《猪链球菌的检测》PPT课件.ppt

猪 链 球 菌 的 检 测九 江 市 疾 病 预 防 控 制 中 心 梁 剑 锋 2011年 8月 15日 一 、 病 原 学 二 、 发 病 机 制三 、 流 行 病 学 四 、 临 床 表 现 五 、 预 防 与 控 制 六 、 病 原 学 鉴 定 七 、 鉴 别 诊 断 人 感 染 猪 链 球 菌 病 是 由 猪 链 球 菌 （ streptococcus suis）感 染 人 而 引 起 的 人 畜 共 患 性 疾 病 。 从 事 猪 的 屠 宰 及 加 工 等人 员 为 高 危 人 群 ， 本 病 主 要 通 过 皮 肤 的 伤 口 而 感 染 。 临 床表 现 为 发 热 、 寒 战 、 头 痛 、 食 欲 下 降 等 一 般 细 菌 感 染 症 状 ，重 症 患 者 可 合 并 中 毒 性 休 克 综 合 征 （ toxic shock syndrome, TSS） 和 链 球 菌 脑 膜 炎 综 合 征 （ streptococcus meningitis syndrome, SMS） 。 1968年 丹 麦 学 者 首 次 报 道 了 3例 人 感 染 猪 链 球 菌 导 致 脑 膜 炎 并 发 败 血症 病 例 ， 1975年 荷 兰 也 出 现 了 散 发 病 例 的 报 道 。 此 后 ， 中 国 香 港 、 英国 、 加 拿 大 、 德 国 、 法 国 、 美 国 、 澳 大 利 亚 、 比 利 时 、 巴 西 、 西 班 牙 、日 本 、 泰 国 、 瑞 典 及 中 国 内 地 陆 续 有 人 感 染 猪 链 球 菌 病 的 报 道 。 截 至2000年 ， 全 球 已 报 道 了 200多 例 人 感 染 猪 链 球 菌 病 病 例 ， 报 道 病 例 较多 的 国 家 或 地 区 普 遍 养 殖 业 发 达 或 有 食 用 猪 肉 的 习 惯 ， 病 例 呈 高 度 散发 态 势 。 在 我 国 ， 1998年 江 苏 省 报 告 了 人 感 染 猪 链 球 菌 病 ， 发 病 25例 ，死 亡 14例 ； 2005年 6月 至 8月 ， 四 川 省 发 生 的 人 感 染 猪 链 球 菌 病 爆 发 疫情 ， 为 国 内 外 迄 今 为 止 见 于 报 道 的 最 大 规 模 人 感 染 猪 链 球 菌 病 疫 情 ，发 病 数 204例 ， 死 亡 38例 。 链 球 菌 分 类 ： 1、 根 据 溶 血 现 象 分 类 1） 甲 型 溶 血 性 链 球 菌 ： 称 甲 型 溶 血 或 溶 血 ， 溶 血 环 中的 红 细 胞 并 未 完 全 溶 解 。 多 为 条 件 致 病 菌 。 2） 乙 型 溶 血 性 链 球 菌 ： 称 乙 型 溶 血 或 溶 血 ， 溶 血 环 中的 红 细 胞 完 全 溶 解 ， 致 病 力 强 。 3） 丙 型 链 球 菌 ： 无 溶 血 环 ， 一 般 不 致 病 。 猪 链 球 菌 溶 血 (偶 而 也 有 弱 溶 血 或 溶 血 、 溶 血 现象 均 不 明 显 ) ， 某 些 菌 株 在 马 血 培 养 基 上 溶 血 。 链 球 菌 分 类 ： 根 据 抗 原 结 构 的 分 类 兰 氏 分 类 ： 按 多 糖 类 抗 原 （ C抗 原 ） 将 链 球 菌 分 成 A、 B、 C、D、 E、 F、 G、 H、 K、 L、 M、 N、 O、 P、 Q、 R、 S和 T群 (其 中缺 I、 J群 ) ， 近 年 又 增 加 U、 V群 ， 共 20群 ， 每 个 群 有 1个或 多 个 种 。 一 、 病 原 学 猪 链 球 菌 属 链 球 菌 （ streptococcus） 科 ， 革 兰 染 色 阳 性 ，呈 球 形 或 卵 圆 形 。 链 球 菌 科 有 30个 以 上 的 菌 属 ， 分 类 有 数种 方 法 ， 根 据 链 球 菌 兰 斯 菲 尔 德 （ Lancefield） 分 类 法 ，将 猪 链 球 菌 分 到 了 R、 S、 T群 。 近 年 根 据 细 菌 荚 膜 多 糖 抗原 的 差 异 ， 将 猪 链 球 菌 分 为 35个 血 清 型 ， 即 1 34型 和 1/2型 ， 其 中 1/2型 为 同 时 含 有 1型 和 2型 抗 原 的 菌 株 。 2型 猪 链球 菌 主 要 是 R群 ， 而 1型 猪 链 球 菌 主 要 是 S群 。 