固定化酶与固定化细胞

第 四 章 固 定 化 酶 与 固 定 化 细 胞 本 章 内 容o 酶 的 固 定 化 (1)为 什 么 要 固 定 化 ? (2)怎 样 固 定 化 ?(固 定 化 方 法 ) (3) 固 定 化 酶 的 特 性o 细 胞 的 固 定 化 (1)细 胞 固 定 化 所 用 的 方 法 (2) 固 定 化 细 胞 的 特 性o 辅 酶 的 固 定 化 什 么 是 固 定 化 酶 ？o 指 固 定 在 一 定 载 体 上 并 在 一 定 空 间 范 围 内 进行 催 化 反 应 的 酶 。一 酶 的 固 定 化 直 接 利 用 微 生 物 酶 （ 1） 不 稳 定 。 在 高 温 、 高 压 、 强 酸 、 强 碱 下 。（ 2） 易 失 活 。 即 使 在 最 适 合 的 条 件 下 反 应 。（ 3） 回 收 困 难 。 用 适 当 方 法 提 取 目 的 产 物 后 ， 残 存 酶 回 收 困 难 。（ 4） 反 应 速 度 减 慢 。 不 容 易 和 毒 副 分 子 和 产 物 分 离 .（ 5） 经 济 上 不 合 算 。 一 次 性 反 应 后 不 能 再 次 使 用 。阻 碍 了 微 生 物 酶 的 应 用 和 发 展 。研 制 固 定 化 酶 和 固 定 化 菌 体(一 )为 什 么 要 固 定 化 ? (一 )为 什 么 要 固 定 化 ?o 在 一 定 程 度 上 可 以 改 善 酶 的 稳 定 性 ；o 可 以 多 次 反 复 使 用 ， 有 利 于 采 用 连 续 操 作 工艺 ， 从 而 使 酶 和 细 胞 的 使 用 率 提 高 ， 降 低 生产 成 本 ；o 酶 和 细 胞 不 混 入 产 物 ， 可 精 简 产 物 分 离 工 序 。 (1)固 定 化 在 一 定 程 度 上 可 以 改 善 酶 的 稳定 性o 固 定 化 增 加 了 酶 的 耐热 性 （ 热 变 性 原 理 ）o 固 定 化 增 加 了 酶 对 蛋白 变 性 剂 （ 尿 素 ， 盐酸 胍 ） 等 的 抵 抗 能 力o 固 定 化 减 少 了 蛋 白 酶的 作 用 （ 阻 碍 了 活 性部 位 的 接 近 ） (2)固 定 化 使 酶 和 细 胞 的 使 用 率 提 高o 江 南 大 学 的 孙 志 浩 通 过 卡拉 胶 包 埋 的 方 法 ， 使 酶 的重 复 利 用 30个 批 次 后 活 性没 有 明 显 减 少 ， 大 大 促 进了 酶 的 利 用 率 ， 加 速 了 工艺 工 业 化 进 程 (3)可 精 简 产 物 分 离 工 序底 物 和 产 物 更 容易 和 酶 分 离 (二 ) 怎 样 固 定 化 ?(固 定 化 方 法 ) 固 定 化 的 第 五 种 方 法 变 性 法o 在 不 使 用 载 体 的 情 况 下 ， 借 助 加 热 、 冰 冻 或-射 线 等 物 理 手 段 ， 也 可 通 过 添 加 柠 檬 酸 、各 种 絮 凝 剂 、 交 联 剂 或 变 性 剂 处 理 ， 使 细 胞内 起 破 坏 作 用 的 蛋 白 酶 变 性 、 细 胞 结 构 固 定和 菌 体 聚 集 成 大 颗 粒 达 到 固 定 化 的 目 的 。 此法 制 备 的 细 胞 一 般 只 用 于 完 成 单 酶 或 少 数 几种 酶 催 化 反 应 。 (1) 吸 附 法o 物 理 吸 附 是 通 过 氢 键 、 疏 水 键 和 电 子 亲 和 力等 物 理 作 用 力 将 酶 固 定 于 不 溶 性 载 体 的 方 法 。常 用 的 载 体 有 高 岭 土 、 皂 土 、 硅 胶 、 磷 酸 钙胶 、 氧 化 铝 、 微 孔 玻 璃 等 无 机 吸 附 剂 o 离 子 交 换 吸 附 是 在 适 宜 的 pH和 离 子 强 度 条 件下 ， 利 用 酶 的 侧 链 解 离 基 团 和 离 子 交 换 剂 的相 互 作 用 而 达 到 固 定 化 的 一 种 方 法 。 