ， 从 而 分 出 不 同 的 区 带 。 以 对 于 分 子 量 大 的 样 品 ， 如 大 分 子 核 酸 ， 病 毒 等 ， 一 般 采用 孔 径 较 大 的 琼 脂 糖 凝 胶 进 行 电 泳 分 离 。琼 脂 糖 凝 胶 的 特 点 ： 天 然 琼 脂 是 一 种 多 聚 糖 ， 主 要 由 琼 脂 糖 (约 占 80%)及 琼 脂 胶 组 成 。 琼 脂 糖 是 由 半 乳 糖 及 其 衍 生 物 构 成 的 中 性 物 质 ， 不 带 电 荷 。 琼 脂 糖是 直 链 多 糖 ， 它 由 D-半 乳 糖 和 3,6-脱 水 -L-半 乳 糖 的 残 基 交 替 排 列 织成 。 2、 操 作 方 法试 剂 与 设 备上 样 buffer 0.25%溴 酚 蓝 ， 0.25%二 甲 苯 青 ， 40%蔗 糖 水 溶 液 0.25%溴 酚 蓝 ， 0.25%二 甲 苯 青 ， 30%甘 油 水 溶 液以 上 溶 液 4 保 存 备 用 。 制 胶 ：称 干 粉 ， 融 化 ， 倒 胶 ， 插 梳 子 ， 凝 固 ， 装 电 泳 槽 。 3、 步 骤 1g 琼 脂 糖 加 入 100ml 1 TAE电 泳 缓 冲 液 中 ， 摇 匀 。 在微 波 炉 中 加 热 至 琼 脂 糖 完 全 溶 解 。 （ 冷 却 到 60 ， 加 入100l的 0.5mg/ml EB， 并 摇 匀 。 ） 用 胶 带 将 制 胶 板 两 端 封 好 ， 插 入 适 当 梳 子 ， 将 溶 解 的琼 脂 糖 （ 约 50 ） 倒 入 ， 室 温 冷 却 凝 固 。 充 分 凝 固 后 撕 掉 两 端 的 胶 布 ， 将 凝 胶 置 入 电 泳 槽 中 ，加 1 TAE电 泳 缓 冲 液 至 液 面 覆 盖 凝 胶 1-2mm， 小 心 垂直 向 上 拔 出 梳 子 。 用 移 液 器 吸 取 总 DNA或 质 粒 样 品 4l于 封 口 膜 上 ， 再 加入 2l 的 6X载 样 缓 冲 液 ， 混 匀 后 ， 小 心 加 入 点 样 孔 。 打 开 电 源 开 关 ， 调 节 电 压 至 3-5V/cm， 可 见 到 溴 酚 蓝 条带 由 负 极 向 正 极 移 动 ， 电 泳 约 30min-60min。 将 凝 胶 放 入 EB染 液 中 染 色 5-10min,用 清 水 稍微 漂 洗 。 将 染 色 后 的 凝 胶 置 于 紫 外 透 射 检 测 仪 上 ， 盖上 防 护 观 察 罩 ， 打 开 紫 外 灯 ， 可 见 到 发 出 荧 光的 DNA条 带 。 目 前 多 用 琼 脂 糖 为 电 泳 支 持 物 进 行 平 板 电 泳 ， 琼 脂 糖是 经 过 挑 选 ， 以 质 地 较 纯 的 琼 脂 作 为 原 料 而 制 成 的 。 优 点 如 下 ：琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 操 作 简 单 ， 电 泳 速 度 快 ， 样 品 不 需 事 先 处 理就 可 进 行 电 泳 。 琼 脂 糖 凝 胶 结 构 均 匀 ， 含 水 量 大 (约 占 98-99%)， 近 似 自 由电 泳 ， 样 品 扩 散 度 较 自 由 电 泳 小 ， 对 样 品 吸 附 极 微 ， 因 此 电泳 图 谱 清 晰 ， 分 辨 率 高 ， 重 复 性 好 。 琼 脂 糖 透 明 无 紫 外 吸 收 ， 电 泳 过 程 和 结 果 可 直 接 用 紫 外 光 灯监 测 及 定 量 测 定 。 电 泳 后 区 带 易 染 色 ， 样 品 易 洗 脱 ， 便 于 定 量 测 定 。 制 成 干 膜 可 长期 保 存 。 目 前 ， 常 用 琼 脂 糖 作 为 电 泳 支 持 物 ， 分 离 蛋 白 质 和同 工 酶 。 将 琼 脂 糖 电 泳 与 免 疫 化 学 相 结 合 ， 发 展 成免 疫 电 泳 技 术 ， 能 鉴 别 其 他 方 法 不 能 鉴 别 的 复 杂 体系 ， 由 于 建 立 了 超 微 量 技 术 ， 0.1g蛋 白 质 就 可 检 出 。 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 也 常 用 于 分 离 、 鉴 定 核 酸 ， 如 DNA鉴 定 ， DNA限 制 性 内 切 酶 图 谱 制 作 等 。 由 于 这 种 方法 操 作 方 便 ， 设 备 简 单 ， 需 样 品 量 少 ， 分 辨 能 力 高 ，已 成 为 基 因 工 程 研 究 中 常 用 实 验 方 法 之 一 。 琼 脂 糖 浓度 (%) 线 型 DNA分 子 的大 小 (Kb)0.3 5 600.6 1 200.7 0.8 100.9 0.5 71.2 0.9 61.5 0.2 32.0 0.1 2 2021-4-22 韶 关 大 学 生 命 科 学 学 院25 PCR产 物 的 琼 脂 糖 电 泳 2021-4-22 26 100 200 300 1,650 1,000 500 850 650 400 5,000 bp 2,000DNA ladderDNA ladderPCR 产 物 1 2 3 4 5 6 7 8胶 孔 + - - + - + + -引 物 二 聚 体 2021-4-22 南 京 农 业 大 学 生 命 科 学 学 院27 4、 影 响 因 素1） 琼 脂 糖 来 源 ， 纯 度 。 