迄 今 为 止 ， 文 献 报 道 感 染 人 的 猪 链 球 菌 分 别 是 2型 、 1型 和14型 ， 尤 以 2型 为 常 见 ， 也 是 最 常 被 分 离 到 的 猪 链 球 菌 型别 ， 其 他 两 个 型 别 仅 有 个 案 报 道 。 1、 猪 链 球 菌 的 理 化 特 性 该 菌 无 芽 胞 ， 有 荚 膜 ， 在 血 平 板 上 生 长 呈 细 小 菌 落 ， 无 色 ，半 透 明 ， 直 径 0.5 1 mm， 边 缘 整 齐 ， 凸 起 ， 光 滑 。 根 据溶 血 情 况 分 类 ， 猪 链 球 菌 在 羊 血 平 皿 上 表 现 为 溶 血 ， 而 在 马 血 平 皿 上 表 现 为 溶 血 。 适 宜 的 培 养 基 为 血 培 养 瓶及 血 平 皿 ， 培 养 温 度 36 、 时 间 18 20小 时 。 新 分 离 的猪 链 球 菌 ， 形 态 较 典 型 ， 链 长 可 达 20多 个 菌 体 ； 二 代 培 养后 细 菌 形 态 不 典 型 ,甚 至 变 为 革 兰 阴 性 球 杆 菌 ,不 成 链 。 因此 在 诊 断 、 研 究 时 ， 对 刚 分 离 到 的 细 菌 形 态 进 行 观 察 十 分重 要 。 猪 链 球 菌 对 环 境 理 化 因 素 的 抵 抗 力 差 ， 对 常 见 消 毒剂 都 敏 感 。 2、 毒 力 因 子 目 前 认 为 ， 较 为 重 要 的 猪 链 球 菌 毒 力 因 子 主 要 有 ：1） 荚 膜 多 糖 （ CPS） ： 是 目 前 惟 一 被 确 认 的 ， 也 是 最 为 重要 的 毒 力 因 子 。2） 溶 菌 酶 释 放 相 关 蛋 白 （ muramidase-released protein, MRP） 和 细 胞 外 蛋 白 因 子 （ extracellular factor, EF） ：除 荚 膜 多 糖 外 ， 这 两 种 蛋 白 是 最 常 用 于 评 价 猪 链 球 菌 毒 力的 指 标 。 3） 猪 链 球 菌 溶 血 素 （ suilysin） ： 溶 血 素 被 认 为 是 几 种细 菌 的 主 要 毒 力 因 子 ， 可 能 在 猪 链 球 菌 侵 入 和 裂 解 细 胞 的过 程 中 发 挥 着 重 要 作 用 。 4） 44000蛋 白 、 IgG结 合 蛋 白 及 其 他 因 素 ： 44000蛋 白 为 2型 猪 链 球 菌 的 胞 壁 蛋 白 ， IgG结 合 蛋 白 属 热 休 克 蛋 白 ， 有报 道 认 为 也 与 毒 力 相 关 。 菌 毛 (fimbriae)、 黏 附 因 子(adhesions)也 是 一 些 细 菌 常 见 的 毒 力 因 子 。 3、 MLST分 析 对 我 国 江 苏 和 四 川 省 人 感 染 猪 链 球 菌 病 爆 发 期 间 分 离 到 的菌 株 ， 进 行 多 位 点 序 列 分 型 （ multilocus sequence typing ,MLST） ， 证 实 均 为 序 列 7型 （ MLST 7型 ） 。 二 、 发 病 机 制 猪 链 球 菌 感 染 的 主 要 传 播 途 径 是 经 伤 口 的 直 接 接 触 感 染 。猪 链 球 菌 经 皮 肤 或 黏 膜 的 伤 口 进 入 人 体 ， 进 入 血 液 循 环 后在 血 液 中 迅 速 生 长 和 繁 殖 ， 即 败 血 症 ， 细 菌 随 血 液 循 环 进入 人 体 的 各 器 官 、 组 织 ， 致 多 器 官 、 组 织 发 生 病 变 。 细 菌并 释 放 毒 素 ， 致 机 体 发 生 严 重 的 中 毒 反 应 ， 即 毒 血 症 。 重症 感 染 及 细 菌 毒 素 的 作 用 ， 致 血 管 内 皮 损 伤 ， 以 及 血 液 处于 高 凝 状 态 ， 并 发 弥 散 性 血 管 内 凝 血 (disseminated intravascular coagulation, DIC)， 导 致 全 身 性 微 循 环障 碍 ， 多 器 官 功 能 衰 竭 。 人 感 染 猪 链 球 菌 临 床 主 要 有 两 种 严 重 表 现 形 式 ， 即 SMS和 TSS。 SMS的 主 要 病 理 表 现 是 化 脓 性 脑 膜 炎 ， 脑 膜 血 管 充 血明 显 ， 并 有 大 量 中 性 粒 细 胞 浸 润 ， 而 其 他 脏 器 的 病 理 改 变轻 微 。 