从摇瓶到发酵罐的发酵放大问题

从摇瓶到发酵罐的发酵放大问题发酵发酵罐重复性标题:从摇瓶到发酵罐的发酵放大问题摘要:从摇瓶到发酵罐的发酵放大问题我在实验室50ml 250ml三角瓶做,7弋150rpm ;放大到300L发酵罐，转速180rpm （不能调），风量要控制在多少合适啊？这个细菌是微 好氧的。有一次，溶氧都降到2%了,反而结果还比前几次好。但是产物也只有摇瓶做的 50%。怎么优化啊？回复：溶氧控制在转速180rpm时，是比较扯淡的，因为转速不足以 把微量空气氧打散到促进气液两相的传质程度！（我在10L罐上关键词:发酵发酵罐重复性我在实验室50ml/250ml三角瓶做，37C 150rpm ;放大到300L发酵罐，转 速180rpm （不能调），风量要控制在多少合适啊？这个细菌是微好氧的。有一 次，容氧都降到2%了，反而结果还比前几次好。但是产物也只有摇瓶做的50%。 怎么优化啊？回复：溶氧控制在转速180rpm时，是比较扯淡的，因为转速不足以把微量空气氧打 散到促进气液两相的传质程度！（我在10L罐上得到的发酵中后期数字为 350rpm，高于此转速，溶氧将增加很大）此时的溶氧显示器数字显示出来的波动主要靠溶液流动促进传质,不是靠气液两 相间的传质，此时你通气量影响的是压力（压力高了，溶氧就增加了），多通的空气溶解了一小部分，大部分是“流掉”了，而不是用掉了 你先确保实验的重复性后，再好好搞下一步工厂里面因素比较复杂，好好亲临指导啊优化大罐需要考虑：罐压，接种量，pH范围，通气量范围，起使转速，温度，DO范围。这些都是必须考虑的，你可以适当固定1到2个条件，看看生长怎么样。穷孩子，发酵罐和摇瓶相差太大，因为整体的机制不甚相同，我觉得最大的区别在于1摇瓶靠的是离心力，而发酵罐是真正的剪切，有些菌种在摇瓶中生长良好，但到发酵罐上由于剪切作用而无法结团，所以很多时候两者是不一样的。2溶氧问题：上面几位说得很全了，我就不多说了:P3补料问题：我看楼主MM好像是学微生物的，很多微生物发酵都需要用到前体，而且是 流加式的，你在摇瓶上无法实现持续流加吧，但是发酵罐是可以的。4环境稳定问题：有些菌种，是需要维持恒定的pH来保持发酵进行的，摇瓶中我们无法监 测到（但是现在已经出现直接跟着检测系统的摇瓶系统）所以你无法维持一个恒定的pH。 发酵罐可以通过在线控制pH值恒定5数据：你做发酵，最重要的是得到合适的配方与工艺吧，往往在发酵罐上可以比较全地 反映出你的整个发酵状态，什么时间菌体疯狂生长，什么时间进入产素阶段，根据一些指标 可以看得出来，所以摇瓶只是表层，发酵罐才是深层，总之吧，摇瓶肯定是基础只有在摇瓶的基础上进行系统的发酵罐的研究才能真正适合生产。 再者，你就是由小罐到大罐的工艺操作还是不尽相同。仅供参考，大家多交流!微生物发酵的放大实验，要注意反应罐的培养温度，培养基浓度，PH值，搅拌转速，还要 不断的反应罐增加补料。温度好控制pH上罐子是可以调节的，在摇床上你只能定时取样检测溶氧就差的很大了，摇床上基本就是缺氧的，上罐子因为有通气所以在一定条件下能确保溶 氧，这样会导致用摇床摇菌的时间远远大于上罐子的时间，我现在做的菌，在摇床上基本是 16小时左右吧，上罐子就6、7个小时不锈钢最怕氯离子了，特别是盐酸酸的种类多了，看你需要补课的多，还是自己先 学一阵子先吧.选择硫酸或磷酸即可不知楼主为何选盐酸:sweat:不锈钢最怕氯离子啦，尤其是盐酸，有些用自来水的厂子都要严格控制水中氯的 含量！