酸 根 取 代 导 致 Agarose带 电 。 对 支 持 物 的 一 般 要 求 是 均 匀 ， 吸 附 力 和 电 渗 小 ， 机 械 性 能 好 ，便 于 染 色 或 紫 外 光 下 检 测 ， 故 最 好 透 明 ， 无 紫 外 吸 收 。 常 用 的支 持 物 有 滤 纸 ， 醋 酸 纤 维 素 薄 膜 ， 淀 粉 凝 胶 ， 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 ，琼 脂 糖 凝 胶 等 。 支 持 物 性 质 不 同 也 会 影 响 泳 动 速 率 ， 如 琼 脂 于聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 都 有 大 小 不 同 的 筛 孔 ， 在 筛 孔 大 的 凝 胶 中 溶 质颗 粒 的 泳 动 速 率 快 ， 反 之 则 慢 。2） 胶 浓 度 3） 电 场 强 度 ： 电 场 强 度 是 指 每 厘 米 的 电 位 降 ， 也 称 电 位 梯 度 (电 势 梯度 )。 电 场 强 度 越 高 ， 则 带 电 颗 粒 泳 动 越 快 。 根 据 电 场强 度 的 不 同 ， 电 泳 可 分 为 ：常 压 (100-500V)电 泳 。 其 电 场 强 度 为 2-10V/cm。 分 离 时间 较 长 ， 从 数 小 时 到 数 十 小 时 ， 适 合 于 分 离 蛋 白 质 等 大分 子 物 质 。高 压 (2000-10000V)电 泳 。 其 电 场 强 度 为 50-200V/cm，电 泳 时 间 很 短 ， 有 时 只 需 几 分 钟 。 多 用 于 分 离 氨 基 酸 、多 肽 、 核 苷 酸 、 糖 类 等 小 分 子 物 质 。 4） 溶 液 pH 为 使 电 泳 时 pH值 恒 定 ， 必 须 采 用 缓 冲 液 作 为 电 极 液 ， 溶 液的 pH值 决 定 带 电 颗 粒 的 解 离 程 度 ， 亦 即 决 定 其 所 带 电 荷 的多 少 。 对 蛋 白 质 而 言 ， 溶 液 pH值 离 等 电 点 越 远 ， 则 颗 粒 所 带 的 净电 荷 越 多 ， 泳 动 速 度 也 越 快 ； 反 之 ， 则 越 慢 。 因 此 分 离 某 种蛋 白 质 混 合 液 时 ， 应 选 择 合 适 的 pH使 欲 分 离 的 各 种 蛋 白 质所 带 的 电 荷 数 量 有 较 大 的 差 异 。 2021-4-22 南 京 农 业 大 学 生 命 科 学 学 院31 5） 溶 液 的 离 子 强 度 缓 冲 液 离 子 强 度 越 高 ， 则 颗 粒 的 电 动 电 势 越 小 ， 泳 动 度 也 越 小 。一 般 最 适 合 的 离 子 强 度 在 0.02-0.2之 间 。 溶 液 离 子 强 度 (ionic strength)的 计 算 公 式 如 下 ： I=1/2cz2 式 中 ， I为 离 子 强 度 ， c为 离 子 的 摩 尔 浓 度 (mol/L)， z为 离 子 价 数 ， 价 数 越 高 ， 则 离子 强 度 越 大 。 6） 电 渗 电 泳 缓 冲 液 相 对 于 固 体 支 持 物 的 移 动 称 电 渗 。 如 纸 电 泳 时 ， 滤 纸吸 附 OH -离 子 带 负 电 荷 ， 与 纸 接 触 的 缓 冲 液 带 正 电 荷 向 负 极 移 动 ，会 对 颗 粒 的 移 动 造 成 不 良 影 响 ， 故 电 泳 时 ， 电 渗 小 些 为 好 。 7） 温 度 电 泳 时 会 产 生 焦 耳 热 ， 使 介 质 粘 度 下 降 ， 分 子 运 动 加 快 ， 迁 移 率增 加 ， 同 时 温 度 过 高 会 使 样 品 中 的 生 物 大 分 子 变 性 失 活 ， 因 此 电泳 时 ， 要 控 制 电 压 或 电 流 ， 也 可 安 装 冷 却 散 热 装 置 。 8） 支 持 物 现 代 电 泳 多 在 固 体 支 持 物 上 进 行 ， 使 样 品 中 的 不 同 组 分 形 成 不 同的 区 带 ， 称 区 带 电 泳 。 电 泳 结 束 后 ， 支 持 物 可 以 方 便 地 进 行 染 色等 后 续 处 理 。 印 迹 转 移 电 泳 ： 生 物 化 学 与 分 子 生 物 学 的 研 究 工 作 经 常 需 要 对 电 泳 分 离后 的 DNA进 行 分 子 杂 交 ， 但 琼 脂 糖 不 适 合 于 进 行 杂 交操 作 1975年 ， Southern创 造 了 将 经 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 后 的DNA区 带 原 位 转 移 到 硝 酸 基 纤 维 素 膜 (NC膜 )上 ， 再 进行 杂 交 的 方 法 ， 被 称 为 Southern印 迹 法 。 