TSS的 特 征 是 败 血 症 休 克 合 并 DIC， 病 理 表 现 为 全 身 多 器 官 、组 织 实 质 细 胞 变 性 和 坏 死 ， 以 及 不 等 量 的 中 性 粒 细 胞 浸 润 ，间 质 内 血 管 明 显 充 血 、 漏 出 性 出 血 ， 毛 细 血 管 内 微 血 栓（ 透 明 血 栓 ） 形 成 。 主 要 受 累 器 官 的 表 现 为 ： 皮 肤 、 黏 膜 （ 胃 肠 道 、 呼 吸 道 及 泌 尿 生 殖 道 ） 与 浆 膜 出现 瘀 点 和 瘀 斑 ； 心 、 肝 、 肾 、 肾 上 腺 、 食 管 和 肠 道 等 脏 器出 血 ， 血 液 不 凝 固 ， 颜 色 鲜 红 ； 部 分 器 官 （ 肺 、 肾 ） 毛 细血 管 内 有 数 量 不 等 的 微 血 栓 （ 透 明 血 栓 ） 形 成 ， 后 者 呈PTAH染 色 阳 性 ， 支 持 为 纤 维 蛋 白 性 血 栓 。 肺 充 血 、 水 肿 ， 灶 性 和 片 状 出 血 ， 以 及 毛 细 血 管 内 微 血栓 形 成 。 急 性 脾 炎 。 肝 脏 轻 度 肿 大 ， 肝 细 胞 点 状 、 灶 性 或 片 状 坏 死 。 肾 脏 充 血 、 出 血 ， 肾 小 球 毛 细 血 管 内 数 量 不 等 的 微 血 栓形 成 。 心 肌 纤 维 变 性 、 点 状 坏 死 及 炎 细 胞 浸 润 ， 间 质 血 管 充 血伴 多 灶 性 出 血 。 浆 膜 腔 积 液 ， 如 胸 腔 、 心 包 腔 和 腹 腔 积 液 等 。 病 变 以 肺 、肾 脏 和 心 脏 为 甚 ， 而 脑 和 脑 膜 的 病 变 不 明 显 。 有 的 病 例可 见 皮 肤 有 伤 口 ， 常 见 于 手 臂 与 足 等 处 。 重 症 猪 链 球 菌 感 染 者 可 合 并 DIC。 病 理 表 现 为 全 身 多 器 官 、组 织 内 毛 细 血 管 漏 出 性 出 血 ， 血 液 不 凝 固 ， 继 而 导 致 多 器官 功 能 衰 竭 和 休 克 。休 克 是 强 烈 的 致 病 因 子 作 用 于 机 体 引 起 的 全 身 危 重 病 理 过程 ， 多 种 原 因 可 致 休 克 。 重 症 人 感 染 猪 链 球 菌 病 患 者 发 生休 克 应 是 多 种 原 因 所 致 ， 包 括 某 些 炎 性 介 质 的 作 用 引 起静 脉 和 毛 细 血 管 扩 张 ， 致 血 管 总 容 积 增 加 ； DIC致 广 泛性 毛 细 血 管 漏 出 性 出 血 使 血 容 量 减 少 ； 心 肌 病 变 致 心 输出 量 减 少 等 。 SMS患 者 ， 因 脑 脊 髓 膜 血 管 高 度 扩 张 充 血 ， 蛛 网 膜 下 腔 增宽 ， 大 量 中 性 粒 细 胞 、 纤 维 蛋 白 及 液 体 渗 出 导 致 脑 脊 液 量增 加 ， 而 引 起 颅 内 高 压 ， 患 者 可 有 头 痛 、 喷 射 状 呕 吐 以 及病 理 征 阳 性 等 症 状 和 体 征 。 因 颅 神 经 受 累 ， 患 者 可 有 不 同程 度 的 听 力 障 碍 ， 甚 至 永 久 性 耳 聋 。 三 、 流 行 病 学 1、 传 染 源 感 染 猪 链 球 菌 的 病 （ 死 ） 猪 是 人 感 染 猪 链 球 菌 病 的 主 要源 头 。 另 有 文 献 报 道 ， 一 些 病 死 的 鹿 、 羊 、 鸡 、 鸭 、 马 、猫 、 狗 及 反 刍 动 物 体 内 能 分 离 到 2型 猪 链 球 菌 ， 但 这 些 动物 是 否 为 传 染 源 尚 待 进 一 步 研 究 。 目 前 尚 无 证 据 表 明 人 感 染 猪 链 球 菌 病 能 在 人 与 人 间 传 播 。 2、 传 播 途 径 人 感 染 猪 链 球 菌 主 要 因 接 触 被 猪 链 球 菌 感 染 的 生 猪 和 未加 工 的 猪 肉 制 品 ， 经 皮 肤 破 损 的 伤 口 或 眼 结 膜 而 感 染 。 是否 能 通 过 呼 吸 道 ， 借 助 气 溶 胶 由 病 猪 而 感 染 人 仍 有 待 深 入研 究 。 3、 人 群 易 感 性 人 群 普 遍 易 感 。 直 接 接 触 感 染 的 病 （ 死 ） 猪 或 猪 肉 制 品的 人 群 为 高 危 人 群 ， 有 皮 肤 破 损 者 极 易 发 病 。 国 外 多 数 学者 认 为 人 感 染 猪 链 球 菌 病 是 人 类 一 种 重 要 的 动 物 源 性 职 业病 。 