你们做多久啦？多大的罐子呀？发酵罐是压力容器，先停下来检修吧，不 然出了事就是人命关天的大事:cat3:主要看HCI在发酵过程中起什么作用，是否可以替换。如果不能替换，说明对CI离子代谢需要。可用盐酸盐替代。如果仅仅是调节pH那就选硫酸试试。另外就是发酵过程忌S元素离子。以上种种，需要试验选择。如何确定发酵罐中添加IPTG的时间（发酵罐,大肠杆菌，摇瓶培养）发酵罐大肠杆菌摇瓶培养标题:如何确定发酵罐中添加IPTG的时间（发酵罐，大肠杆菌，摇瓶培养）摘要:如何确定发酵罐中添加IPTG的时间（发酵罐，大肠杆菌,摇瓶培养）使用的是大肠杆菌 （Escherichia coli），在摇瓶培养时，是在OD为0 6-0 8时加入IPTG诱导，现在转到7L 的罐里，如何确定添加IPTG的时间？还是根据OD吗？关键词:发酵罐大肠杆菌摇瓶培 养关键词:发酵罐大肠杆菌摇瓶培养使用的是大肠杆菌（Escherichia coli），在摇瓶培养时，是在0D为0.6-0.8时加 入IPTG诱导，现在转到7L的罐里，如何确定添加IPTG的时间？还是根据OD 吗？时间一般选择在对数生长期，你可以先监测OD作出生长曲线，然后定。接种的 时间选择，对于最后高密度培养所能达到的OD值，和蛋白表达有很大的影响。 我一般在OD二10左右 加入（可参考）时间一般选择在对数生长期，你可以先监测OD作出生长曲线，然后定。 接种的时间选择，对于最后高密度培养所能达到的OD值，和蛋白表达有 很大的影响。我一般在OD二10左右加入（可参考）谢谢啊，我们现在发酵后OD基本就在10左右,所以我估计在OD23左右加， 还是打算做个生长曲线。根据大肠杆菌(Escherichia coli)基因工程(Genetic Engineering)菌罐体水平下 的质粒稳定性进行决定，质粒丢失率20%的基因工程(Genetic Engineering) 菌，可尝试OD=20,OD=30进行诱导，加大培养阶段后期补料用量；质粒丢 失率20%可尝试OD=3 ,OD=5,OD=10进行诱导；我们这边曾经成功做过 以上不同诱导菌密度下的发酵项目OD=3 ,OD=5 ,OD=10，OD=20,OD=30 进行诱导。罐体水平下大肠杆菌(Escherichia coli)基因工程(Genetic Engineering)菌的对 数生长期可以进行人为延长调整，通过补料控制、DO控制等可以达到延长对数 生长期，提高诱导起始菌密度，增大目标蛋白的最终产量。U.liuiulB.iii g/till4血ii卯ml2.hn 妙 ml1 血 11 妙!111营养物浓度与对数期生长速率和产量的关系，见下图营养物浓度咕対数期崔长速率和产暈只瑕尢收 羨量愛觀询V 生罠速崖和彘丈”收获童:受蠡响”夕时间作用方式；影响微生物的生K速率和总生K量.生艮限制囚了：凡是处于校低浓度范旧1从 可彩响生民速率和曲 体产量的营养物就称生艮限制因子.我这边做的1个大肠杆菌(Escherichia coli)基因工程(Genetic Engineering )菌项目不同诱导菌密度批发酵菌体生长情况比较，见下图：G-lnsulin生蔽曲线时间5)高密度培养技术，也就是高密度发酵技术，提高菌体的发酵密度，最终提高产物 的比生产率(单位体积单位时间内产物的产量)不仅可以减少培养体积，强化下 游分离提取，还可以缩短生产周期，减少设备投资从而降低生产成本，能极大的 提高产品在市场上的竞争力而高密度发酵工艺与优化控制技术在基因工程 (Genetic Engineering)类药物上的应用前景广阔，国内外技术空白较多。