《植物总DNA的提取》PPT课件

植物总 DNA的提取 化学生物学实验 中南民族大学 药学院 化学生物学教研室 1.实验目的 1 2 学习和掌握学习 CTAB法提取植 物总 DNA的基本原理和实验技术。 学习和掌握紫外光吸收法鉴定 DNA的纯度和浓度。 2.实验原理 植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如 CTAB），可使核蛋白 体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀， DNA 进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实 验采用 CTAB法，其主要作用是破膜。 CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂 肪，也可解聚核蛋白。植物材料在 CTAB的 处理下， 结合 65 水浴使细胞裂解、蛋 白质变性、 DNA 被释放出来。 CTAB与核酸 形成复合物，此复合物在高盐（ 0.7mM） 浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度 （ 0.1-0.5mM NaCl）下 CTAB-核酸复合物就 因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质 及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿 / 异 戊醇 (24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色 素等来纯化 DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉 淀剂将 DNA沉淀分离出来。 由于核酸、蛋白质、多糖 在特定的紫外波长都有特征吸 收。核酸及其衍生物的紫外吸 收高峰在 260nm。纯的 DNA样品 A260/2801.8 ，纯的 RNA样品 A260/2802.0 ，并且 1g/ml DNA溶液 A260=0.020。 3.实验器材与试剂 1、高压灭菌锅 2、冰箱 3、恒温水浴锅 4、高速冷冻离心机 5、紫外分光光度计 6、剪刀 7、陶瓷研钵和杵子 8、磨口锥形瓶（ 50ml） 9、滴管 10、细玻棒 11、小烧杯（ 50ml） 12、离心管（ 50ml） 13、植物材料 3.实验器材与试剂 1、 3 CTAB buffer（ pH8.0） 100mM Tris 25mM EDTA 1.5M NaCl 3% CTAB 2% -巯基乙醇 2、 TE缓冲液（ pH8.0） 10mmol/L TrisHCl 1mmol/L EDTA 3、氯仿 -异戊醇混合液（ 24： 1， V/V） 4、 95乙醇 5、液氮 4.实验步骤 1、称取 0.1g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。 2、将叶片剪成 l cm长，置于预冷的研钵中，倒入液氮，尽快将叶片研磨成 粉末。 3、将液氮挥发完后，加入 0.5 ml预热（ 60 ）的 CTAB提取缓冲液，转入 一离心管中，置于 65 水浴保温 0.5 h，不时地轻轻摇动混匀。 4、取出稍冷后，加等体积的氯仿：异戊醇混合液，轻轻颠倒混匀，室温下 7000 rpm离心 10 min。 5、用一开口较大的滴管将上层水相吸入另一干净的离心管中，加 2倍体积 的乙醇（ 95%乙醇），轻轻混匀，使核酸沉淀下来，室温下 10000 rpm 离心 10 min。 6、倒掉上清夜，向离心管中加 1 ml洗涤缓冲液，轻轻转动离心管，使核酸 沉淀悬浮起来，洗涤 2 min，在室温下 5000 rpm离心 5 min。 7、重复洗涤一次，并于室温下使 DNA沉淀干燥，变为透明状。 8、将 DNA沉淀溶于 100l TE溶液中，于 -20 保存备用。 9、用于后续浓度及纯度的检测，将 DNA沉淀溶于 1 ml TE溶液中，在分光 光度计上测定该溶液在 260nm/280nm紫外光波长下的吸光度值。 5.注意事项 1. 液氮研磨时，小心操作，以免冻伤。 2. 所有操作均需温和，避免剧烈震荡。 6.思考题 1. CTAB、 EDTA、巯 基乙醇的作用分别 是什么？ 2. 液氮研磨的原理是 什么？