最 常 用的 交 换 剂 有 CM 纤 维 素 、 DEAE 纤 维 素 、DEAE 葡 聚 糖 凝 胶 等 。 o 蛋 白 质 浓 度 ： 若 吸 附 剂 的 量 固 定 ， 随 蛋 白 质 浓 度 增 加 ， 吸 附量 也 增 加 ， 直 至 饱 和 。o pH ： 影 响 载 体 和 酶 的 电 荷 变 化 ,从 而 影 响 酶 吸 附 。o 离 子 强 度 ： 多 方 面 的 影 响 ， 一 般 认 为 盐 阻 止 吸 附 。o 温 度 ： 蛋 白 质 往 往 是 随 温 度 上 升 而 减 少 吸 附 。o 载 体 ： 蛋 白 质 在 固 体 载 体 上 的 吸 附 速 度 要 比 小 分 子 慢 得 同 时 对 于 非 多 孔 性 载 体 ， 则 颗 粒 越 小 吸 附 力 越 强 。 多 孔 性 载体 ， 要 考 虑 吸 附 对 象 的 大 小 和 总 吸 附 面 积 的 大 小 。 影 响 酶 蛋 白 在 载 体 上 吸 附 程 度 的 因 素 吸 附 法 特 点o 优 点 ： 操 作 简 便 ， 处 理 条 件 温 和 ， 酶 的 高 级结 构 和 活 性 中 心 不 易 破 坏 ， 有 利 于 制 备 高 活性 酶o 缺 点 ： 载 体 与 酶 的 结 合 力 较 弱 ， 在 高 离 子 强度 下 酶 易 从 载 体 上 脱 落 吸 附 法 （ 制 备 的 工 艺 ）o 水 相 固 定 化 法 这 是 最 常 见 的 吸 附 固 定 化 方 法 ， 即将 酶 溶 解 于 缓 冲 液 中 ， 加 入 载 体 ， 振 荡 或 搅 拌 一 定时 间 后 ， 抽 滤 、 洗 涤 、 冷 冻 干 燥 即 可 得 固 定 化 酶 o 载 体 表 面 涂 布 法 将 酶 溶 入 少 量 缓 冲 液 中 ， 加 入 载体 ， 混 合 均 匀 ， 冷 冻 干 燥 可 得 固 定 化 酶 。 此 法 相 当于 直 接 将 酶 涂 布 于 载 体 上 ， 避 免 了 水 相 固 定 化 中 酶的 大 量 流 失o 溶 剂 沉 淀 法 即 在 低 温 下 向 含 有 载 体 的 脂 肪 酶 液 中加 入 酶 的 有 机 溶 剂 作 沉 淀 剂 (如 丙 酮 )使 酶 析 出 ， 沉淀 在 载 体 表 面 。 此 法 所 得 固 定 化 酶 酶 活 性 较 高 ， 载体 性 质 对 固 定 化 无 明 显 影 响 ， 但 酶 在 载 体 表 面 分 布不 均 匀 吸 附 法 （ 制 备 的 工 艺 ）o 游 离 固 定 化 法 将 具 有 一 定 亲 水 性 的 载 体 分 散 于 疏 水 溶 剂 中 ，另 将 酶 粉 溶 入 少 量 缓 冲 液 的 酶 液 加 入 ， 振 荡 可 搅 拌 一 定 时 间 后 ，便 得 固 定 化 酶 。 其 原 理 是 ： 亲 水 性 载 体 可 在 其 表 面 形 成 一 层 水膜 ， 酶 分 子 不 溶 于 溶 剂 ， 只 能 存 在 于 这 层 水 膜 中 ， 因 而 可 以 完全 被 固 定 化 o 微 晶 体 法 将 可 结 晶 的 物 质 和 酶 溶 液 混 合 在 一 起 ， 然 后 滴 入 亲水 有 机 溶 剂 中 ， 当 可 结 晶 物 质 结 晶 析 出 时 ， 酶 就 有 规 则 吸 附 在晶 体 表 面 上o 电 沉 积 法 。 在 酶 溶 液 中 放 置 两 个 电 极 ， 在 电 极 临 近 加 入 载 体 ，通 电 后 ， 酶 移 向 电 极 ， 并 沉 积 到 载 体 表 面 的 固 定 化 方 法 。 