Chapter-2-蛋白质-3-蛋白质分离技术.ppt

Chapter 2 蛋白质 Chapter 2 蛋白质 2.1 蛋白质的概念、重要性及分类 2.2 氨基酸 2.3 蛋白质的结构 2.4 蛋白质的结构和功能的关系 2.5 蛋白质的性质 2.6 蛋白质的提取、分离和纯化 2.6 蛋白质的分离、纯化 研究一个新的蛋白质首先要从它的 基本 性质 作为突破口，然后 根据它的基本性质进 行分离纯化 ，最终用 纯品 对其进行分析鉴定。 如果对蛋白质的基本性质尚未搞清楚，工作 起来将会困难重重。 因此，蛋白质研究技术主要是 对蛋白质 的基本性质进行的分析鉴定 。 研究蛋白质的结构、性质和功能，首先需要 得到纯的蛋白质样品。 (1)蛋白质来源：微生物细胞、动物细胞和植物细 胞； (2)分离和纯化过程都必须 0 4 的低温 下进行。 蛋白质的分离、纯化 1 蛋 白 质 的 分 离 步 骤 (1)生物组织的 机械破碎 。常用的方法有 研磨 法、超声波法、冻融法和酶解法 等。 (2)根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行 抽提 。 水溶性蛋白用 中性缓冲溶液 抽提； 酸性蛋白用 稀碱性溶液 抽提； 脂溶性蛋白用 表面活性剂 抽提等。 (3)粗提 : 离心除去固体杂质后，可通过盐析、 沉淀法、凝胶滤法、超过滤等处理，得到蛋白 质粗制品。 (4)精制 ：可用层析法、电泳法等进行精制。 (5)成品 加工 ：测定蛋白质的性质并干燥成成 品。 2 蛋 白 质 的 纯 化 方 法 透析是利用 蛋白质分子不能透过半透 膜 ，而使它与 其它小分子化合物 ，如 无机盐、单糖、双糖、氨基酸、小肽 以及水等分离。 常用的半透膜是玻璃纸或称赛璐玢 纸、火棉纸和其它合成材料。膜有 玻璃纸 或 高分子合成材料 ，截止分 子量一般为 1万 。 （ 1）透析法（ dialysis) 透析法 2 蛋 白 质 的 纯 化 方 法 此法又称为分子筛层析。凝胶过滤所用的 介质是由 交联葡萄糖、琼脂糖或聚丙烯酰 胺 形成的凝胶珠。凝胶珠的内部是多孔的 网状结构。 凝胶层析介质： Sephadex-葡聚糖凝胶 G10-G200 Sepharose-琼脂糖凝胶 2B,4B,6B Sephacryl-丙烯酰胺葡聚糖凝胶 S100,S200,S300,S400 凝胶过滤层析 凝胶过滤原理 当不同大小的蛋白质颗粒流经凝胶柱 时，比凝胶网孔大的分子不能进入凝胶珠内的网状结构， 而被排阻在凝胶珠外，随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下 移动并最先流出柱外；比网孔小的分子能不同程度地自由 出入凝胶珠的内外。 大分子 小分 子 凝胶颗粒 凝胶排阻 示意图解 凝胶过滤层析 蛋白质分子一般有两种形状 ， 一种是 球形分 子 ， 另一种是 线性分子 。 线性蛋白质分子与球形 分子比较 ， 同样大小分子量的蛋白质 ， 线性分子 体积大流速快 ， 球形分子体积小流速慢 。 因此 ， 在凝胶色谱柱中无论是球形分子还是线性分子都 可进行分离 ， 但球形分子比线性分子的分离度好 。 此法是利用 离子交换剂 作为柱层析支持物，将带 有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。 离子交换树脂可以分为 阳离子 交换树脂（如羧甲 基纤维素等）， 阴离子 交换树脂（如二乙基氨基 乙基纤维素等）。 带正电荷多的蛋白质与树脂结合较强，而带正电 荷少的蛋白质与树脂结合则较弱。 用不同浓度的 阳离子洗脱液 ，如 NaCl溶液进行 梯度洗脱，通过 Na+的离子交换作用，或是改变 流动相的 PH值 ，或是同时采用这两种方法，可 以将带有不同正电荷的蛋白质进行分离。 离子交换层析 2 蛋 白 质 的 纯 化 方 法 离 子 交 换 层 析 这是一种 高效分离纯化蛋白 的方法。其原理 是不同 的蛋白质分子 对于固定化在载体上的 特殊配基 具有 不同的识别 和 结合能力 。 