免 疫 功 能 缺 陷 的 人 群 感 染 猪 链 球 菌 ， 往 往 病 症 较 重 。 4、 流 行 特 征 本 病 的 流 行 特 征 还 不 完 全 清 楚 ， 人 感 染 猪 链 球 菌 病 常 伴随 猪 群 中 链 球 菌 病 的 爆 发 而 高 度 散 发 ， 已 报 道 的 人 感 染 猪链 球 菌 病 例 常 发 生 于 夏 季 。 猪 间 猪 链 球 菌 感 染 的 扩 散 可 能与 高 温 潮 湿 的 环 境 密 切 相 关 ， 因 此 高 温 潮 湿 也 很 可 能 是 间接 导 致 人 感 染 猪 链 球 菌 病 夏 季 发 病 增 加 的 因 素 。 人 感 染 猪链 球 菌 病 与 性 别 、 年 龄 没 有 必 然 联 系 ， 但 与 职 业 有 很 大 关系 ， 从 事 猪 的 养 殖 或 者 是 参 与 猪 的 屠 宰 、 加 工 、 配 送 、 销售 及 烹 调 的 人 员 均 属 高 危 人 群 ， 尤 其 是 宰 杀 病 （ 死 ） 猪 者危 险 性 更 大 。 四 、 临 床 表 现 潜 伏 期 数 小 时 7天 ， 一 般 为 2 3天 。 潜 伏 期 长 短 与 感 染病 原 体 的 毒 力 、 数 量 以 及 机 体 免 疫 力 等 因 素 有 关 。 一 般 来说 ， 潜 伏 期 越 短 ， 病 情 越 重 。 1、 临 床 症 状 和 体 征急 性 起 病 ， 轻 重 不 一 ,表 现 多 样 。 1） 感 染 中 毒 症 状 ： 高 热 、 畏 寒 、 寒 战 ， 伴 头 痛 、 头 晕 、全 身 不 适 、 乏 力 等 。2） 消 化 道 症 状 ： 食 欲 下 降 、 恶 心 、 呕 吐 ， 少 数 患 者 出 现腹 痛 、 腹 泻 。3） 皮 疹 ： 皮 肤 出 现 瘀 点 、 瘀 斑 ， 部 分 病 例 可 出 现 口 唇 疱疹 。4） 休 克 ： 血 压 下 降 ， 末 梢 循 环 障 碍 。5） 中 枢 神 经 系 统 感 染 表 现 ： 脑 膜 刺 激 征 阳 性 ， 重 者 可 出现 昏 迷 。 6） 呼 吸 系 统 表 现 ： 部 分 严 重 患 者 继 发 急 性 呼 吸 窘 迫 综 合征 （ ARDS） ， 出 现 呼 吸 衰 竭 表 现 。7） 听 力 、 视 力 改 变 ： 听 力 下 降 ， 视 力 下 降 ， 且 恢 复 较 慢 。8） 其 他 ： 少 数 患 者 可 出 现 关 节 炎 、 化 脓 性 咽 炎 、 化 脓 性淋 巴 结 炎 等 ， 严 重 患 者 还 可 出 现 肝 脏 、 肾 脏 等 重 要 脏 器 的功 能 损 害 。 2、 临 床 分 型 根 据 临 床 表 现 的 不 同 ， 可 以 分 为 以 下 类 型 。1） 普 通 型 ： 起 病 较 急 ， 发 热 、 畏 寒 、 头 痛 、 头 晕 、 全 身不 适 、 乏 力 ， 部 分 患 者 有 恶 心 、 呕 吐 、 腹 痛 、 腹 泻 等 表 现 ，无 休 克 、 昏 迷 表 现 。2） 休 克 型 ： 在 全 身 感 染 基 础 上 出 现 血 压 下 降 ， 成 人 收 缩压 低 于 90 mmHg（ 1 mmHg 0.133 kPa） ， 脉 压 小 于 20 mmHg， 伴 有 下 列 两 项 或 两 项 以 上 ： 肾 功 能 不 全 ； 凝 血功 能 障 碍 ， 或 弥 散 性 血 管 内 凝 血 ； 肝 功 能 不 全 ； 急 性呼 吸 窘 迫 综 合 征 ； 全 身 皮 肤 黏 膜 瘀 点 、 瘀 斑 ， 或 眼 结 膜充 血 ； 软 组 织 坏 死 ， 筋 膜 炎 ， 肌 炎 ， 坏 疽 等 。 3 脑 膜 炎 型 ： 发 热 、 畏 寒 、 全 身 不 适 、 乏 力 、 头 痛 、 呕吐 。 重 者 出 现 昏 迷 。 脑 膜 刺 激 征 阳 性 ， 脑 脊 液 呈 化 脓 性 改变 。4 混 合 型 ： 兼 有 休 克 型 和 脑 膜 炎 型 表 现 。 五 、 预 防 与 控 制 人 感 染 猪 链 球 菌 病 的 预 防 控 制 应 以 疫 情 监 测 、 严 格 控 制 传染 源 、 切 断 传 播 途 径 等 综 合 性 防 治 措 施 为 主 。1、 疫 情 监 测各 级 各 类 医 疗 机 构 ， 尤 其 在 已 经 发 生 动 物 疫 情 和 曾 经 发 生人 感 染 猪 链 球 菌 病 疫 情 的 地 区 及 周 边 地 区 ， 要 开 展 对 不 明原 因 发 热 病 例 的 监 测 。 