大专生物化学专题一胶原蛋白的提取

生 物 化 学 实 用 技 术章 宇 宁 2012.3 胶 原 蛋 白 是 一 种 极 其 重 要 的 结 构 蛋 白 ， 广泛 存 在 于 动 物 的 骨 、 腱 、 肌 鞘 、 韧 带 、 肌膜 、 软 骨 和 皮 肤 中 。 占 哺 乳 动 物 体 内 蛋 白 质 总 量 的 25%30%，相 当 于 体 重 的 6% 至 少 有 19种 不 同 的 类 型 一 种 白 色 、 不 透 明 、 无 支 链 的 纤 维 蛋 白 质 通 常 由 3 条 多 肽 链 组 成 ， 每 条 链 都 有 左 手 螺 旋 结 构 ，三 条 链 绕 成 右 手 超 螺 旋 。 螺 旋 区 段 之 外 的 部 分 常 发生 各 种 交 联 。 每 一 条 链 都 有 若 干 个 典 型 的 氨 基 酸 序 列 (-Gly-X-Y-) n 。 X、 Y 均 表 示 任 意 的 氨 基 酸 ,X 通 常 是 脯 氨酸 (Pro) , Y 通 常 指 羟 脯 氨 酸 (Hyp ) 胶 原 蛋 白 中 缺 少 Cys和 Try 制 造 食 品 止 血 ， 促 进 伤 口 愈 合 作 为 可 吸 收 的 支 架 材 料 、 缝 合 材 料 作 为 药 物 载 体 局 部 整 形 从 胶 原 蛋 白 较 为 丰 富 的 组 织 （ 例 如 皮 肤 和 肌 腱 ） 中提 取 传 统 来 源 ： 猪 牛 羊 皮 新 兴 来 源 ： 鱼 鳞 等 问 题 一 ： 如 何 从 原 料 中 提 取 蛋 白 ？ 问 题 二 ： 如 何 从 蛋 白 中 分 离 胶 原 蛋 白 ？ 问 题 三 ： 如 何 检 验 得 到 的 蛋 白 是 胶 原 蛋 白 ？ 前 处 理粗 分 级 （ 粗 提 ）细 分 级 （ 分 离 纯 化 ）作 业 一 ： 某 一 特 定 蛋 白 质分 离 提 纯 的 一 般 程 序 是 什么 ？ 破 碎 组 织 细 胞 ， 使 蛋 白 更 好 地 与 外 界 条 件 接 触 尽 量 保 持 蛋 白 的 天 然 构 象 和 生 物 活 性 注 意 控 制 条 件 必 要 时 加 入 蛋 白 保 护 剂 可 以 先 将 某 一 细 胞 组 分 分 离 出 来动 物 材 料 ： 除 脂 肪 组 织 - 电 动 捣 碎 机 、 匀 浆 器 、 超 声 波植 物 组 织 ： 去 种 皮 - 石 英 砂 、 玻 璃 粉细 菌 细 胞 ： 超 声 波 震 荡 、 砂 研 磨 、 高 压 、 溶 菌 酶 称 取 新 鲜 猪 皮 100g， 用 氯 仿 /乙 醇 （ 2:1）溶 液 对 其 进 行 脱 脂 后 切 除 皮 下 脂 肪 ， 去 毛并 细 切 。 将 用 蒸 馏 水 洗 涤 后 的 组 织 小 块 放入 高 速 组 织 捣 碎 机 中 捣 碎 成 糊 状（ 12000r/min） ， 用 含 4.5mol/L NaCl的 0.05mol/L Tris-HCl缓 冲 液 （ pH 7.5）充 分 洗 涤 以 去 除 脂 质 及 血 清 等 成 分 ， 低 温离 心 （ 8000r/min， 30min， 4OC） 。 第 一 步 ： 将 蛋 白 与 材 料 分 开 ， 使 其 进 入 溶 液 中 酸 溶 碱 溶 盐 溶 酶 解 注 意 根 据 所 要 提 取 的蛋 白 质 的 性 质 选 择 合适 的 粗 分 级 方 法 提 取 胶 原 蛋 白 常 使 用 的 溶 剂 是 中 性 盐 溶 液 (0.152mol/L NaCl)或 是 稀 醋 酸 溶 液 。 前 者 只 适 合 提 取 组 织 中 最 新 合 成的 胶 原 以 及 交 联 度 可 以 忽 略 的 胶 原 。 稀 酸 ， 例 如 0.5mol/L醋 酸 ， 柠 檬 酸 缓 冲 液 ， pH值 在 23之 间 的 盐 酸 溶 液 ， 要 比 中 性 盐 溶 剂 更 为 有 效 ， 但 仍 只 能 溶解 出 组 织 中 大 约 2%的 胶 原 。 利 用 10%的 NaOH溶 液 共 同 处 理 组 织 48h左 右 ， 可 以 溶 解出 大 部 分 胶 原 。 与 不 溶 性 胶 原 结 合 在 一 起 的 脂 肪 被 皂 化 ，非 螺 旋 的 端 肽 被 切 除 ， 胶 原 纤 维 瓦 解 。 