谢谢luckyliuh朋友的解答！比较规范的做法是先绘生长曲线，如果怕麻烦可以直接跟据经验。交流大肠杆菌高密度发酵一个无法解释的现象已有20人参与*-.上本人做大肠杆菌高密度发酵，在发酵进行1小时27分左右（误差不超过1分钟）时，溶氧 会上升，大概五分钟后会快速下降，下降的速度会比之前的快，但等达到之前的斜线处时, 速度又恢复正常。不同的接种量，不同的培养基，不同的罐子（5L、10L、100L、5000L）、无论种子是刚做好 的，还是4度放置了一夜的，都会有上面同样的现象出现，本人做大肠杆菌高密度发酵，不 论是A600做到200,还是做到50，基本上整个过程的绝大部分现象都能解释，也算是高手 了，唯有些处百思不得其解。有高手的话互相讨论啊！昨天没来的及上图，今天给大家补个图难道没有人观察到过这个现象吗？不同的接种量，即使接种量相差好几倍，仍然是“1小时27分出现诡异的现象？听上去像 是硬件系统譬如通气系统或者搅拌系统或者传感系统的问题.每次都有同样的现象，BL21、JM109、DH5a我用过的都有同样的现象，表达各种蛋白都有 这个现象，大概5分钟后恢复正常，对产品质量没有影响。我没遇到过这种现象，我用BL21（DE3）发酵时，3h溶氧回升，再过8-9h又重新长起来， 表达正常。楼主的大肠杆菌发酵OD能达到200啊，这个跟菌种有关系嘛？我发酵的时候前面都正常, 到OD600为35左右的时候就不长了，是怎么回事啊。跟菌种有关系，但是不大；只要整个发酵过程都能满足大肠生长的条件，绝大多数的菌种都 可以的，主要看你的控制工艺。一切条件都满足啊，但微量元素我就不敢确定啦，不晓得你们的微量元素是不是20UM/L。 你用的无机盐的培养基呀，加1%的蛋白胨，0.5%的酵母粉，三氯化铁0.2mM，其它微量元 素不加都可以的我用的是干酪素这一系列的培养基，当OD在10以前还翻倍增长，以后就以每小时2增长, 等的急死人。不晓得补料的速度对其有没得影响。还有就是溶氧20%和30%有很大区别 吗还是新手，有点罗嗦哈。溶氧只要 20以上就可以了，你的情况可能是补料速度限制了吧，我在诱导前只要一见到 溶氧上升就提高补料速度我是在每隔一个小时补料的，在0D长到2就开始补料，每小时500ml,加两次过后就加一升了，培养基应该还是充足的。难道你是慢慢流加的吗？ 你多大的罐子呀我一般都是流加的，10L的罐子我一般设计成主培养基6L,补料1.5L，从两小时开始补料， 补料速度约lml/min，到溶氧出现上升时补料速度周到2ml/min。你补料补的是什么呀，如果甘油浓度超过4.5 的话，很有可能会出现你生长缓慢的情况，我 考查过甘油浓度对菌生长的影响的，菌不会挂掉，不再添加甘油进去，过个三个多小时就又 会恢复原来的生长速度了我一般都是流加的，10L的罐子我一般设计成主培养基6L,补料1.5L，从两小时开始补料，补料速度约lml/min，到溶氧出现上升时补料速度周到2ml/min。.我们是没隔一个小时补料一次，在几分钟就完成了。我的也是10L的，每次补料1L。在后 期就看着溶氧上升就加料。boss 说这是行业内的一个未解之谜。越有鼓包，菌的性能越好。你们大肠杆菌高密度怎么做到200的？我们做死只能在120-130之间，我们是要表达目标蛋 白的，T7启动子，Lac诱导。