随 后 出 现 RNA印 迹 （ 被 戏 称 为 Northern印 迹 ） ， 蛋 白质 印 记 （ Western印 迹 ） 等 。 交 变 脉 冲 电 场 凝 胶 电 泳 一 般 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 只 能 分 离 小 于 20kb的 DNA。 这 是 因为 在 琼 脂 糖 凝 胶 中 ， DNA分 子 的 有 效 直 径 超 过 凝 胶 孔 径 时 ，在 电 场 作 用 下 ， 迫 使 DNA变 形 挤 过 筛 孔 ， 而 沿 着 泳 动 方 向伸 直 ， 因 而 分 子 大 小 对 迁 移 率 影 响 不 大 。 如 此 时 改 变 电 场 方 向 ， 则 DNA分 子 必 须 改 变 其 构 象 ， 沿 新的 泳 动 方 向 伸 直 ， 而 转 向 时 间 与 DNA分 子 大 小 关 系 极 为 密切 。 1983年 ， Schwartz等 人 根 据 DNA分 子 弹 性 弛 豫 时 间 （ 外推 为 零 的 滞 留 时 间 ） 与 DNA分 子 大 小 有 关 的 特 性 ， 设 计 了脉 冲 电 场 梯 度 凝 胶 。 Carle等 改 进 了 电 泳 技 术 ， 并 发 现 周期 性 的 反 转 换 电 场 亦 能 使 大 分 子 DNA 通 过 电 泳 分 开 。 该 电 泳 系 统 是 由 一 个 水 平 式 电 泳 槽 和 两 组 独 立 ， 彼 此 垂直 的 电 极 组 成 ， 一 组 电 极 负 极 为 N， 正 极 为 S； 另 一 组 负极 为 W， 正 极 为 E 。 一 块 正 方 形 琼 脂 糖 凝 胶 板 呈 45 置于 中 央 ， 电 场 在 N-S和 W-E之 间 交 替 建 立 。 电 场 交 替 改 变 的 时 间 长 短 与 欲 分 离 的 DNA分 子 大 小 有 关 。电 泳 时 ， DNA分 子 处 在 连 续 间 隔 交 替 的 电 场 中 。 首 先 向S极 移 动 ， 然 后 改 向 E极 。 在 每 次 电 场 方 向 改 变 时 ， DNA分 子 就 要 有 一 定 的 时 间 松 弛 ， 改 变 形 状 和 迁 移 方 向 。 只有 当 DNA分 子 达 到 一 定 构 型 后 ， 才 能 继 续 前 进 。 DNA分子 净 移 动 方 向 与 加 样 线 垂 直 ， 使 样 品 中 各 组 分 沿 同 一 泳道 形 成 各 自 的 区 带 。 交 变 脉 冲 电 泳 可 有 效 分 离 数 百 万 bp的 大 分 子 DNA。 4.4. 交 变 脉 冲 电 场 凝 胶 电 泳 免 疫 电 泳 ： 免 疫 电 泳 是 以 琼 脂 （ 糖 ） 为 支 持 物 ， 在 免 疫 的 基 础 上 ，将 琼 脂 （ 糖 ） 区 带 电 泳 与 免 疫 扩 散 相 结 合 产 生 特 异 性 的沉 淀 线 、 弧 或 峰 。 此 技 术 的 特 点 ：样 品 用 量 极 少 ， 免 疫 识 别 具 有 专 一 性 ， 分 辨 率 高 。 在 琼 脂 糖 免 疫 双 扩 散 的 基 础 上 发 展 了 多 种 免 疫 电 泳 ， 如微 量 免 疫 电 泳 、 对 流 免 疫 电 泳 、 单 向 定 量 免 疫 电 泳 （ 火箭 电 泳 ） 、 放 射 免 疫 电 泳 及 双 向 定 量 免 疫 电 泳 等 。 上 述 各 种 电 泳 有 其 共 性 ， 但 又 有 不 同 的 操 作 方 法 及 原 理 ，详 见 后 续 章 节 。 二 、 RNA电 泳 检 测1、 原 理 与 过 程 RNA电 泳 基 本 同 DNA电 泳 一 样 。 但 应 明 确 一 点 的 是 ， 因 为 RNA分 子 对 RNA酶 的 作 用非 常 敏 感 ， 因 此 必 须 用 对 RNA酶 有 抑 制 作 用 DEPC水 来 配 置 所 有 溶 液 ， 所 有 与 RNA接 触 的 仪 器 和 装 置都 要 严 格 处 理 以 尽 量 减 少 RNA酶 对 样 品 的 降 解 。 另 外 ， 因 为 RNA分 子 有 二 、 三 级 结 构 可 以 影 响 其 电泳 结 果 ， 因 此 电 泳 时 应 在 变 性 剂 存 在 下 进 行 ， 常 用的 变 性 剂 为 甲 醛 和 戊 二 醛 。 2、 试 剂 设 备试 剂 :A. 5 X MOPS电 泳 缓 冲 液 ： 20.9g MOPS (0.1mol/L), pH7.0; 8.3ml 3mol/L NaAC(40mmol/L); 10.0ml 0.5mol/L EDTA (5mmol/L) pH8.0, 用 水 定 容 至1L. 以 上 药 品 和 水 均 需 用 DEPC处 理 。B. 10 x甲 醛 上 样 缓 冲 液 ： 1mmol/L EDTA, pH8.0; 0.25%溴 酚 蓝 ， 0.25%二 甲 苯 蓝 ， 50%甘 油 ).C. 37% 甲 醛 （ pH 大 于 4.0， 12.3mol/L） ; D. 甲 酰 胺 ; E. 10mg/ml溴 化 乙 锭 . F. 