采 用这 种 方 法 时 需 事 先 确 定 载 体 和 酶 在 电 场 中 是 否 会 分 解 和 失 活 。在 沉 积 过 程 中 和 酶 活 性 、 稳 定 性 有 关 的 某 些 离 子 如 果 发 生 移 除 、损 漏 ， 那 么 就 必 须 即 时 补 充 、 替 代 。 (2) 共 价 结 合 法 o 借 助 共 价 键 将 酶 的 活 性 非 必须 侧 链 基 团 或 细 胞 表 面 基 团（ 如 氨 基 、 羧 基 、 羟 基 、 巯基 、 咪 唑 基 等 ） 和 载 体 的 功能 基 团 进 行 偶 联 以 达 到 固 定化 目 的 方 法 。o 此 法 得 到 的 固 定 化 酶 结 合 牢固 、 稳 定 性 好 、 利 于 连 续 使用 ， 因 此 它 是 目 前 应 用 最 多的 一 类 固 定 化 酶 的 方 法 。 共 价 偶 联 法 的 优 点 ： 得 到 的 固 定 化 酶 结 合 牢 固 、 稳 定 性好 、 利 于 连 续 使 用 。共 价 偶 联 法 的 缺 点 ： 载 体 活 化 的 操 作 复 杂 ， 反 应 条 件 激烈 ， 需 要 严 格 控 制 条 件 才 可 以 获 得 较 高 活 力 的 固 定 化 酶 。同 时 共 价 结 合 会 影 响 到 酶 的 空 间 构 象 ， 从 而 对 酶 的 催 化活 性 产 生 影 响 。共 价 偶 联 法 的 优 点 、 缺 点 共 价 结 合 法 example 纤 维 素 +盐 酸 甲 醇CMC 甲 酯 肼CMC 酰 肼CMC 叠 氮 化 物 NH 2 酶亚 硫 酸 钠盐 酸固 定 化 酶 CH2CO-NH 酶 CMC CH2COOH制 备 酰 肼叠 氮 化 物羧 甲 基 纤 维 素 叠 氮 法 制 备 固 定 化 葡 萄 糖 淀 粉 酶 程 序l重 氮 法l溴 化 氰 法l烷 基 化 （ 三 氯 匀 三 嗪 ）l叠 氮 法 A 重 氮 法o 反 应 式 及 原 理 B 叠 氮 法o 例o 用 羧 甲 基 纤 维 素 叠 氮 衍 生 物 制 备 固 定 化 胰 蛋白 酶 ， 步 骤 如 下 ：o 酯 化o 肼 解o 叠 氮 化o (4) 偶 联 B 叠 氮 法o 对 含 有 羧 基 的 载 体 ， 与 肼 基 作 用 生 成 含 有 酰 肼 基 团 的 载 体 ， 再 与 亚硝 酸 活 化 ， 生 成 叠 氮 化 合 物 。 最 后 与 酶 偶 联 。与 酶 中 的 氨 基 、 羟 基 、 巯 基 反 应 。 C 烷 基 化 反 应 法o 含 羟 基 的 载 体 可 用 三 氯 三 嗪 等 多 卤 代 物 进 行 活化 ， 形 成 含 有 卤 素 基 团 的 活 化 载 体 。与 酶 中 的 氨 基 、 羟 基 、 巯 基 反 应 。 D 硅 烷 化 法o 多 孔 玻 璃 特 点 ：o 机 械 强 度 好 ， 表 面 积 大 。o 耐 有 机 溶 剂 和 微 生 物 破 坏 。 载 体 可 以 再生 ， 寿 命 长 等 。 D 硅 烷 化 法o 一 般 常 用 的 载 体 ： 多 孔 玻 璃 ， 多 孔 陶 瓷 。 D 硅 烷 化 法 D 硅 烷 化 法 D 硅 烷 化 法 E 溴 化 氰 法o 本 方 法 主 要 用 溴 化 氰 （ CNBr） 活 化 多 糖 类 物 质 。如 纤 维 素 、 葡 聚 糖 、 琼 脂 糖 等 ， 其 中 以 琼 脂 糖为 载 体 的 占 多 数 （ 大 孔 网 状 结 构 ） 。 用 溴 化 氰法 活 化 琼 脂 糖 制 备 得 到 的 固 定 化 酶 目 前 使 用 很广 ， 特 别 用 作 亲 和 层 析 ， 有 着 良 好 的 性 能 。 