诱导点延后到OD达到45以后，用氨水做氮源，甘油做碳源，DO达不到30%以上时补纯氧 我现在做的也和楼主的问题有些相似，就是发酵罐接种后4h左右溶氧回升，后会沉寂几小 时后又开始生长，我的表达产物表达得不好，很头疼，看完上面的交流后我觉得我可以试试 调整培养基试一试。据体是几个小时呀？如果是8个小时以上，很有可能是污染和种子退化的问题。培养基的话， 目前发现安琪的酵母粉和蛋白胨都不适合做大肠肝菌发酵。50 楼:Originally posted by viva-Ecoli at 2015-11-21 18:26:20 你们怎么做到100的？我们最高才50，很少达到，急死了.LB,玉米浆，TB, M9都可以做基础培养基在摇瓶里面做的培养基优化的数据，在罐子里面有用么(培养基，大肠杆菌，发酵，基因工程)培养基基因工程发酵大肠杆菌氮源因子分析生物量标题:在摇瓶里面做的培养基优化的数据，在罐子里面有用么培养基，大肠杆菌,发酵,基因工 程)摘要:在摇瓶里面做的培养基优化的数据在罐子里面有用么(培养基，大肠杆菌,发酵,基因工 程)发酵大肠杆菌(Escherichia coli)(种自己构建的基因工程(Genetic Engineering) 菌)，为了提高生物量，我在摇瓶里面做了培养基优化：碳源优化，氮源优化，二水平正交 因子分析，响应面板分析。问一下，摇瓶里面得到的优化的培养基，在batch fermentation 和fed-batch ferme ntation中间有用么?我在摇瓶里面OD600可以到20几，但是人家报 道的关键词:培养基基因工程发酵大肠杆菌氮源因子分析生物量 关键词:培养基基因工程发酵大肠杆菌氮源因子分析生物量发酵大肠杆菌(Escherichia coli)(种自己构建的基因工程(GeneticEngineering)菌)，为了提高生物量，我在摇瓶里面做了培养基优化：碳源优化，氮源优化，二水平正交因子分析，响应面板分析。问一下，摇瓶里面得到的优化的培养基，在batch fermentation和fed-batchfermentation中间有用么?我在摇瓶里面OD600可以至U 20几，旦是人家报道的fed-batch fermentation的OD600可以达到70多！好吓人啊！我该看什么资料呢？请各位高手指点我！我好心急!不怕打击你：摇瓶的数据对于fermentor来讲，参考性不是很大。毕竟二者在传质、供氧等都相差悬殊OD70其实饼不算大的，E.coli我不清楚，不敢乱讲，毕赤酵母是完全可以做到400以上的；对于大肠杆菌(Escherichia coli)我想也不会低于100的关键是条件的控制了。不过，既然是工程菌，还必须考虑质粒稳定性问题，不能光看biomass，小心丢质粒啊，呵呵不要这样太刺激人吧你的培养基优化难道都是用罐子弄出来的？ 要考虑一下实际情况，摇瓶的意义还是相当大的。 你应该是做酵母的吧，那个罐子里面的剪切力跟摇瓶会差很多，细菌不会差很远 的。摇瓶里面高的培养基，到了罐子上一般也会高。BTW:还 fermentor 呢楼上看样子专家啦，呵呵佩服中根据实际情况来说，你的摇瓶的工艺优化条件当然对你的batch fermentation 和fed-batch fermentation有所帮助，他是起指导意义，但是一般来说，当你 要扩大培养是需要注意很多的问题，只要你把一些注意事项搞好后就可以利用你 已知道的摇瓶指标来指导你的以后实验。