以 上 药 品 和 水 均 需 用 DEPC处 理 。 3、 步 骤A. 胶 的 制 备 ： 1.5g琼 脂 糖 加 115ml水 ， 加 热 融 化 。 冷 却 至 60时 加 30ml的 5 X MOPS电 泳 缓 冲 液 (终 浓 度 为 1X); 加 5ml甲 醛（ 琼 脂 糖 终 浓 度 为 1%） 。 制 胶 。B. 样 品 制 备 ： RNA (最 多 30ug) 5.5ul 5 X MOPS电 泳 缓 冲 液 2.0ul 甲 醛 3.5ul 甲 酰 胺 10ul 在 65 下 处 理 15min, 然 后 置 冰 上 。C. 加 样 品 前 ， 先 用 5v/cm电 压 电 泳 5分 钟 。D. 制 备 好 的 样 品 短 暂 离 心 后 加 10X上 样 缓 冲 液 2ul， 混 匀 。E. 上 样 。F. 在 1 X MOPS电 泳 缓 冲 液 中 电 泳 2-3小 时 。 在 电 泳 1-2小 时 后 ，可 混 合 正 负 极 缓 冲 液 ， 再 继 续 电 泳 。G. 染 色 ： 将 电 泳 好 的 胶 板 转 移 至 含 0.5ug/L溴 化 乙 锭 的 0.1mmol/L NH4AC溶 液 中 染 色 30-40min. （ 溴 化 乙 锭 也 可 以在 电 泳 前 加 于 样 品 中 ） 4、 影 响 因 素1） Agarose 来 源 ， 纯 度 。2） 胶 浓 度 3） 以 乙 二 醛 DSMO做 变 性 系 统 时 ， 制 胶 时 不加 EB， 电 泳 后 浸 胶 入 EB溶 液 。 并 需 要 buffer循环 系 统 ， 避 免 形 成 过 高 的 pH梯 度 。4） 避 免 RNA因 RNase污 染 而 降 解 。 三 、 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 是 由 单 体 丙 烯 酰 胺 （ 简 称 Acr） 和 交 联剂 N， N-甲 叉 双 丙 烯 酰 胺 （ 简 称 Bis） 在 加 速 剂 和 催 化剂 的 作 用 下 聚 合 并 联 成 三 维 网 状 结 构 的 凝 胶 ， 以 此 凝 胶为 支 持 物 的 电 泳 称 为 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 （ 简 称PAGE） 。 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 有 下 列 优 点 ： 在 一 定 浓 度 时 ， 凝 胶 透 明 ， 有 弹 性 ， 机 械 性 能 好 。 化 学 性 能 稳 定 ， 与 被 分 离 物 不 发 生 化 学 反 应 。 对 pH和 温 度 变 化 较 稳 定 。 几 乎 无 电 渗 作 用 ， 只 要 Acr纯 度 高 ， 操 作 条 件 一 致 ， 则样 品 分 离 重 复 性 好 。 样 品 不 易 扩 散 ， 且 用 量 少 ， 其 灵 敏 度 可 达 10-6g。 凝 胶 孔 径 可 通 过 选 择 单 体 及 交 联 剂 的 浓 度 调 节 。 分 辨 率 高 ， 尤 其 在 不 连 续 凝 胶 电 泳 中 ， 集 浓 缩 、 分 子筛 和 电 荷 效 应 为 一 体 ， 因 而 较 醋 酸 纤 维 薄 膜 电 泳 、 琼脂 糖 电 泳 等 有 更 高 的 分 辨 率 。 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 于 琼 脂 糖 凝 胶 的 不 同 之 处 ： 分 离 范 围 不 同 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 分 离 分 子 量 比 较 大 的 物 质 ， 尤 其 是 核 酸 ； 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 分 离 分 子 量 较 小 的 物 质 ， 如 蛋 白 质 ， 氨 基 酸 等 。 凝 胶 配 置 程 序 不 同 琼 脂 糖 凝 胶 在 缓 冲 液 中 加 热 融 化 ， 在 凝 固 前 到 入 槽 中 即 可 ； 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 在 配 置 时 还 要 加 多 种 成 分 ， 并 且 对 聚 合 温 度 也 有一 定 的 要 求 ， 否 则 会 影 响 凝 胶 孔 径 的 大 小 。 凝 胶 的 厚 度 不 同 琼 脂 糖 凝 胶 最 薄 只 能 达 到 ； 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 可 以 制 成 . ， 分 辨 率 高 。 成 本 不 同 。 琼 脂 糖 价 格 便 宜 ； 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 价 格 较 高 安 全 性 不 同 。 