接 诊 可 疑 不 明 原 因 发 热 患 者 必 须 询问 流 行 病 史 ， 如 发 现 有 病 （ 死 ） 猪 接 触 史 ， 应 在 积 极 治 疗的 同 时 ， 立 即 向 当 地 疾 病 预 防 控 制 机 构 报 告 。 2、 管 理 传 染 源应 在 当 地 有 关 部 门 的 指 导 下 ， 对 病 （ 死 ） 家 畜 进 行 消 毒 、焚 烧 、 深 埋 等 无 害 化 处 理 。 严 禁 屠 宰 、 加 工 、 贩 卖 病 （ 死 ）家 畜 及 其 制 品 。 3、 切 断 传 播 途 径1） 对 直 接 接 触 （ 如 宰 杀 、 洗 切 加 工 、 搬 运 等 ） 感 染 的 病（ 死 ） 猪 或 猪 肉 制 品 的 人 员 ， 开 展 为 期 1周 的 医 学 观 察 ，主 要 观 察 体 温 变 化 ， 一 旦 出 现 发 热 应 立 即 就 诊 。 2） 做 好 疫 点 的 消 毒 处 理 。 对 患 者 家 庭 及 其 畜 圈 、 禽 舍 等区 域 和 患 者 发 病 前 接 触 的 病 （ 死 ） 猪 所 在 家 庭 及 其 畜 圈 、禽 舍 等 疫 点 区 域 进 行 消 毒 处 理 。患 者 的 排 泄 物 、 分 泌 物 、 呕 吐 物 等 应 用 消 毒 液 消 毒 。 3） 根 据 实 际 情 况 ， 划 定 疫 点 、 疫 区 、 受 威 胁 区 ， 必 要 时采 取 一 定 管 制 措 施 。 4、 保 护 易 感 人 群1） 个 人 防 护动 物 疫 情 发 生 地 的 生 猪 屠 宰 、 加 工 、 销 售 等 从 业 人 员 或 其他 相 关 人 员 应 做 好 个 人 防 护 工 作 ， 特 别 是 从 事 动 物 疫 情 处理 的 工 作 人 员 应 采 取 严 格 的 个 人 防 护 措 施 。从 事 人 感 染 猪 链 球 菌 病 例 调 查 、 采 样 、 临 床 救 治 、 实 验 室检 测 和 消 毒 工 作 的 医 务 卫 生 人 员 均 应 采 取 严 格 的 个 人 防 护措 施 ， 严 防 发 生 感 染 。 2） 药 物 预 防对 直 接 接 触 感 染 的 病 （ 死 ） 猪 或 猪 肉 制 品 的 人 员 可 用 阿 莫西 林 进 行 预 防 性 服 药 ， 每 次 0.5 g， 每 天 3次 ， 连 服 3天 。 3） 健 康 教 育采 取 多 种 形 式 开 展 健 康 宣 传 教 育 ， 向 群 众 宣 传 传 染 病 和 人畜 共 患 病 防 治 知 识 ， 告 知 群 众 不 要 宰 杀 、 加 工 、 销 售 、 食用 病 （ 死 ） 家 畜 。 5、 流 行 病 学 调 查发 现 人 感 染 猪 链 球 菌 病 疫 情 后 ， 疫 情 发 生 地 县 级 疾 病 预 防控 制 机 构 要 立 即 组 织 开 展 流 行 病 学 调 查 ， 在 最 短 时 间 内 对所 报 告 病 例 进 行 核 实 ， 进 行 个 案 调 查 。 六 、 病 原 学 鉴 定 猪 链 球 菌 的 实 验 室 检 测 主 要 是 对 细 菌 培 养 所 获 得 的 菌 株 分离 后 进 行 生 化 鉴 定 、 血 清 分 型 以 及 特 异 性 基 因 检 测 。 目 前尚 无 成 熟 的 特 异 性 抗 体 检 测 方 法 。 1 标 本 采 集 及 病 原 体 分 离采 集 患 者 的 血 液 、 脑 脊 液 或 尸 检 标 本 ， 直 接 接 种 于 猪 链 球菌 最 佳 培 养 基 进 行 培 养 分 离 。 如 条 件 所 限 ， 不 能 立 即 接 种 ，应 4 保 存 或 冷 藏 送 检 ， 争 取 及 时 培 养 。 1） 样 品 采 集 对 病 猪 ， 最 急 性 和 急 性 病 例 可 无 菌 采 集 死 亡 猪 的 心 、 肝 、肺 、 肾 、 脾 脏 、 淋 巴 结 等 组 织 ， 慢 性 病 例 如 关 节 炎 型 一 般采 取 关 节 液 及 周 围 组 织 ； 对 活 猪 可 采 取 扁 桃 体 拭 子 、 鼻 腔拭 子 。 2） 分 离 培 养送 检 菌 株 的 分 离 划 线 接 种 于 普 通 琼 脂 绵 羊 血 平 板 ， 36 1 培 养24h 2h， 如 茵 落 生 长 缓 慢 ， 可 延 长 至 48 h 2h， 使 之 形成 单 个 菌 落 ， 以 供 鉴 定 用 。 