RNA干扰现象的发现.ppt

RNA干 扰 现 象 的 发 现 2001级 博 ： 潘 皎 导 师 ： 张 义 正 教 授 2003年 4月 24日 RNA干 扰 一 些 小 的 双 链 RNA可 以 高 效 、 特 异 地 阻 断 体 内特 定 基 因 表 达 ,促 使 RNA降 解 ,诱 使 细 胞 表 现出 特 定 基 因 缺 失 的 表 型 ,称 为 RNA干 扰 (RNA interference, RNAi,也 译 作 RNA干 预 或 者 干涉 )。 RNAi 一 种 新 的 遗 传 工 具n RNAi是 植 物 、 果 蝇 、 线 虫 和 很 可 能 包 括 哺 乳 动 物 在 内 的 许 多 生 物抵 抗 病 毒 感 染 和 限 制 转 座 子 运 动 的 一 种 自 然 存 在 的 防 御 机 制 。n RNAi可 以 作 为 一 种 简 单 、 有 效 的 代 替 基 因 敲 除 的 遗 传 工 具 ， 来 制备 特 定 基 因 缺 失 表 型 的 个 体 , 从 而 研 究 该 基 因 的 功 能 .它 正 在 功 能基 因 组 学 领 域 掀 起 一 场 真 正 的 革 命 ,并 将 彻 底 改 变 这 个 领 域 的 研 究步 伐 ,为 此 被 SCIENCE评 为 2002年 最 重 要 的 科 研 成 果 之 一 。 n 在 哺 乳 动 物 细 胞 中 用 siRNA (21 23核 苷 酸 长 的 小 分 子 干 扰 片 段 (small interfering RNAs,siRNAs,又 被 称 为 引 导 RNAs)。 能高 效 阻 断 某 个 特 定 基 因 的 表 达 ,这 项 技 术 在 疾 病 的 基 因 治 疗 上 也 有光 明 的 应 用 前 景 。 特 别 可 以 用 于 阻 断 某 些 突 变 基 因 的 表 达 ,或 者 由蛋 白 过 量 表 达 引 起 的 疾 病 。 共 抑 制 现 象 的 发 现 研 究 的 早 期 线 索 早 在 20年 前 ,来 自 于 美 国 和 荷兰 的 两 个 转 基 因 植 物 实 验 组 Richjorgensen和 同 事 ,在对 矮 牵 牛 (petunias)进 行 的 研 究 中 有 个 奇 怪 的 发 现 :将一 个 能 产 生 色 素 的 基 因 置 于 一 个 强 启 动 子 后 ,导 入 矮 脚牵 牛 中 ,试 图 加 深 花 朵 的 紫 颜 色 ,结 果 没 看 到 期 待 中 的深 紫 色 花 朵 ,多 数 花 成 了 花 斑 的 甚 至 白 的 。 jorgensen将 这 种 现 象 命 名 为 共 抑 制 (cosuppression),因 为 导 入的 基 因 和 其 相 似 的 内 源 基 因 同 时 都 被 抑 制 。 开 始 这 被认 为 是 矮 牵 牛 特 有 的 怪 现 象 ,后 来 发 现 在 其 他 许 多 植 物中 ,甚 至 在 真 菌 中 也 有 类 似 的 现 象 。 随 后 几 年 ,另 外 几 个 植 物 学 家 也 发 现 了 类 似 的现 象 。 如 Santa等 ,将 番 茄 病 毒 复 制 所 需 的 复制 酶 基 因 导 入 烟 草 中 ,以 阻 断 病 毒 的 生 活 周 期而 控 制 病 毒 的 生 长 ,但 有 些 烟 草 表 现 出 抗 病 毒的 特 性 ,而 另 外 一 些 则 相 反 。 随 后 ,在 植 物 病 毒实 验 中 也 观 察 到 共 抑 制 现 象 ,并 发 现 共 抑 制 具有 抗 病 毒 功 能 。 Quelling现 象 并 非 只 有 植 物 学 家 才 注 意 到 了 这 种 意 外 的 现 象 。意 大 利 的 Cogoni等 ,将 外 源 类 胡 萝 卜 素 基 因 导入 链 孢 霉 (Neurosporacrassa),结 果 转 化 细 胞中 内 源 性 的 类 胡 萝 卜 素 基 因 也 受 到 了 抑 制 。 而在 真 菌 转 基 因 实 验 中 这 种 共 抑 制 现 象 被 称 为“ quelling” 。 基 因 沉 默 n 转 录 阶 段 基 因 沉 默 (transcriptional gene silencing ,or TGS)： 对 于 部 分 植 物 来 说 ,转 基 因 引 发的 基 因 沉 默 可 能 是 因 为 基 因 特 异 的 甲 基 化 而 导 致 ,这 被称 为 转 录 阶 段 基 因 沉 默 . n 转 录 后 发 生 的 基 因 沉 默 (post transcriptional gene silencing ,or PTGS) 等,率先在发生的西红柿中检测出与被沉默基因同源的约25的短片段,而未发生的西红柿则不能检出25的 . ,1999,286(5441):950 952 RNA干 扰 现 象 的 发 现 线 虫 中 首 次 发 现 了 RNAi ： 首 次 发 现 dsRNA能 够 导 致 基 因 沉 默 的 线 索 来 源 于 秀 丽 新小 杆 线 虫 (Caenorhabditis.elegans)的 研 究 。 