E 溴 化 氰 法与 酶 中 的 氨 基 反 应 1) 载 体 的 物 化 性 质 要 求 载 体 亲 水 (避 免 吸 附 )， 并 且 有一 定 的 机 械 强 度 和 稳 定 性 ， 同 时 具 备 在 温 和 条 件 下 与 酶结 合 的 功 能 基 团 。2) 偶 联 反 应 的 反 应 条 件 必 须 在 温 和 pH 、 中 等 离 子 强 度和 低 温 的 缓 冲 溶 液 中 。3) 所 选 择 的 偶 联 反 应 要 尽 量 考 虑 到 对 酶 的 其 它 功 能 基团 副 反 应 尽 可 能 少 。4) 要 考 虑 到 酶 固 定 化 后 的 构 型 ， 尽 量 减 少 载 体 的 空 间位 阻 对 酶 活 力 的 影 响 。共 价 偶 联 法 固 定 化 酶 的 几 个 影 响 因 素共 价 偶 联 法 成 功 的 关 键 在 于 载 体 的 选 择 、 偶 联 反 应 、偶 联 反 应 过 程 中 的 活 性 保 护 和 偶 联 量 的 多 少 。 此 法 固定 化 细 胞 的 报 导 甚 少 ， 它 的 发 展 有 赖 于 新 的 温 和 偶 联方 法 和 生 物 相 容 性 好 的 偶 联 试 剂 的 开 发 (3) 交 联 法o 利 用 双 功 能 或 多 功 能 试剂 在 酶 分 子 间 、 或 酶 分子 与 惰 性 蛋 白 间 进 行 交联 反 应 以 制 备 固 定 化 酶的 方 法 。o 常 用 的 试 剂 有 戊 二 醛 、甲 苯 二 异 氰 酸 酯 、 乙 烯 -马 来 酸 酐 共 聚 物 等 。o 交 联 法 操 作 简 便 ， 但 交联 反 应 往 往 比 较 激 烈 ，许 多 酶 容 易 在 固 定 化 过程 中 失 活 ， 酶 回 收 率 不高 。 交 联 法o 发 生 作 用 的 氨 基 酸 残 基 ： 酪 氨 酸 的 酚 基 胱 氨 酸 的 SH 巯 基 N 末 端 的 a 氨 基o 常 用 的 双 功 能 或 多 功 能 试 剂 ： 戊 二 醛 聚 甲 叉 双 碘 乙 酰 胺 双 重 氮 联 苯 胺 共 价 交 联 法 的 四 种 形 式1） 酶 直 接 交 联 法 在 酶 液 中 加 入 适 量 多 功 能 试 剂 ， 使 其 形 成不 溶 性 衍 生 物 。 固 定 化 依 赖 于 酶 与 试 剂 的 浓 度 、溶 液 pH 和 离 子 强 度 、 温 度 和 反 应 时 间 之 间 的 平衡 。 操 作 简 单 ， 但 是 缺 乏 选 择 性 ， 活 力 回 收 往 往不 高 。 2 ） 酶 辅 助 蛋 白 交 联 ： 当 可 得 到 的 酶 量 有 限 ， 可 以 使 用 第 二 个 “ 载体 ” 蛋 白 来 增 加 蛋 白 质 浓 度 ， 从 而 使 酶 与 惰 性 蛋白 共 交 联 的 方 法 。 这 种 “ 载 体 ” 蛋 白 即 辅 助 蛋 白 ， 可 以 是 白 蛋 白 、明 胶 、 血 红 蛋 白 等 。 3） 吸 附 交 联 法 ：此 法 先 将 酶 吸 附 在 硅 胶 、 皂 土 、 氧 化 铝 、 球 状酚 醛 树 脂 或 其 他 大 孔 型 离 子 交 换 树 脂 上 ， 再 用戊 二 醛 等 双 功 能 试 剂 交 联 ， 用 此 法 所 得 固 定 化酶 也 可 称 为 壳 状 固 定 化 酶 。 4） 载 体 交 联 法 ： 用 多 功 能 试 剂 的 一 部 分 功 能基 团 化 学 修 饰 高 聚 物 载 体 ， 而 其 中的 另 一 部 分 功 能 基 团 偶 联 酶 蛋 白 。 (4)包 埋 法o 通 过 物 理 或 化 学 的 方 法 将 酶 或 细 胞 限 制 在 一 定 的 空 间 范 围 内 ，底 物 和 产 物 能 自 由 扩 散 ， 从 而 达 到 重 复 利 用 生 物 质 的 一 种 固定 化 方 法 。 