病 料 的 分 离 和 触 片 检 查 用 经 火 焰 灭 菌 并 冷 却 的 接 种 环 蘸 取 病 料 内 部 组 织 后 划 线接 种 于 普 通 琼 脂 绵 羊 血 平 板 ， 于 36 1 培 养 24 h 2h，如 菌 落 生 长 缓 慢 ， 可 延 长 至 48 h 2h后 观 察 。 同 时 取 病 料做 组 织 触 片 ， 姬 姆 萨 染 色 （ 按 GB/T 4789. 28的 方 法 进 行染 色 ） 后 镜 检 ， 如 见 球 菌 则 表 明 病 料 中 可 能 含 有 链 球 菌 。扁 桃 体 和 鼻 腔 拭 子 的 分 离 扁 桃 体 和 鼻 腔 拭 子 样 品 加 入 到 含 有 S mL灭 菌 的 选 择 性 THB增 菌 液 的 试 管 中 ， 于 361 培 养 24 h2 h后 ， 划 线 接种 于 选 择 性 普 通 琼 脂 绵 羊 血 平 板 。 动 物 产 品 的 均 质 、 增 菌 和 分 离 以 无 菌 操 作 取 检 样 25g， 加 入 装 有 225 mL灭 菌 选 择 性 THB增 菌 液 的 广 口 瓶 内 ， 均 质 ， 于 361 培 养 24 h2h后 ，划 线 接 种 于 选 择 性 普 通 琼 脂 绵 羊 血 平 板 。 3） 初 步 鉴 定 猪 链 球 菌 2型 在 36 培 养 24 h后 ， 在 普 通 琼 脂 绵 羊 血 平 板和 选 择 性 普 通 琼 脂 绵 羊 血 平 板 上 形 成 圆 形 、 微 凸 、 表 面 光滑 、 湿 润 、 边 缘 整 齐 、 半 透 明 的 菌 落 ， 直 径 约 0.3 mm-l mm， 大 多 数 菌 株 呈 溶 血 ， 部 分 菌 株 产 生 溶 血 。 将 可 疑 菌落 做 革 兰 氏 染 色 和 过 氧 化 氢 酶 试 验 。 本 菌 为 革 兰 氏 阳 性 球菌 ， 菌 体 直 径 约 1 m， 固 体 培 养 物 以 双 球 菌 为 多 ， 少 量 呈3个 -5个 排 列 的 短 链 ， 液 体 培 养 物 以 链 状 为 主 ， 无 芽 孢 ，能 形 成 荚 膜 （ 按 GB/T 4789. 28的 方 法 进 行 染 色 ） 。 本 菌过 氧 化 氢 酶 试 验 均 为 阴 性 。 菌 落 生 长 特 征 、 革 兰 氏 染 色 、菌 体 形 态 和 过 氧 化 氢 酶 试 验 符 合 者 ， 可 初 步 确 定 为 链 球 菌 。 革 兰 染 色 镜 下 成 对 出 现 ， 革 兰 氏 阳 性 链 球 菌 猪 链 球 菌 显 微 镜 形 态 猪 链 球 菌 鲜 血 琼 脂 培 养 菌 落 形 态 羊 血 平 皿 ： 溶 血 2 生 化 鉴 定对 分 离 到 的 菌 株 应 用 API生 化 鉴 定 系 统 的 Api20-step手 工鉴 定 条 及 Vitek-compact2或 其 他 生 化 鉴 定 系 统 进 行 鉴 定 ，可 直 接 鉴 定 到 种 。 经 初 步 鉴 定 后 ， 做 5%乳 糖 、 海 藻 糖 、 七 叶 苷 、 甘 露 醇 、 山梨 醇 、 马 尿 酸 钠 等 糖 发 酵 试 验 。 猪 链 球 菌 2型 发 酵 5%乳 糖和 海 藻 糖 产 酸 ， 发 酵 七 叶 苷 ， 不 发 酵 甘 露 醇 和 山 梨 醇 ， 不水 解 马 尿 酸 钠 。 3 血 清 分 型对 经 过 生 化 鉴 定 的 菌 株 用 猪 链 球 菌 1 34型 血 清 或 用 单 克隆 抗 体 进 行 分 型 。 实 验 方 法 ： 取 1滴 链 球 菌 分 型 血 清 或 单克 隆 抗 体 悬 滴 于 载 玻 片 上 ， 与 1滴 菌 悬 液 充 分 混 合 ， 或 用接 种 环 刮 取 单 个 菌 落 直 接 与 血 清 混 合 ， 观 察 是 否 出 现 凝 集反 应 ， 同 时 用 生 理 盐 水 做 对 照 。 将 可 疑 菌 落 接 种 THB肉 汤 （ 见 第 B 3章 ） ， 于 361c培养 18 h2h， 取 1.5 mL培 养 物 ， 10 000 r/min离 心 3 min，弃 上 清 ， 用 100 L生 理 盐 水 将 沉 淀 悬 浮 ， 取 25 L菌 体 悬浮 液 分 别 和 等 体 积 的 25 L生 理 盐 水 、 猪 链 球 菌 2型 阳 性 血清 作 玻 片 凝 集 试 验 ， 其 中 生 理 盐 水 作 为 稀 释 液 对 照 并 观 察待 检 菌 株 是 否 有 自 凝 现 象 。 