1995年康 乃 尔 大 学 的 研 究 人 员 Guo和 Kemphues尝 试 用 反 义 RNA (antisense RNA)去 阻 断 par1基 因 的 表 达 以 探 讨 该 基 因的 功 能 ,结 果 反 义 RNA的 确 能 够 阻 断 基 因 的 表 达 ,但 是 奇怪 的 是 ,注 入 正 义 链 RNA(sense RNA)作 为 对 照 ,也 同 样阻 断 了 基 因 的 表 达 。 , . . . , 1995,81:611-620. 这 个 奇 怪 的 现 象 直 到 3年 后 1998才 被 解 开 华 盛 顿 卡 耐 基 研 究院 的 Andrew Fire和 马 萨 诸 塞 大 学 癌 症 中 心 的 Craig Mello首 次 将双 链 dsRNA正 义 链 和 反 义 链 的 混 合 物 注 入 线 虫 ,结 果 诱 发 了比 单 独 注 射 正 义 链 或 者 反 义 链 都 要 强 得 多 的 基 因 沉 默 。 将 体 外 转录 得 到 的 单 链 纯 化 后 注 射 线 虫 时 ,基 因 抑 制 效 应 变 得 十 分 微弱 ,而 经 过 纯 化 的 双 链 能 够 高 效 地 特 异 性 阻 断 同 源 基 因 的 表达 。 实 际 上 每 个 细 胞 只 要 很 少 几 个 分 子 的 双 链 已 经 足 够 完全 阻 断 同 源 基 因 的 表 达 。 后 来 的 实 验 表 明 在 线 虫 中 注 入 双 链 不 单 可 以 阻 断 整 个 线 虫 的 同 源 基 因 表 达 ,还 会 导 致 其 第 一 代 子 代的 同 源 基 因 沉 默 。 他 们 将 这 种 现 象 称 为 干 扰 。 , .,1998,391:806811. n 潜 在 的 作 用 促 使 F 和 继 续 实 验 ,将一 种 能 够 表 达 与 22 基 因 同 源 的 双 链 的 基 因 工 程 细 菌喂 食 线 虫 ,结 果 线 虫 表 现 出 类 似 22缺 陷 的 表 型 。，1998，395：854n 后 继 的 实 验 表 明 将 线 虫 浸 入 双 链 中 同 样 可 以 诱 导 基 因 沉默 这 种 技 术 使 得 大 规 模 筛 选 线 虫 诱 导 的 功 能 缺 失突 变 体 成 为 可 能 ,并 引 发 后 继 的 大 量 针 对 这 种 模 式 生 物 基 因 敲 除 的研 究，1998，282：430431 n涡虫() ，1999 ，96：5045054n水螅() ，1999 ，214：211214n锥虫() ，1998 ，95：1468714692、 n真菌(）（neurospora crassa) ，1999，339：166169 n 在 果 蝇 (Drosophila)中 发 现 i Berstein E et al Nature 2001,409(6818):363-366n 在 拟 南 芥 中 发 现 i Wassnengger M et al plant Mol Biol 1998,37(2):349-362 n 在 小 鼠 中 发 现 i Wianny F et al Nat cell Biol 2000 ,2 (2):70-75 果 蝇 中 的 n 在 果 蝇 的 研 究 中 同 样 发 现 。 尽 管 采 用 能 生 产 的 酵 母 喂 食 果 蝇 的 实 验 以 失 败 告 终 ,但 是 通 过 显 微 注 射 或 者 通 过 基因 枪 将 注 入 果 蝇 胚 胎 中 、 或 者 将 带 有 反 向 重 复 序 列 的 导 入 果 蝇 中 能 够 引 发 基 因 沉 默 。n 来 自 于 冷 泉 港 研 究 组 和 麻 省 医 学 院 的 研 究 组 分 别 利 用 果 蝇 培 养 细 胞 和 果 蝇 胚 胎 ,将 外 源 转 染果 蝇 细 胞 2或 将 之 直 接 加 入 胚 胎 提 取 物 ,同 样 发 现 与 西 红 柿 非 常相 似 的 结 果 :加 入 的 被 特 异 地 切 割 成 21 23 的 ,而 且 这 些 具 有 核 酸 酶 活 性 的 21 23 的 能够 特 异 地 降 解 与 之 同 源 的 ,从 而 抑 制 相 应 基 因 的 表 达 。 . ,2000,404(6775):293296 . ,2000,101(1):2533 核 酸 酶 ( ) 最 近 , 研 究 组 从 果 蝇 中 成 功 地 分离 出 能 特 异 切 割 的 家族 核 酸 酶 ( )。 . ，2001,409(6818):363366 在 哺 乳 动 物 细 胞 中 的 研 究 最 近 , 等 在 实 验 中 发 现 哺 乳 动 物 细 胞 中 同 样 存 在 效应 。 他 们 将 一 种 特 殊 构 建 的 （ 对 称 性 3 突 出 2nt约 21nt） 双链 复 合 物 通 过 阳 离 子 脂 质 体 转 入 不 同 的 哺 乳 动 物 细 胞 中 ,包 括 细胞 和 人 胚 肾 293细 胞 等 ,观 察 到 了 可 重 复 的 ,序 列 特 异 性 的 。 的 序 列 专 一 性 要 求 非 常 严 谨 ,与 靶 之 间 一 个 碱 基 错 配 都 会显 著 削 弱 基 因 沉 默 的 效 果 。 他 们 还 发 现 ： 30 的 引 起 的 阻抑 效 应 是 广 泛 的 ,非 特 异 性 的 。 原 因 是 ： 30 的 可 诱 发 哺乳 动 物 细 胞 内 的 干 扰 素 系 统 ,它 能 激 活 两 种 酶 ,一 种 为 蛋 白 激 酶 ,激活 的 通 过 一 系 列 的 磷 酸 化 使 翻 译 起 始 因 子 2 失 活 ,导 致 翻译 抑 制 。 在 另 外 一 个 途 径 中 ,长 激 活 ,致 非 特异 的 降 解 。 , .,1999,13:31913197 n 2002年 5月 ,美 国 科 学 家 等 报 道 ,采 用 21个核 苷 酸 双 链 形 成 双 链 ,加 入 到 感 染 艾 滋 病 病 毒 的 细 胞中 ,24 后 ,可 减 少 艾 滋 病 病 毒 基 因 表 达 90%以 上 ,这 种 双 链 可 阻 断 艾 滋 病 病 毒 感 染 培 养 的 细 胞 。 7月 , 等 用 技 术 实 现 了 1病 毒 的 阻 抑 。n 2002年 7月 4日 , 自 然 杂 志 又 介 绍 了 美 国 科 学 家 等 人 将 合 成 的 双 链 和 通 过 载 体 将 双 链 形 成 小 发夹 状 的 双 链 直 接 注 入 鼠 的 肝 脏 ,并 将 肝 炎 病 毒 与 标 志 基 因相 连 后 感 染 鼠 肝 脏 ,这 种 双 链 或 双 链 发 夹 状 对 标 志 基因 的 表 达 抑 制 分 别 达 到 81%和 92 8%,表 明 这 两 种 双 链 均 可 明显 地 抑 制 成 体 鼠 肝 脏 内 导 入 的 肝 炎 病 毒 基 因 的 表 达 。 许 多 实 验都 证 明 利 用 可 以 直 接 和 有 效 地 起 到 抗 病 毒 的 作 用 。 21 的 双 链 复 合 物 在 哺 乳 动 物 细 胞 中 干预 成 功 为 基 因 作 用 的 研 究 提 供 了 一 种 新 的 工 具 ,原 来 要花 费 6个 月 至 一 年 的 时 间 才 能 明 确 一 个 哺 乳 动 物 细 胞 基因 如 何 关 闭 ,现 在 只 需 一 个 星 期 就 能 明 确 10个 基 因 的 关闭 ,使 工 作 进 程 大 大 加 快 。 可 以 预 见 , 作 为 一种 快 速 关 闭 基 因 的 途 径 ,将 会 越 来 越 多 地 用 于 哺 乳 动 物基 因 研 究 。 遗 传 学 通 过 基 因 突 变 筛 选 技 术 在 基 因 水 平 肯 定 线 虫 中 共 抑 制 、 和 分 享 共 同 的 基 因 ,具 有 相 同 的 作 用 形 式 ,即 介 导 的 靶 基 因 沉 默 。 导 入 不 仅 使 线 虫 、 果 蝇 、小 鼠 和 人 细 胞 中 相 应 基 因 表 达 抑 制 ,也 在 植 物 中 表 现 出 同 样 效 果 ,甚 至 把 注 射 到 线 虫 、 锥 体 虫 的 体 腔 中 ,远 距 离 组 织 及 1代 也 可 以 产 生 同 源 基 因 抑 制 ,同 样 在 植 物 韧 皮 部 注 射 可 遍 及 扩 散 到 整 个 植 株 体 产 生 ;,把 线 虫 浸 润 到 含 有 液 体 中 或 喂 养 表 达 的 工 程 菌 也 可 以 诱 发 ,而 在 植 物 中 把 吸 附 在 表 面 500 基 因 片 段 的 金 属 片 插 入 到 植物 中 ,在 侵 入 点 周 围 组 织 发 生 了 基 因 沉 默 。 因 此 , 普 遍 存在 于 各 种 生 物 ,具 有 抗 病 毒 、 稳 定 转 座 子 及 监 控 异 常 表 达 的 生 物 学 功 能 。 谢 谢 ！