琼 脂 糖 没 有 毒 性 ； 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 有 毒 性 PAGE应 用 范 围 广 ， 可 用 于 蛋 白 质 、 酶 、 核 酸 等 生物 分 子 的 分 离 、 定 性 、 定 量 及 少 量 的 制 备 ， 还 可测 定 相 对 分 子 质 量 、 等 电 点 等 。 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 又 有 以 下 几 种 ：非 变 性 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳变 性 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳连 续 密 度 梯 度 电 泳聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 等 电 聚 焦 电 泳聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 双 向 电 泳 1、 凝 胶 聚 合 的 原 理 及 有 关 特 性1.1. 聚 合 反 应 聚 丙 烯 酰 胺 是 由 丙 烯 酰 胺 （ Acr） 和 甲 叉 双 丙 烯 酰 胺 （ Bis）在 催 化 剂 作 用 下 合 成 的 。 催 化 系 统 常 用 有 两 种 ： 过 硫 酸 氨 TEMED化 学 催 化 聚 合 系 统 此 系 统 中 ， 四 甲 基 乙 二 胺 （ TEMED） 称 为 加 速 剂 ， 它 能 以 自 由基 的 形 式 存 在 。 微 量 的 TEMED的 加 入 ， 可 使 过 硫 酸 氨 （ APS，引 发 剂 ） 形 成 自 由 基 。 这 些 自 由 基 的 产 生 可 以 引 发 丙 烯 酰 胺 和 甲叉 双 丙 烯 酰 胺 的 交 联 反 应 ， 形 成 具 有 一 定 孔 径 的 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 。 核 黄 素 TEMED光 聚 合 催 化 系 统 此 系 统 中 ， 核 黄 素 经 紫 外 线 光 解 形 成 无 色 基 ， 再 被 痕 量 氧 氧 化 形成 自 由 基 ， 引 发 聚 合 反 应 。 TEMED的 存 在 ， 可 以 加 速 聚 合 ， 本催 化 系 统 主 要 用 用 于 大 孔 浓 缩 胶 的 配 置 。 2021-4-22 南 京 农 业 大 学 生 命 科 学 学 院49 1.2. 凝 胶 孔 径 的 可 调 性 及 其 有 关 性 质 A.凝 胶 性 能 与 总 浓 度 及 交 联 度 的 关 系 ： 凝 胶 的 孔 径 、 机 械 性能 、 弹 性 、 透 明 度 、 粘 度 和 聚 合 程 度 取 决 于 凝 胶 总 浓 度和 Acr与 Bis之 比 。 T Acr和 Bis总 浓 度 C 交 联 剂 百 分 比 V 缓 冲 液 体 积 (mL) a/b(W/W)与 凝 胶 的 机 械 性 能 密 切 相 关 。 当 a/b 10时 ， 凝胶 脆 而 易 碎 ， 坚 硬 呈 乳 白 色 ； a/b 100时 ， 即 使 5%的 凝胶 也 呈 糊 状 ， 易 于 断 裂 。 欲 制 备 完 全 透 明 而 又 有 弹 性 的凝 胶 ， 应 控 制 a/b=30左 右 。 n a Acr克 数n b Bis克 数 不 同 浓 度 的 单 体 对 凝 胶 性 能 影 响 很 大 。 Davis的 实 验 发 现Acr 2%， Bis 0.5%， 凝 胶 就 不 能 聚 合 。 当 增 加 Acr浓度 时 要 适 当 降 低 Bis的 浓 度 。 通 常 ， T为 2%-5%时 ， a/b=20左 右 ； T为 5%-10%时 ，a/b=40左 右 ； T为 15%-20%时 ， a/b=125-200左 右 ， 为 此Richard等 (1965)提 出 一 个 选 择 c和 T的 经 验 公 式 ；C = 6.50.3T 此 公 式 适 用 于 T为 5-20%范 围 内 的 c值 ， 其 值 可 有 1%的 变化 。 在 研 究 大 分 子 核 酸 时 ， 常 用 T= 2.4 %的 大 孔 凝 胶 ， 此 时凝 胶 太 软 ， 不 易 操 作 ， 可 加 入 0.5%琼 脂 糖 。 在 T=3%时 ，也 可 加 入 20%蔗 糖 以 增 加 机 械 性 能 ， 此 时 ， 并 不 影 响 凝胶 孔 径 的 大 小 。 凝 胶 浓 度 与 孔 径 的 关 系 ： T与 C不 仅 与 凝 胶 的 机 械 性 能 有 关 ， 还 与 凝 胶 的 孔 径 关 系 极 为密 切 。 一 般 讲 ， T浓 度 大 ， 孔 径 小 ， 移 动 颗 粒 穿 过 网 孔 阻 力 大 。此 外 ， 孔 径 还 同 Acr与 Bis的 比 例 有 关 ， Bis占 Acr总 浓 度 5%时 ，孔 径 最 小 。B.