同 时 设 阳 性 菌 株 对 照 。 在 生 理盐 水 对 照 不 凝 集 ， 阳 性 菌 株 凝 集 的 情 况 下 ， 待 检 菌 株 出 现凝 集 为 阳 性 反 应 。 4 PCR基 因 鉴 定挑 取 分 离 纯 化 的 菌 落 或 选 择 平 板 上 湿 润 的 可 疑 菌 落 ， 利 用特 异 引 物 进 行 PCR扩 增 。 进 行 链 球 菌 属 特 异 性 引 物 （ tuf） 、猪 链 球 菌 种 特 异 性 、 猪 链 球 菌 2型 荚 膜 多 糖 基 因 （ cps2j） 、猪 链 球 菌 溶 菌 酶 释 放 相 关 蛋 白 编 码 基 因 片 段 （ mrp） 及 猪链 球 菌 溶 血 素 基 因 （ sly） 检 测 。 对 已 经 大 量 使 用 抗 菌 药物 治 疗 的 患 者 ， 可 将 采 集 标 本 直 接 进 行 PCR法 检 测 ， 确 认猪 链 球 菌 种 特 异 性 基 因 （ 16SrRNA） ， 以 及 特 有 的 毒 力 基因 ， 若 为 阳 性 者 则 作 为 确 诊 病 例 。 基 因 鉴 定 ， 使 用 PCR技 术 和 对 PCR产 物 进 行 序 列 分 析 检 测 猪链 球 菌 种 特 异 性 16S rRNA。 上 游 引 物 ： cagtatttaccgcatggtagatat 下 游 引 物 ： gtaagataccgtcaagtgagaa 检 测 猪 链 球 菌 荚 膜 多 糖 基 因 （ cps2j） 上 游 引 物 ： gttgagtccttatacacctgtt 下 游 引 物 ： cagaaaattcatattgtccacc 检 测 溶 菌 酶 释 放 相 关 蛋 白 编 码 基 因 片 段 （ mrp） 上 游 引 物 ： ggtatacctt gctggtaccg ttc 下 游 引 物 ： agtctctaca gctgtagctg g PCR反 应 的 条 件 ： 94 预 变 性 5分 钟 ;94 、 30秒 ， 60 、 30秒 ， 72 、 30秒 ， 25个 循 环 ， 最 后 延 伸 72 、 5分 钟 。 取 5微 升 扩 增 产 物在 1.2的 琼 脂 糖 凝 胶 中 进 行 电 泳 。 5、 检 测 过 程 中 防 止 交 叉 污 染 的 措 施 1） 抽 样 和 制 样 过 程 抽 样 和 制 样 工 具 ， 应 清 洗 干 净 ， 121 、 15 min-20 min灭 菌 ， 一 套 清 洁 工 具 限 于 一 个 样 品 使 用 。 存 放 样 品 的 容 器应 该 经 过 清 洗 、 灭 菌 ， 或 为 一 次 性 灭 菌 容 器 。 2)检 测 过 程PCR实 验 室 应 分 为 样 品 制 备 区 、 前 PCR区 、 PCR区 、 后 PCR区 。 将 模 板 提 取 、 PCR反 应 液 配 制 、 PCR循 环 扩 增 及 PCR产物 的 鉴 定 等 步 骤 分 区 或 分 室 进 行 。 实 验 室 的 运 作 应 从 “ 净区 ” 到 “ 脏 区 ” 单 方 向 进 行 。实 验 过 程 中 ， 应 穿 实 验 服 和 戴 手 套 ， 手 套 要 经 常 更 换 。各 区 要 有 专 用 实 验 服 ， 经 常 清 洗 。各 区 所 有 的 试 剂 、 器 材 （ 尤 其 是 移 液 器 ） 、 仪 器 都 应 专用 ， 不 得 带 出 该 区 。 所 有 溶 液 、 水 、 耗 材 和 器 具 要 121 、 15 min- 20 min灭 菌 ， 避 免 核 酸 和 （ 或 ） 核 酸 酶 污 染 。 每 种 溶 液 应 使 用 高质 量 的 成 分 和 新 蒸 馏 的 双 蒸 水 。 在 20 -25 贮 存 的 试 剂中 ， 可 加 0.025%的 叠 氮 钠 。 所 有 试 剂 应 该 以 大 体 积 配 制 ，然 后 分 装 成 仅 够 一 次 使 用 的 量 进 行 贮 存 。装 有 DNA模 板 或 引 物 的 离 心 管 打 开 之 前 ， 要 简 短 离 心 ，离 心 管 不 能 用 力 崩 开 ， 以 免 产 生 气 溶 胶 。茼 PCR区 中 ， 最 好 能 在 PCR操 作 箱 中 加 入 PCR反 应 各 组 分 。