此 方 法 是 固 定 化 细 胞 的 最 主 要 方 法 。o 包 埋 法 可 分 为 格 型 包 埋 和 微 囊 型 包 埋 。 前 者 是 将 酶 或 细 胞 分散 包 埋 在 聚 合 物 的 胶 格 中 ， 如 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 、 卡 拉 胶 、 聚乙 烯 醇 、 海 藻 酸 钙 等 ； 后 者 是 将 一 定 量 的 酶 或 细 胞 包 在 半 透膜 内 ， 如 尼 龙 膜 、 醋 酸 纤 维 、 NaCS/PDMDAAC胶 囊 等 。 此 法制 备 条 件 温 和 、 生 物 相 容 性 好 ， 但 仅 可 用 于 低 分 子 量 的 底 物 ，且 常 受 扩 散 限 制 。 微 胶 囊 特 点o 微 囊 直 径 几 微 米 几百 微 米 。o 低 分 子 底 物 可 以 自 由通 过 并 进 入 微 囊 内 。o 酶 本 身 是 高 分 子 物 质不 能 通 过 微 囊 而 被 留在 微 囊 中 ，o 外 部 的 蛋 白 分 解 酶 、抗 体 等 高 分 子 物 质 也无 法 进 入 微 囊 内 E EECo-enzymesSubstratesProducts Enzymes Macromoleculesoutside the capsulesCapsule membrane 包 埋 法 的 优 点在 于 它 是 一 种 反 应 条 件 温 和 、 很 少 改 变 酶 结 构 但 是 又较 牢 固 的 固 定 化 方 法 。 包 埋 法 的 缺 点是 只 有 小 分 子 底 物 和 产 物 可 以 通 过 高 聚 物 网 架 扩 散 ，对 那 些 底 物 和 产 物 是 大 分 子 的 酶 并 不 适 合 。 这 是 由 于高 聚 物 网 架 会 对 大 分 子 物 质 产 生 扩 散 阻 力 导 致 固 定 化酶 动 力 学 行 为 改 变 ， 使 活 力 降 低 。包 埋 法 的 优 点 、 缺 点 微 囊 化 制 备 方 法微 囊 法 主 要 将 酶 封 装 在 胶 囊 、 脂 质 体 和 中 空 纤 维 中 。 胶 囊和 脂 质 体 主 要 用 于 医 学 治 疗 ， 中 空 纤 维 主 要 适 于 工 业 使用 。微 囊 制 备 方 法（ 1） 界 面 沉 淀 法 是 一 种 简 单 的 物 理 微 囊 化 法 ， 它 是 利 用 某些 高 聚 物 在 水 相 和 有 机 相 的 界 面 上 溶 解 度 较 低 而 形 成 的皮 膜 将 酶 包 埋 。（ 2） 界 面 聚 合 法 有 机 溶 液 中 添 加 表 面 活 性 剂 使 之 乳 化 形 成油 包 水 结 构 ,再 用 单 体 分 子 在 界 面 聚 合 ,达 到 包 埋 目 的 的一 种 方 法 。 （ 3） 原 位 聚 合 没 有 界 面 发 生 的 聚 合 反 应 成 膜 A 乳 化 分 散 ： 取 含 有 酶 和 亲 水 性 单 体 的 水 溶 液 ， 在 不溶 于 水 的 有 机 溶 媒 中 充 分 乳 化 。B 表 面 聚 合 ： 将 含 有 疏 水 性 单 体 的 有 机 溶 媒 加 入 到 上述 乳 化 液 中 ， 发 生 聚 合 反 应 ， 生 成 的 薄 膜 把 酶 包 围 起来 形 成 微 型 胶 囊 球 。C 清 洗 ： 反 应 完 成 后 ， 用 有 机 溶 剂 洗 去 未 反 应 的 剩余 单 体 1界 面 聚 合 法 微 胶 囊 的 制 备 （ example)-原 位 聚 合o NaCS (Sodium Cellulose Sulphate） 纤 维 素 硫 酸 钠 o PDMDAAC (Polydimethyldiallylammonium Chloride，聚 二 甲 基 二 烯 丙 基 氯 化 铵o 这 两 种 物 质 均 是 能 溶 于 水 的 聚 电 解 质 。 