凝 胶 浓 度 与 被 分 离 物 相 对 分 子 量 质 的 关 系 ： 由 于 凝 胶 浓 度 不 同 ， 平 均 孔 径 不 同 ， 能 通 过 可 移 动 颗 粒 的 相 对分 子 质 量 也 不 同 。 在 操 作 时 ， 可 根 据 被 分 离 物 相 对 分 子 质 量 大 小 选 择 所 需 凝 胶 的浓 度 范 围 。 也 可 先 选 用 7.5%凝 胶 (标 准 胶 )， 因 为 生 物 体 内 大 多数 蛋 白 质 在 此 范 围 内 电 泳 均 可 取 得 较 满 意 的 结 果 。 如 分 析 未 知样 品 时 也 可 用 4%-10%的 梯 度 胶 测 试 ， 根 据 分 离 情 况 选 择 适 宜 的 浓 度 以 取 得 理 想 的 分 离 效 果 。 2021-4-22 韶 关 大 学 生 命 科 学 学 院53 1.3. 影 响 凝 胶 聚 合 的 因 素 A.Acr及 Bis的 纯 度 ： 应 选 用 分 析 纯 的 Acr及 Bis， 两 者 均 为 白色 结 晶 物 质 ， 280无 吸 收 。 如 试 剂 不 纯 ， 含 有 杂 质 或 丙烯 酸 时 ， 则 凝 胶 聚 合 不 均 一 ， 或 聚 合 时 间 延 长 甚 至 不 聚合 ， 因 而 需 进 一 步 纯 化 。 Acr及 Bis固 体 应 避 光 ， 贮 存 在 棕 色 瓶 中 ， 因 自 然 光 、 超 声 波 及 射 线 均 可 引 起 Acr自 身 聚 合 或 形 成 亚 胺 桥 而 交 联 ， 造 成 试 剂 失 效 。 Acr和 Bis贮 液 的 pH值 为 4.9-5.2， 当 pH值 的 改 变 大 于 0.4pH单 位 则不 能 使 用 ， 因 在 偏 酸 或 偏 碱 的 环 境 中 ， 它 们 可 不 断 水 解 放 出 丙烯 酸 和 NH 4+ 而 引 起 pH值 改 变 ， 从 而 影 响 凝 胶 聚 合 。 因 此 ， 配 制 的 Acr和 Bis贮 液 应 置 棕 色 瓶 中 ， 4 贮 存 ， 存 放 期 一般 不 超 过 1-2个 月 为 宜 。 AP、 核 黄 素 、 TEMED： 是 凝 胶 聚 合 不 可 缺 少 的 试 剂 ， AP应 在干 燥 、 避 光 的 条 件 下 保 存 ， 其 水 溶 液 应 置 棕 色 瓶 中 ， 4 冰 箱 贮存 ， 一 般 仅 能 存 放 一 周 。 TEMED（ 液 状 ） 应 密 闭 贮 于 4 冰 箱中 。 增 加 AP和 TEMED可 加 快 聚 合 速 率 ， 但 过 量 的 AP和TEMED会 引 起 电 泳 时 烧 胶 和 谱 带 变 形 。 应 选 择 合 适 的 配 方 使聚 合 在 40-60min内 完 成 。B.pH： 碱 性 条 件 下 聚 合 快 ， 但 碱 性 过 强 时 胶 硬 而 脆 ， 需 高 pH 时应 减 少 AP和 TEMED用 量 ， 制 酸 性 胶 可 加 AgNO3等 促 进 聚 合 。C.温 度 ： 温 度 高 聚 合 快 ， 但 高 浓 度 凝 胶 聚 合 时 易 产 生 小 气 泡 ， 低温 (5 )聚 合 凝 胶 会 变 得 脆 而 混 浊 ， 一 般 25-35 聚 合 较 好 。D.氧 分 子 ： 氧 分 子 阻 碍 凝 胶 聚 合 ， 故 不 含 SDS的 凝 胶 最 好 先 抽 真空 脱 气 ， 再 加 引 发 剂 。 2、 PAGE原 理 （ 非 变 性 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 ） PAGE电 泳 据 电 泳 装 置 不 同 分 为 垂 直 的 圆 盘 及 板 状 两种 。 前 者 凝 胶 是 在 玻 璃 管 中 聚 合 ， 样 品 分 离 区 带 染 色 后 呈 圆 盘 状 ， 因 而 称为 圆 盘 电 泳 ； 后 者 凝 胶 是 在 两 块 间 隔 几 毫 米 的 平 行 玻 璃 板 中 聚 合 ， 故 称 为 垂 直 板 状电 泳 。 两 者 电 泳 原 理 完 全 相 同 。 蛋 白 质 进 行 PAGE时 ， 常 用 垂 直 板 电 泳 。 垂 直 板 电 泳 的 优 越 性 有 ： 表 面 积 大 而 薄 ， 便 于 通 冷 却 水 以 降 低 热 效 应 ， 条 带 更 清 晰 。 在 同 一 块 胶 板 上 可 同 时 进 行 10个 以 上 样 品 的 电 泳 ， 便 于 在 同一 条 件 下 比 较 分 析 鉴 定 ， 还 可 用 于 印 迹 转 移 电 泳 及 放 射 自 显影 。 胶 板 制 作 方 便 ， 易 剥 离 ， 样 品 用 量 少 ， 分 辨 率 高 ， 不 仅 可 用于 分 析 ， 还 可 用 于 制 备 。 胶 板 薄 而 透 明 ， 电 泳 染 色 后 可 制 成 干 板 ， 便 于 长 期 保 存 与 扫描 。 可 进 行 双 向 电 泳 。 PAGE据 其 有 无 浓 缩 效 应 ， 分 为 连 续 系 统 与 不 连 续系 统 两 大 类 。