我以前总结了一些东西，现在贴过来给 你看看，或许应该对你有所帮助，另外可以告诉你，你需要看看从小试到中试扩 大方面的资料，对你应该有用从摇瓶试验到中试发酵罐试验的不同之处1消毒方式不同，摇瓶是外流蒸汽静态加热（大部分是这样的），发酵罐是直 接蒸汽动态加热，部分的是直接和蒸汽混合，会因此影响发酵培养基的质量，体 积，PH，透光率等指标。扩大时摇考虑2、接种方式不同，摇瓶是吸管加入，发酵罐是火焰直接接种（当然有其他的接 种方式），要考虑接种时的菌株损失和菌种的适应性等。3空气的通气方式不同，摇瓶是表面直接接触。发酵罐是和空气混合接触，考 虑二氧化碳的浓度和氧气的融解情况。4蒸发量不同，摇瓶的蒸发量不好控制，湿度控制好的话，蒸发量会少。发酵 罐蒸发量大，但是可以通过补料解决的。5、搅拌方式不同，摇瓶是摇转方式进行混合搅拌，对菌株的剪切力较小。发酵 罐是直接机械搅拌，注意剪切力的影响和无菌的影响。6、PH的控制，摇瓶一般通过碳酸钙和间断补料控制PH，发酵可以直接流加控 制PH，比较方便。7、温度控制，摇瓶是空气直接接触或者传热控制温度，但是发酵罐是蛇罐或者 夹套水降温控制，注意降温和加热的影响。8注意染菌的控制方法不一样，发酵罐根据染菌的周期和染菌的类型等可以采 取一些必要的措施减少损失。9、发酵罐可以取样或者仪表时时检测，但是摇瓶因为量小不能方便的进行控制 和检测。10、原材料不一样，发酵所用原材料比较廉价而且粗旷，工艺控制和摇瓶区别很大等等。，我就说这么多了，如果有不足之处，请大家补充！改正！在摇瓶里面做的培养基优化的数据，在罐子里面当然很有用。从经济性来考虑，用罐优化成本太高。通过摇瓶发酵你可以对自己的菌种有很详细的了解，了解她们的习性，脾气等这 些在以后的放大中有着至关重要的作用！（导师常对我说：你要把微生物看成是 自己的朋友，要养成从他们的角度去思考问题，这样发酵才做得好）有经验的人能很快根据摇瓶的条件找到发酵罐的最优条件，当然这要不少经验。般说来发酵在罐子中发酵效果要好一些，因为可以很精确的控制通气，pH， 以及补料。摇瓶得到的数据是为了放大到罐子作准备的（当然如果你很rich的话，所有优 化都全部可以用罐子做，呵呵）。虽然会有差别，但是参考意义还是很大的。非常有用,关键是你有没得到最优化,这项工作做起来很烦人的,量很大，因此能简 化最好，我读研时曾做过类似实验，当时用我老板编的一份软件，可以起到优化功 能的,工作量大大的简化了，但结果还是最好的如果有兴趣可以试一下.有较大指导意义，关键是确定培养基的组成，pH值等参数，但在放大时，还有许多东西要注意，不能把摇瓶参数直接放大。如果要想获得高生物量，较常用办法是补料培养，这就要注意起始培养基浓度对 发酵影响。用摇瓶起码可以：1考察菌体对单一物料的适应程度，如：使用相同的碳源，不同的氮源（玉米浆、豆饼粉、花生粉等），看菌体生长情况及ph变化速度；2观察菌体生活史内的形态变化、ph变化、密度变化，看不同ph下菌丝形态有 何特殊。3找到大概的ph、温度、前体的最适浓度范围，为罐上的最优化作准备；找到 大概的配方，也是上发酵罐的前题；4通过定时取样，了解菌浓与营养代谢量之间的关系；5目前来说，摇瓶初筛也是比较常用的菌种筛选方法。我目前也在上罐，和摇瓶差别很大，上罐还达不到摇瓶的水平，挺郁闷的。上罐当然达不到摇瓶的水平了，培养基成分不一样，条件也不一样,一般是摇瓶里 的高啊