NaCS是 聚 阴离 子 化 合 物 ， PDMDAAC为 聚 阳 离 子 化 合 物 ， 当 这 两种 带 不 同 电 荷 的 物 质 混 合 时 ， 在 两 者 的 界 面 发 生 络 合反 应 ， 生 成 多 聚 电 解 质 复 合 体 （ PEG， Polyelectrolyte Complexe， 形 成 了 一 层 半 透 膜 。 OO* O *HO OHCH2OSO3-Na+ HOH2C nOHHOH 2C H2C *N+H3C CH3* Cl- n NaCS-PDMDAAC微 胶 囊 制 备 的 反 应 过 程 示 意 图 NaCS PDMDAAC PDMDAACro NaCSro r i rarb 固 定 化 酶 的 制 法 及 其 特 性 比 较 特 性 制 备 方 法共 价 键结 合 法 离 子结 合 法 物 理吸 附 法 包 埋 法制 法 难 易 易 难酶 活 力 高 高 高低底 物 特 异 性 易 变 不 变 不 变 不 变结 合 能 力 强 中 弱 弱再 生 不 可 可 能 可 能 不 可交 联 法难中易 变强不 可 固 定 化 酶 的 保 存 方 法使 用 时 固 定 化 酶 的 保 存 是 一 个 很 重 要 的 环 节 。 1 真 空 冷 冻 干 燥 保 存 （ 长 期 保 存 ） 2 低 温 保 存 3 多 孔 玻 璃 的 无 机 质 载 体 比 纤 维 素 等 的 有 机 质 载 体 更 适 于 长 期 保 存 。 4 无 机 质 载 体 中 ， 以 重 氮 结 合 法 制 备 的 固 定 化 酶 具 有 较 好 的 保 存 性 。 (三 ) 固 定 化 酶 特 性固 定 化 后 酶 会 发 生( )（ 载 体 酶 ） 构 象 变 化 微 扰 立 体 屏 蔽 酶 特 异 性 (Km) 稳 定 性 以 及 最 适 温 度( )（ 载 体 底 物 ） 分 配 效 应 扩 散 效 应 最 适 pH变 化 立 体 屏 蔽 ： 是 由 于 载 体 的 孔 隙 太 小 ， 或 是 由 于固 定 化 的 方 式 与 位 置 不 当 ， 给 酶 的 活 性 中 心或 调 节 中 心 造 成 了 空 间 障 碍 ， 因 而 底 物 与 效应 物 无 法 和 酶 接 触 ， 从 而 影 响 酶 活 性 的 一 种效 应 。 这 种 效 应 也 难 于 定 量 描 写 ， 多 见 于 包埋 ， 吸 附 法 或 共 价 偶 联 法 。微 扰 ： 是 由 于 载 体 的 亲 水 、 疏 水 性 质 和 介 质 的介 电 常 数 等 直 接 影 响 酶 的 催 化 能 力 或 酶 对 效应 物 作 出 反 应 能 力 的 一 种 效 应 。 这 种 效 应 更难 于 定 量 描 写 和 预 见 ， 但 是 通 过 改 变 载 体 与介 质 的 性 质 可 作 出 判 断 与 调 节 。 空 间 障 碍 效 应 (立 体 屏 蔽 ) 固 定 化 之 后 ， 由 于 酶 的 空 间 自 由 度 受 到 限 制 (因 为 载体 的 空 隙 太 小 ， 或 者 固 定 化 方 式 与 位 置 不 当 ， 给 酶的 活 性 部 位 造 成 了 空 间 屏 障 )， 使 酶 分 子 的 活 性 基 团不 易 于 底 物 或 效 应 物 接 触 ， 影 响 酶 分 子 的 分 子 活 性中 心 对 底 物 的 定 位 作 用 ,所 造 成 的 对 固 定 化 酶 的 活 力的 影 响 效 应 ， 被 称 为 空 间 障 碍 效 应 。 分 配 效 应 由 于 载 体 和 底 物 的 性质 差 异 引 起 了 微 环 境和 宏 观 环 境 之 间 的 性质 不 同 。 