选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作用的 配 基 ，然后应用化学方法将该 配基与载体共价连接 。 将这种 连接有配基的载体 装入层析柱中，当含有 待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时，该蛋白质即 与配基发生特异性结合而被吸附在层析柱上，而 其它蛋白质则流出柱外。 被特异性结合在层析柱上的蛋白质，可以用适当的 配体洗脱液或高盐溶液洗脱。 亲和层析 2 蛋 白 质 的 纯 化 方 法 + C C C 配基 蛋白质 1.配基固相化 2.亲和吸附 固 体 载 体 3.解吸附 在外电场的作用下，带电颗粒将向着与其电性 相反的电极移动，这种现象称为 电泳 。 带电的蛋白质颗粒在电场中移动的速度（ v） 取决于电场强度 (E)， 所带的净电荷 (q)以及 与介质的摩擦系数 (f)。 常用的电泳方法有 聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电 聚焦电泳、双向电泳 等。 2 蛋 白 质 的 纯 化 方 法 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定法 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，也称为十二烷基酸钠 -聚 丙烯酰胺凝胶电泳 (sodium dodecyl sulphate- polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)。 主要用于蛋白质亚基分子量的测定。 (1)原理： a.蛋白质分子状态 在自然状态下蛋白质通过二硫键聚合形成高度折叠的生物大分子 ， 在水溶液中 ， 由于氨基酸残基的解离作用使蛋白质分子形成带有一 定净电荷的分子 。 在电场下向自身电荷相反的方向移动 。 b. 还原剂的解聚作用 在蛋白溶液和分离凝胶介质中加入还原剂 -巯基乙 醇 (- mercaptoethanol)或二硫苏糖醇 (Dithiothretiol, DTT)。 蛋白质分子在还原剂作用下二硫键被还原 ， 将多 聚体或单链折叠的蛋白质分子的二硫键打开 ， 形成长短 不一的单链亚基 。 c. SDS的包裹作用 SDS分子中含有大量的带负电的磺酸基 。 蛋白质分子解聚后形 成的氨基酸侧链与 SDS结合 ， 在 SDS的重量达到蛋白重量的 3-4倍时 蛋白质分子表面完全被 SDS包裹 ， 形成 带负电荷的蛋白质亚基分子 ， 称之为蛋白质 -SDS复合物 ( protein-SDS micelles)。 由于蛋白质 -SDS复合物所带负电荷远大于蛋白质分子自身有的 净电荷 ， 这样就消除了不同分子之间原有的电荷差异 。 d. 聚丙烯酰胺凝胶分子筛作用 不同浓度的凝胶和交联度，形成不同大小的网状结构，它对蛋白 质 -SDS复合物具有阻滞作用。在电场下， 分子量大的亚基受阻大， 电泳速度慢，走在小分子的后面； 分子量小的亚基受阻小，电泳速 度快， 走在大分子的前面。不同分子量的亚基受阻程度不同，表现 出不同的电泳速度，这样就把同一样品中不同大小分子量的亚基分 开。 (2) 操作过程 制胶 加样 电泳 固定 染色 脱色 计算 (3) 结果处理 a. 电泳图谱 1 2 3 b.标准曲线 绘制标准曲线：以标准蛋白质分子量的对数 log(M)为纵坐标 ， Rf值 为横坐标 ， 绘制标准曲线 。 4 4.2 4.4 4.6 4.8 5 5.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 mR lgMr 兔肌动蛋白 牛血清白蛋白 兔磷酸化酶 牛碳酸酐酶 胰蛋白酶抑制剂 鸡蛋清溶菌酶 c.未知蛋白分子量计算： 将未知蛋白的 Rf值查到 log(M)值 ， 便可知其分子量 。 计算分子量 。 (4) 影响因素 影响 SDS-复合物形成的主要因素 。 SDS-电泳成败关之一 ， 是在 制备样品的过程中 ， 蛋白质与 SDS结合的程度直接影响电泳分离效 果 。 影响结合的因素主要有三个 : A.溶液中 SDS单体的浓度 SDS在水溶液中以单体和 SDS复合物混合存在的 ， 能与蛋白质结 合的只能是单体 。 单体的浓度与 SDS总浓度 ， 温度和离子强度有关 。 在一定温度和离子强度下 ， SDS处于一饱和值 ， 即单体浓度不再随 SDS中浓度增加而增加 。 为了使 SDS与蛋白质结合充分 ， SDS和蛋白 质结合的重量比一般是 4:1或 3:1。 B. 样品缓冲液离子强度 因为 SDS结合到蛋白质分子上的量取决于平衡时 SDS单体浓度 ， 而不是总浓度 ， 只有在较低的离子强度溶液中 ， SDS单体才具有较 高的平衡浓度 ， 所以样品缓冲液应选用低离子强度 ， 通常是 10- 100mmol/l之间 。 C. 二硫键是否完全打开 只有蛋白质分子中的二硫键完全被打开 ， 蛋白质分子完全解聚 ， SDS充分与亚基分子结合 ， 才能准确测定出亚基分子量 。 二硫键完 全被打开要取决于巯基乙醇的质量和使用的剂量 。 若蛋白质分子的 二硫键只是部分被打开 ， 这是测出的分子量是蛋白质分子和亚基分 子的混合物 。 等电聚焦电泳 (isoelectric focusing, IEF ） a. 原理 : 通常是指聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳 。 它是 60年代初建立起 来的一种蛋白质分离手段 ， 现在已经成为单向蛋白质电泳分辨率最 高的一种分离技术 。 它是利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点的差异进行电泳 分离和分析 。 蛋白质在一个稳定的线性 pH梯度的凝胶中电泳 ， 蛋白 质朝着与自身电荷相反的方向移动 ， 在移动的过程中不断被凝胶中 的反离子中和 ， 最后静电荷完全被中和而停止运动 ， 聚焦在等电点 的位置 。 b.蛋白质与两性电解质 (1)蛋白质的等电点 蛋白质属于一种两性电解质 。 在不同的 pH环境中所带的正负电 荷不同 。 若在某特定的 pH环境中其净电荷为零 ， 此时的 pH为该蛋白 质的等电点 ， 在电场下不泳动 。 (2)载体两性电解质： 在等电聚焦电泳中 ， 载体两性电解质具有以下两种功能： A 中和功能： 两性电解质的性质在分离系统中形成一个平衡稳定的 pH 梯度 ， 提供中和蛋白质电荷的离子 ， 具有 pH缓冲能 。 B 载电功能： 两性电解质作为电的载体 ， 具有运载 “ 电流 ” 的能力 ， 有良好的导电性能 水平板式电泳槽 垂直板式电泳槽 等电聚焦 时，蛋白质混合物的分离是在具有 PH梯度的介质 中进行的。在电场中，每种蛋白质成分将移向并 “ 聚焦 ” （停留在等于其等电点的 PH梯度处，形成一个很窄的区带。 它的分辨率很高，可以把人的血清分成 40多个区带。适于 做同工酶的鉴定。 方法 : 制胶 加样 电泳 固定 染色 脱色 计算 等 电 聚 焦 双向电泳 （ two-dimensional electrophoresis） 双向电泳是 等电聚焦电泳 和 SDS-PAGE的组合 ， 即先进 行等电聚焦电泳 （ 按照 pI分离 ） ， 然后再进行 SDS-PAGE （ 按照分子大小 ） ， 经染色得到的电泳图是个二维分布的 蛋白质图 。 肽的化学合成（了解） 五、六十年代，世界上，包括我国主 要是从动物器脏获取肽。如：胸腺肽这种 胸腺肽主要用于人体免疫。目前，这种肽 已处于淘汰状态 。 世界上有固相合成法、液相合成法生产的 肽。用这种方法生产肽的企业在美国硅谷就 有一家。他们主要是购买世界上一些精细化 工厂生产的氨基酸为原料，用 固相合成法 、 液相合成法 ，定向合成某种单肽。属医药原 料中间体，其用途主要用于西药配方，以增 强药效、增强人体对药的吸收速度和吸收率 。