最 终 所 得 胶 原 的 大小 和 分 子 质 量 ， 取 决 于 处 理 时 间 以 及 碱 的 浓 度 。 酶 可 以 将 胶 原 蛋 白 分 子 的 端 肽 切 除 或 部 分 水 解 ， 使 之 易 溶于 水 第 二 步 ： 用 简 便 且 处 理 量 大 的 方 法 去 除 无 机 物 等 杂质 ， 得 到 浓 缩 蛋 白 质 溶 液 盐 析 等 电 点 沉 淀 法 有 机 溶 剂 沉 淀 法 超 滤 如 蛋 白 相 互 差 异 较 大 ， 也 可 初 步 分 离 目 标蛋 白 可 逆 沉 淀 盐 析 法 (中 性 盐 沉 淀 法 )： 向 蛋 白 质 溶 液 中 加入 大 量 的 中 性 盐 ,使 蛋 白 质 脱 去 水 化 层 而 聚 集 沉淀 。 常 用 中 性 盐 有 (NH4)2SO4、 Na2SO4、 NaCl等 。有 机 溶 剂 沉 淀 法 ：常 用 与 水 互 溶 的 有 机 溶 剂 如 甲 醇 、 乙 醇 、 丙 酮 等 ，破 坏 水 膜 ， 使 其 沉 淀 。 蛋 白 质 的 等 电 点 ： 蛋 白 质 所 带 净 电 荷 为 零时 ， 所 处 溶 液 的 pH 值 即 为 该 蛋 白 质 的 等 电 点 。在 等 电 点 时 蛋 白 质 最 不 稳 定 ， 溶 解 度 最 小 。 利 用 具 有 一 定 大 小孔 径 的 微 孔 滤 膜 ，对 生 物 大 分 子 溶 液进 行 过 滤 ， 使 大 分子 保 留 在 超 滤 膜 上面 的 溶 液 中 ， 小 分子 物 质 及 水 过 滤 出去 ， 从 而 达 到 脱 盐或 浓 缩 的 目 的 。 进 一 步 分 离 纯 化 目 标 蛋 白 质 透 析 超 滤 凝 胶 过 滤 /层 析 /离 子 交 换 色 谱 密 度 梯 度 离 心 电 泳 等 电 聚 焦 在 粗 提 胶 原 蛋 白 溶 液 中 缓 慢 加 入 6mol/L NaOH至 pH=7， 冷 冻 离 心 去 除 沉 淀 ， 在 上清 液 中 加 入 NaCl搅 拌 ， 4保 存 过 夜 ； 离 心取 沉 淀 ， 用 稀 HAc溶 解 ， 将 溶 液 装 入 透 析袋 中 ， 用 0.1mol/L 的 Hac透 析 1天 ， 再 用蒸 馏 水 透 析 1天 。 电 泳 ： 带 电 颗 粒 在 电 场 中 向 电 荷 相 反 的 电极 移 动 的 现 象 不 同 的 蛋 白 质 颗 粒 的 大 小 、 形 状 、 所 带 的电 荷 、 等 不 同 ， 在 电 场 中 的 泳 动 速 度 各 异 ，因 而 可 聚 集 形 成 不 同 的 条 带 ， 从 而 达 到 分离 的 目 的 。 层 析 法 ： 离 子 交 换 层 析 法 凝 胶 过 滤 层 析 法 亲 和 层 析 法 吸 附 层 析 法 分 配 层 析 法 离子交换层析法 原 理 : 根 据 离 子 交 换 剂 与 蛋 白 质 进 行 离 子 交 换 ，再 利 用 适 当 的 缓 冲 液 洗 脱 ， 即 可 达 到 分 离具 有 不 同 电 荷 性 质 蛋 白 质 的 目 的 。 原 理 ： 混 合 物 流 经 装 有 凝 胶 颗 粒 （ 凝 胶 颗 粒 内部 具 有 大 量 一 定 大 小 的 微 孔 ） 的 层 析 柱 时 ，大 分 子 不 能 进 入 凝 胶 孔 内 ， 移 动 较 快 ， 并 最先 被 洗 脱 出 来 ； 小 分 子 能 不 同 程 度 的 自 由 出入 凝 胶 孔 内 外 ， 在 柱 内 经 过 的 路 程 较 长 ， 移动 速 度 较 慢 ， 最 后 被 洗 脱 出 来 。 亲 和 蛋 白配 基 原 理 ： 利 用 某 种 蛋 白 质 能 与 其 相 应 的 专 一 性配 基 进 行 特 异 的 可 逆 结 合 的 能 力 （ 亲 合 力 ）来 纯 化 生 物 大 分 子 。 原 理 ： 在 密 度 梯 度 介 质 （ 蔗 糖 或 甘 油 ） 中进 行 的 一 种 沉 降 速 度 离 心 。 混 合 物 加 至 制备 好 的 密 度 梯 度 介 质 中 ， 超 速 离 心 ， 各 种蛋 白 质 颗 粒 沉 降 到 与 自 身 密 度 相 等 的 介 质梯 度 时 ， 即 停 止 不 前 ， 最 终 形 成 各 自 独 立的 区 带 。