实 验 前 后 ， 实 验 室 用 紫 外 线 消 毒 以 破 坏 残 留 的 DNA。可 使 用 UDG和 dUTP系 统 控 制 污 染 。检 测 过 程 中 的 废 弃 物 ， 应 收 集 后 高 压 灭 菌 处 理 。 6、 符 合 以 下 特 性 者 应 判 为 猪 链 球 菌 2型 ； 猪 链 球 菌 2型 在 36 培 养 24 h后 ， 在 普 通 琼 脂 绵 羊血 平 板 和 选 择 性 普 通 琼 脂 绵 羊 血 平 板 上 形 成 圆 形 、 微 凸 、表 面 光 滑 、 湿 润 、 边 缘 整 齐 、 半 透 明 的 菌 落 ， 直 径 约 0.3 mm-lmm， 大 多 数 菌 株 呈 a溶 血 ， 部 分 菌 株 产 生 p溶 血 ； 革 兰 氏 阳 性 球 菌 ， 单 个 、 成 对 或 成 链 存 在 ； 过 氧 化 氢 酶 试 验 阴 性 ； 发 酵 5%乳 糖 和 海 藻 糖 产 酸 ， 发 酵 七 叶 苷 ， 不 发 酵 甘 露醇 和 山 梨 醇 ， 不 水 解 马 尿 酸 钠 （ 本 试 验 项 目 具 有 不 确 定 性 ，鉴 定 时 供 参 考 ） ， 或 法 国 生 物 一 梅 里 埃 公 司 AP120 Strep生 化 鉴 定 系 统 鉴 定 为 猪 链 球 菌 2型 者 ； 与 猪 链 球 菌 2型 阳 性 血 清 玻 片 凝 集 试 验 阳 性 ； 猪 链 球 菌 2型 定 型 PCR检 测 阳 性 。 7、 符 合 以 下 特 性 者 的 菌 株 可 判 定 为 致 病 性 猪 链 球 菌 2型 菌株 ： 符 合 6的 特 性 ； 主 要 毒 力 基 因 (mrp、 ef、 orf2、 sly)全 部 或 之 一 PCR检 测 阳 性 。 七 、 鉴 别 诊 断 本 病 应 与 其 他 可 致 发 热 、 瘀 点 、 瘀 斑 、 休 克 、 多 器 官 功 能损 害 等 表 现 的 疾 病 相 鉴 别 ， 尤 其 应 注 意 与 下 列 疾 病 相 鉴 别 ： 1. 其 他 链 球 菌 TSS： A组 链 球 菌 以 及 所 产 生 的 链 球 菌 致 热外 毒 素 （ streptococcal pyrogenic exotoxins， SPE） ，如 SPE-A、 SPE-C、 SPE-F等 可 导 致 严 重 TSS， B组 链 球 菌 、 C组 链 球 菌 、 G组 链 球 菌 以 及 草 绿 色 链 球 菌 中 的 缓 症 链 球 菌感 染 也 均 可 引 起 TSS。 结 合 患 者 发 病 前 7天 内 无 病 猪 或 死 猪等 家 畜 直 接 接 触 史 ， 可 与 人 感 染 猪 链 球 菌 病 相 鉴 别 ， PCR或 免 疫 学 方 法 检 测 SPE-A等 有 助 于 诊 断 ； 感 染 部 位 标 本 或血 培 养 鉴 定 为 A组 链 球 菌 或 其 他 链 球 菌 即 可 鉴 别 。 2. 葡 萄 球 菌 TSS（ Staphy TSS） ： 是 由 金 黄 色 葡 萄 球 菌产 生 的 中 毒 性 休 克 综 合 征 毒 素 - （ TSST- ） 和 肠 毒 素 引起 、 与 人 感 染 猪 链 球 菌 病 临 床 表 现 相 似 的 TSS， 分 为 月 经相 关 性 TSS（ mTSS） 和 非 月 经 相 关 性 TSS（ nmTSS） 两 种 类型 。 年 轻 妇 女 、 有 阴 道 月 经 塞 使 用 史 、 月 经 期 突 然 发 病 等有 助 于 mTSS诊 断 ； TSS继 发 于 局 灶 性 感 染 、 外 伤 、 侵 入 性诊 疗 操 作 后 ， 应 注 意 nmTSS的 可 能 性 。 临 床 标 本 培 养 分 离出 金 黄 色 葡 萄 球 菌 ， 或 特 异 性 TSST-I或 肠 毒 素 A、 B、 C、 D、G等 阳 性 结 果 即 可 鉴 别 。 3. 其 他 疾 病 ： 还 应 注 意 与 其 他 革 兰 阳 性 细 菌 败 血 症 、 感染 性 休 克 （ septic shock） 、 爆 发 型 流 行 性 脑 脊 髓 膜 炎 、肾 综 合 征 出 血 热 （ HFRS） 及 全 身 炎 症 反 应 综 合 征 （ SIRS）等 疾 病 相 鉴 别 。 后 期 应 注 意 排 除 其 他 严 重 感 染 所 致 的 多 器官 功 能 损 害 综 合 征 （ MODS） 或 多 器 官 功 能 衰 竭 （ MOF） 。