微 环 境 是 在固 定 化 酶 附 近 的 局 部环 境 ， 而 将 主 体 溶 液称 为 宏 观 环 境 。 由 这种 不 同 造 成 的 底 物 、产 物 和 各 种 效 应 物 在两 个 环 境 之 间 的 不 同分 配 ， 被 称 为 分 配 效应 。 扩 散 限 制 效 应 酶 固 定 化 使 生 物 催 化 反 应 从 均 相 转 化 为 多 相 ， 于 是 产 生 了 扩散 阻 力 ： 1） 、 外 扩 散 阻 力 是 底 物 从 宏 观 环 境 向 酶 颗 粒 表 面 传 递 过 程 中的 一 种 扩 散 限 制 效 应 ， 它 发 生 在 反 应 之 前 ， 发 生 在 固 定 化 颗粒 周 围 的 液 膜 层 。 它 会 使 底 物 在 固 相 酶 周 围 形 成 浓 度 梯 度 ，通 过 增 加 搅 拌 速 度 和 底 物 流 速 的 方 法 可 以 减 少 外 扩 散 效 应 。 2） 内 扩 散 阻 力 是 指 底 物 分 子 达 到 固 相 酶 表 面 后 传 递 到 酶 活 性部 位 时 的 一 种 扩 散 阻 力 ， 它 与 催 化 反 应 同 时 进 行 。 载 体 小 而 弯 曲 的 细 孔 是 产 生 内 扩 散 阻 力 的 要 原 因 。 因 此 使 用低 分 子 量 底 物 ， 小 的 粒 径 、 载 体 孔 尽 可 能 大 而 直 且 互 相 连 通 ，或 仅 仅 将 酶 固 定 在 载 体 表 面 都 可 以 降 低 这 种 内 扩 散 阻 力 。 固 定 化 酶 的 特 性具 体 表 现 在 如 下 特 性 ：o 稳 定 性 (一 般 升 高 ) 1)固 定 化 后 的 酶 与 载 体 多 点 连 接 ， 可 防 止 酶 分 子 伸 展 变 形 。 2)抑 制 自 降 解 ， 提 高 了 酶 稳 定 性o 最 适 温 度 变 化 （ 一 般 升 高 ， 但 有 些 酶 仍 然 会 降 低 ，如 烷 基 化 固 定 的 氨 基 酰 化 酶 ）o 最 适 pH （ 受 底 物 影 响 和 载 体 影 响 发 生 偏 移 动 ）o 底 物 特 异 性 （ 由 于 空 间 障 碍 妨 碍 底 物 接 触 而 影 响Km值 ） 固 定 化 酶 最 适 pH变 化o 底 物 （ 扩 散 限 制 ）如 酸 性 底 物 停 留 在 酶分 子 周 围 ， 使 酶 表 面pH降 低 ， 需 要 升 高 溶液 pH值 才 能 达 到 原 来最 优 pH 氢 离 子 底 物 滞 留 在 酶 表 面 降 低 宏 观 H +(升 高 pH) 固 定 化 酶 最 适 pH变 化o 载 体 （ 分 配 效 应 ）阴 离 子 载 体 要 达 到 自 由 酶表 面 氢 离 子 水平 （ 最 优 pH） ,必 须 升 高 宏 观溶 液 中 OH浓 度 ,减 少 分 配 进 入载 体 的 氢 离 子 二 细 胞 的 固 定 化o 细 胞 固 定 化 所 用 的 方 法o 固 定 化 细 胞 的 特 性1、 可 增 殖 ， 细 胞 密 度 大 ， 可 获 得 高 度 密 集 而 体 积 小 的 生 产 菌 集 合 体2、 发 酵 稳 定 性 好 ， 可 以 较 长 时 间 反 复 使 用 或 连 续 使 用 。3、 发 酵 液 中 含 菌 体 较 少 ， 有 利 于 产 品 分 离 纯 化 。4、 有 利 于 需 要 辅 酶 和 多 酶 系 统 才 能 进 行 的 反 应 。 (一 ) 细 胞 固 定 化 所 用 的 方 法o 吸 附 法 （ 依 据 细 胞 特 性 选 择 吸 附 载 体 ） (1) 酵 母 （ 负 电 荷 ） 多 孔 陶 瓷 和 塑 料 (2) 霉 菌 （ 菌 丝 体 长 ） 金 属 网 丝 (3) 植 物 细 胞 中 孔 纤 维 外 壁 (4) 动 物 细 胞 （ 贴 壁 细 胞 ） 容 器 壁 细 胞 固 定 化 所 用 的 方 法o 包 埋 法 包 埋 实 质 上 是 酶 周 围 聚 合 (连 接 )的 过 程(1)温 度 诱 导 的 交 联 琼 脂 （ 机 械 强 度 差 ， 扩 散 困 难 ） 甲 叉 菜 胶 明 胶(2) 离 子 诱 导 交 联 海 藻 酸 钙(3)光 等 诱 导 的 交 联 1) 聚 丙 烯 酰 胺 2)光 交 联 树 脂 （ 聚 氨 酯 预 聚 物 ， 光 敏 剂 ， 光 ） 2.4%左 右 的 卡 拉 胶 ， 70 溶 解 , 再 冷 却 到 42 , +10%左 右 的 细 菌 菌 体 (预 热 到 42 ） 迅 速 混 合 均 匀 4 冰 箱 放 置 大 约 30min 取 出 后 切 成 3 3mm的 小 颗 粒 Example:卡 拉 胶 包 埋 Example 海 藻 酸 钙 包 埋 法将 水 溶 性 的 海 藻 酸 钠 配 成 水 溶 液 ，并 把 酶 或 细 胞 分 散 在 其 中 ， 然 后 将其 滴 入 凝 固 浴 中 （ 常 用 CaCl2 溶液 ） ， 使 海 藻 酸 钠 中 的 Na+， 部 分被 Ca+所 取 代 而 形 成 由 多 价 离 子 交联 的 离 子 网 络 凝 胶 。 海 藻 酸 钠 Ca+ Ca+ro 海 藻 酸 钠ro ri rarb注 意 ：(1) 乳 酸 和 磷酸 等 对 其 干 扰 (2) capsule和bead区 别 ； 正滴 和 反 滴 的 区别 Exmaple聚 丙 烯 酰 胺 包 埋 固 定 化 细 胞酶 液丙 烯 酰胺N， N双 丙 烯 酰 胺 催 化 剂 为 过 硫 酸 钾 、 核 黄 素光 照 聚 合 反 应 凝 胶 酶 块固 定 化酶 切割 (二 ) 固 定 化 细 胞 的 特 性o 对 菌 体 提 高 了 细 胞 密 度 ， 提 高 产 率o 对 植 物 分 散 了 细 胞 （ 用 于 研 究 或 利 于 传 递 底 物 ）o 对 动 物 由 于 容 易 和 底 物 分 离 ， 从 而 可 实 现菌 体 生 长 和 发 酵 条 件 的 控 制 细 胞 特 性 比 较 (固 定 化 中 要 注 意 事 项 ）细 胞 种 类 植 物 细 胞 微 生 物 细 胞 动 物 细 胞细 胞 大 小 /um 20-300 1-10 10-100倍 增 时 间 /h 12 0.3-6 15营 养 要 求 简 单 简 单 复 杂光 照 要 求 大 多 数 要 光 照 不 要 求 不 要 求对 剪 切 力 敏 感 大 多 数 不 敏 感 敏 感 主 要 产 物 色 素 、 药 物 、 香 精 、酶 等 醇 、 有 机 酸 、 氨 基 酸 、抗 生 素 、 核 苷 酸 、酶 疫 苗 、 激 素 、抗 体 、 酶 三 辅 酶 的 固 定 化o 原 因有 机 辅 因 子 中 具 有 某 些 特 殊 的 化 学 基 团 ， 参 与 酶的 催 化 反 应 中 有 机 辅 因 子 在 使 用 过 程 中 要 流 失 ，并 且 不 能 自 行 再 生 有 机 辅 因 子 价 格 昂 贵工 业 上 应 用 全 酶 的 关 键 是 有 机 辅 因 子 的 保 留 和 再生 辅 酶 的 固 定 化o 方 法 固 定 化 方 法 与 酶 相 似 ， 一般 采 用 溴 化 氰 法 ， 碳 二 亚胺 法 以 及 重 氮 偶 联 法 等 共价 偶 联 ， 或 将 其 进 行 适 当的 化 学 修 饰 后 固 定 在 超 滤器 中o 问 题 辅 酶 固 定 化 必 须 解 决 辅 酶在 多 个 酶 之 间 传 递 的 障 碍 。 辅 酶 的 固 定 化 （ example）