连 续 系 统 电 泳 体 系 中 缓 冲 液 pH值 及 凝 胶 浓 度 相 同 ， 带 电颗 粒 在 电 场 作 用 下 ， 主 要 靠 电 荷 及 分 子 筛 效 应 ；不 连 续 系 统 电 泳 体 系 中 由 于 缓 冲 液 离 子 成 分 、 pH、 凝 胶浓 度 及 电 位 梯 度 的 不 连 续 性 ， 带 电 颗 粒 在 电 场 中 泳 动 不仅 有 电 荷 效 应 、 分 子 筛 效 应 ， 还 具 有 浓 缩 效 应 ， 故 分 离效 果 更 好 。 不 连 续 的 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 作 为 支 持 介 质 ， 利 用 凝 胶 层 的 不连 续 性 、 缓 冲 液 离 子 的 不 连 续 性 、 PH的 不 连 续 性 及 电 位 梯度 的 不 连 续 性 ， 使 样 品 在 不 连 续 的 两 相 间 积 聚 浓 缩 成 很 薄的 起 始 区 带 ， 然 后 进 行 分 离 。 根 据 缓 冲 液 的 PH值 的 高 低 ， 可 分 为 碱 性 系 统 、 酸 性 系 统 和中 性 系 统 。 不 连 续 体 系 由 电 极 缓 冲 液 、 样 品 胶 、 浓 缩 胶 及 分 离 胶 组成 ， 排 列 顺 序 依 次 为 上 层 样 品 胶 、 中 间 浓 缩 胶 、 下 层 分离 胶 。 样 品 胶 的 作 用 是 防 止 对 流 ， 促 使 样 品 浓 缩 以 免 被 电 极 缓 冲 溶 稀释 。 目 前 一 般 不 用 样 品 胶 ， 直 接 在 样 品 液 中 加 入 等 体 积 40%蔗糖 ， 同 样 具 有 防 止 对 流 及 样 品 被 稀 释 的 作 用 。 n 浓 缩 胶 是 样 品 胶 的 延 续 ， 凝 胶 浓 度 及 pH 值 与 样品 胶 完 全 相 同 ， 其 作 用 是 使 样 品 进 入 分 离 胶 前 ，被 浓 缩 成 窄 的 区 带 ， 从 而 提 高 分 离 效 果 。 n 分 离 胶 的 T=7.0%-7.5%， C=2.5%， 缓 冲 液 为pH 8.9的 Tris-H Cl， 大 部 分 蛋 白 质 在 此 pH 条 件 下带 负 电 荷 。 此 胶 主 要 起 分 子 筛 作 用 。 2.1. 样 品 浓 缩 效 应 凝 胶 孔 径 的 不 连 续 性 ： 上 述 3层 凝 胶 中 ， 样 品 胶 及 浓 缩 胶 为 大 孔 胶 ； 分 离 胶 为 小 孔 胶 。 在 电 场 作 用 下 ， 样 品 颗 粒 在 大 孔 胶 中 泳 动 的 阻 力 小 ， 移 动 速 度 快 ； 当进 入 小 孔 胶 时 ， 受 到 的 阻 力 大 ， 移 动 速 度 减 慢 。 因 而 在 两 层 凝 胶 交界 处 ， 样 品 迁 移 受 阻 而 压 缩 成 很 窄 的 区 带 。 电 位 梯 度 的 不 连 续 性 ： 电 泳 开 始 后 ， 快 离 子 的 快 速 移 动 会 在 其 后 形 成 一 个 离 子 强 度 很 低 的 低 电 导 区 ， 使 局 部 电 位 梯 度 增 高 ， 将 蛋 白 质 浓 缩 成 狭 窄 的 区 带 。 缓 冲 体 系 离 子 成 分 及 pH 值 的 不 连 续 性 ： 在 三 层 凝 胶 中 均 有 Tris及 HCl。 Tris的 作 用 是 维 持 溶 液 的 电 中 性 及pH值 ， 是 缓 冲 配 对 离 子 。 HCl在 任 何 pH溶 液 中 均 易 解 离 出 Cl ，在 电 场 中 迁 移 率 快 ， 走 在 最 前 面 称 为 快 离 子 。 电 极 缓 冲 液 中 ， 除 有 Tris 外 还 有 甘 氨 酸 ， 其 pI=6.0， 在 pH8.3的电 极 缓 冲 液 中 ， 易 解 离 出 甘 氨 酸 根 ， 而 在 pH6.7的 凝 胶 缓 冲 体 系中 ， 甘 氨 酸 解 离 度 仅 有 0.1%-1%， 因 而 在 电 场 中 迁 移 很 慢 ， 称 为慢 离 子 。 血 清 中 大 多 数 蛋 白 质 pI在 5.0左 右 ， 在 pH6.7或 8.3时 均 带 负 电 荷 向正 极 移 动 ， 迁 移 率 介 于 快 离 子 与 慢 离 子 之 间 ， 于 是 蛋 白 质 就 在快 、 慢 离 子 形 成 的 界 面 处 ， 被 浓 缩 成 为 极 窄 的 区 带 。 当 进 入pH8.9的 分 离 胶 时 ， 甘 氨 酸 解 离 度 增 加 ， 其 有 效 迁 移 率 超 过 蛋 白 质 ； 因 此 Cl 及 甘 氨 酸 根 沿 着 离 子 界 面 继 续 前 进 。 蛋 白 质 分 子 由于 相 对 分 子 质 量 大 ， 被 留 在 后 面 ， 逐 渐 分 成 多 个 区 带 。 2.2.分 子 筛 效 应大 小 和 形 状 不 同 的 蛋 白 质 通 过 一 定 孔 径 分 离 胶 时 ， 受 阻 滞 的程 度 不 同 而 表 现 出 不 同 的 迁 移 率 ， 这 就 是 分 子 筛 效 应 。 当 被 浓 缩 的 蛋 白 质 样 品 从 浓 缩 胶 进 入 分 离 胶 时 ， pH值 和 凝 胶孔 径 突 然 改 变 ， 分 离 胶 的 pH值 8.9接 近 甘 氨 酸 的 Pka值（ 9.7 9.8） ， 这 样 慢 离 子 的 解 离 度 增 大 ， 因 而 它 的 有 效 泳动 率 也 增 加 。 此 时 慢 离 子 的 有 效 泳 动 率 超 过 了 所 有 蛋 白 质 的有 效 泳 动 率 。 这 样 ， 高 电 势 梯 度 不 存 在 了 ， 各 种 蛋 白 质 仅 会由 于 其 分 子 量 或 构 型 的 不 同 ， 在 一 个 均 一 的 电 势 梯 度 和 pH条件 下 通 过 一 定 孔 径 的 分 离 胶 时 所 受 阻 滞 的 程 度 不 同 ， 表 现 的泳 动 率 的 不 同 而 被 分 开 。 这 种 分 子 筛 效 应 不 同 于 柱 层 析 中 的 分 子 筛 效 应 ， 后 者 是 大 分 子 先 从 凝 胶 颗 粒 间 的 缝 隙 流 出 ， 小 分 子 后 流 出 。 2.3. 电 荷 效 应蛋 白 质 样 品 在 界 面 处 被 浓 缩 成 一 狭 窄 的 高 浓 度 蛋 白 质 区 ， 但由 于 每 种 蛋 白 质 分 子 所 带 有 效 电 荷 不 同 ， 因 而 泳 动 率 也 不同 ， 因 此 各 种 蛋 白 质 就 按 泳 动 率 快 慢 顺 序 排 列 成 一 个 一 个区 带 。 在 进 入 分 离 胶 时 ， 电 荷 效 应 仍 起 作 用 。 目 前 ， PAGE连 续 体 系 应 用 也 很 广 ， 虽 然 电 泳 过 程 中 无 浓缩 效 应 ， 但 利 用 分 子 筛 及 电 荷 效 应 也 可 使 样 品 得 到 较 好 的分 离 ， 加 之 在 温 和 的 pH条 件 下 ， 不 致 使 蛋 白 质 、 酶 、 核 酸等 活 性 物 质 变 性 失 活 ， 也 显 示 了 它 的 优 越 性 。 变 性 PAGE原 理 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 分 为 非 变 性 凝 胶 和 变 性 凝 胶 两 种 。所 谓 非 变 性 凝 胶 ， 即 在 凝 胶 中 不 加 变 性 剂 ， 这 种 凝 胶 中 ， 蛋白 质 的 迁 移 率 受 它 的 静 电 荷 与 分 子 大 小 两 个 因 素 的 影 响 。 因此 在 非 变 性 凝 胶 中 进 行 电 泳 是 不 能 测 得 分 子 量 的 。所 谓 变 性 凝 胶 ， 即 在 凝 胶 中 加 入 变 性 剂 ， 如 尿 素 、 SDS(十 二烷 基 磺 酸 钠 )、 巯 基 乙 醇 、 DTT等 。 这 些 变 性 剂 可 以 破 坏 或 改变 蛋 白 质 的 结 构 ， 把 绝 大 部 分 蛋 白 质 分 离 成 组 成 它 们 的 亚 基 。同 时 在 蛋 白 质 分 子 周 围 包 围 了 大 量 负 电 荷 。 这 种 电 荷 基 本 上掩 盖 了 无 变 性 剂 存 在 时 正 常 就 有 的 任 何 电 荷 。 蛋 白 质 在 这 种变 性 凝 胶 中 的 迁 移 率 与 它 们 分 子 量 的 对 数 成 直 线 关 系 。 因 此利 用 变 性 凝 胶 进 行 电 泳 可 以 测 得 蛋 白 质 的 分 子 量 。 目 前 应 用较 多 的 变 性 剂 为 SDS。 变 性 PAGE原 理 SDS-PAGE时 ， 在 蛋 白 质 溶 解 液 中 加 入 SDS和 疏 基 乙 醇 。 巯 基 乙 醇 可 使 蛋 白 质 分 子 中 二 硫 键 还 原 ， 使 多 肽 分 成 单 个 亚 单位 。 SDS可 使 蛋 白 质 的 氢 键 、 疏 水 键 打 开 ， 还 引 起 蛋 白 质 构 象 的 改变 ， 并 形 成 复 合 物 。 此 复 合 物 的 流 体 力 学 和 光 学 性 质 均 表 明 ，它 们 在 水 溶 液 中 的 形 状 近 似 雪 茄 形 的 长 椭 圆 棒 。 不 同 蛋 白 质 -SDS复 合 物 的 短 轴 相 同 ， 约 1.8 nm， 而 长 轴 则 与 蛋 白 质 的 Mr成 正 比 。 目 前 ， 用 SDS-PAGE研 究 过 的 蛋 白 质 已 有 数 百 种 ， 均 证 实 此法 测 定 蛋 白 质 Mr的 可 靠 性 。 测 定 未 知 蛋 白 质 Mr时 ， 可 选 用 相 应 的 一 组 标 准 蛋 白 及 适 宜的 凝 胶 浓 度 ， 同 时 进 行 SDS-PAGE， 则 可 根 据 已 知 Mr蛋 白质 的 电 泳 迁 移 率 和 Mr的 对 数 作 出 标 准 曲 线 ， 再 根 据 未 知 蛋白 质 的 电 泳 迁 移 率 求 得 Mr。 本 方 法 有 仪 器 设 备 简 单 ， 操 作 方 便 ， 样 品 用 量 少 ， 耗 时 少(仅 需 一 天 )， 分 辨 率 高 ， 重 复 效 果 好 等 优 点 ， 因 而 得 到 非 常广 泛 的 应 用 与 发 展 。 它 不 仅 用 于 蛋 白 质 Mr测 定 ， 还 可 用 于蛋 白 混 合 组 分 的 分 离 和 亚 组 分 的 分 析 ， 当 蛋 白 质 经 SDS-PAGE分 离 后 ， 设 法 将 各 种 蛋 白 质 从