子宫内膜癌中错配修复基因、CD4、Ki

子宫内膜癌中错配修复基因、CD4、Ki-67的表达及意义的研究【摘要】目的探讨子宫内膜癌中错配修复基因、CD4、Ki-67的表达及相互作用，为理解子 宫内膜癌的发生发展、分子分型提供理论和实验依据。方法选择有完整临床病理资料的术 前未经过放化疗及内分泌经治疗的散发性宫内膜样癌根治术后存档的腊块标本80例。应用 免疫组织化学方法检测不同分级及分期肿瘤中的错配修复基因中四种主要蛋白 MLH 1、 MSH2、MSH6和PMS2及CD4、Ki-67表达情况，探讨错配修复基因在散发性子宫内膜样 癌中的表达和意义。结果1. MMR表达缺失在子宫内膜样癌中的发生率为：21.25%，其中 单个蛋白表达缺失14例，两个蛋白联合缺失3例。2. PMS2的缺失率最高，占41.18%(7/17), 其次为MSH2和 MSH6均为29.41% (5/17)，MLH1缺失最为少，占17.65%。3. I级病 变中多数表现为单个MMR蛋白表达缺失，也可有2个蛋白组合的联合表达缺失，分别为 MSH2/MSH6共缺失2例，MLH1/ PMS2共缺失1例。II级病变中仅检测到MMR单个蛋白 表达缺失，未在III级病变中检测到MMR表达缺失。4. MMR表达缺失主要发生于I期及40 岁以下患者，尤其以I a期患者多见。I a期患者常见的缺失类型为MSH6(4/9)，40岁及以 下的患者中MSH2为最常见的缺失类型，大于40岁的患者以PMS2的缺失最为常见。5.具 有MMR表达缺失的子宫内膜样癌病例较无MMR表达缺失病例而言，有着更高的细胞免疫 水平和更低的肿瘤细胞的增殖活性3V0.05)。结论1. MMR参与了散发性子宫内膜样癌 的发生发展，利用免疫组化方法可以很好的检测到组织中MMR的状态；2. PMS2和MSH2/MSH6共缺失是在子宫内膜样癌中的最常见的缺失类型；3. MMR表达缺失主要发生 于I期及40岁以下患者；4. MMR表达缺失提高了子宫内膜样癌患者的细胞免疫水平，降 低了细胞增殖活性。【关键词】子宫内膜癌；错配修复基因；CD4； Ki-67Investigating Expression and Significance of Mismatch Repair Genes、CD4 and Ki-67 in Endometrial CancerZHANG Xue-hua1，2,WU Li-na1, ZHENG Hui-xia1. l.Department of Pathology, The First Affiliated Hospital, Shanxi Medical Univercity, Taiyuan 030001, China 2.Department of obstetrics and gynecology, Shanxi Province Jinzhong city traditional Chinese medicine hospital,Jinzhong 030600, China.Corresponding author: ZHENG Hui-xia E-mail: wulina003Abstract Objective: To investigate the expression and significance of mismatch repair genes(MMR )、CD4 and Ki-67 in endometrial cancer， and to provide useful information of development and molecular classification of endometrial cancer. Methods: Using immunohistochemistry to detect the expression of four main protein of mismatch repair genes, MLH, MSH2, MSH6 and PMS2, CD4, and Ki-67 in 80 untreated patients with sporadic endometrial cancer, and analyzing the expression and significance of MLH, MSH2, MSH6, PMS2, CD4, and Ki-67 in endometrial cancer. Results: 1. Incidence rate of MMR expression depletionwas 21.75%, including 14 cases of single protein expression depletion and 3 cases of combine protein expression depletion. 2. PMS2 was the most common depletion with 41.18% (7/17) , and MLH1 was the least common depletion with17.65%. MSH2 and MSH6 were 29.41%(5/17),which were mediate. 3. In the cases of I grade, single protein expression depletion dominated, and combine protein expression depletion subordinated, including 2 cases of MSH2/MSH6 and 1 case of MLH1/ PMS2. In the cases of II grade, only single protein expression depletion was detected. In the cases of III grade, no MMR expression depletion was detected. 4. MMR expression depletion was mainly detected in cases of I stage and under 40 years old, especially in cases of I a stage. The most common depletion was MSH6(4/9) in cases of I a stage, was MSH2 in cases of under 40 years old, and was PMS2 in cases of more than 40 years old. 5. Comparing with cases of no MMR expression depletion, cases of MMR expression depletion had higher cellular immunity level and lower cellular proliferation activity (P81 %为4分；染色强度：不显色或显色不清为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2 分，棕褐色为3分。两项得分相加作为最后判断结果：0分为阴性(-)，2-3分为弱阳性 (+)，4-5分为中度阳性(+)，6-分为强阳性(+)。计算Ki-67增殖指数：热点区域高倍 镜下(X400)下选取10个视野，阳性肿瘤细胞数/总瘤细胞数x100%o 0%为阴性(-)，1-5% 分为弱阳性(+)，6-10%分为中度阳性(+)，大于11%分为强阳性(+)。1.5统计学分析：采用SPSS19.0统计软件包，阳性率的比较采用2检验，P0.05有 统计学意义。2. 结果2.1子宫内膜样癌病例的临床特征及MMR在子宫内膜样癌病例中的表达情况80例子宫内样膜癌患者均行子宫内膜癌根治术(子宫切除术+双侧附件切除术土盆腔及 /或腹主动脉旁淋巴结清扫术)。患者年龄33-74岁，平均年龄54岁，中位年龄55岁。病 理分级：1级38例(47.50%)，11级21例(26.25%)，111级21例(26.25%)。临床分期：1期 41 例(51.25%) (la 期22 例、lb 期 19 例)，11期 19 例(23.75%)，111 期 18 例(22.50%)， W期 2 例(2.5%)。此次检测的80例子宫内样膜癌患者病例中，17例出现MMR的表达缺失，占21.25% (17/80)。其中两个蛋白联合缺失3例，分别为MSH2/MSH6共缺失2例，MLH1/ PMS2 共缺失1例。单个蛋白表达缺失：14例。MLH1、MSH2、MSH6、PMS2中缺失率最高的 为 PMS2，占 41.18% (7/17)，其次为 MSH2 和 MSH6 均为 29.41% (5/17)，MLH1 缺失 最为少见占17.65% (3/17)。2.2不同病理分级、临床分期子宫内膜样癌病例中MLH 1、MSH2、MSH6和PMS2的 表达情况17例MMR表达缺失子宫内膜样癌的病理分级、临床参数见表1。17例错配修复蛋白 表达均质，未见异质性表达。13例I级病变中检测到出现了 MMR表达缺失，分别为MLH 1，3例、MSH2，5例、MSH6，4例、PMS2，4例。四种错配修复蛋白表达缺失多数表现 为单个蛋白表达缺失，也可以为2个蛋白组合的联合表达缺失，分别为MSH2/MSH6共缺 失2例，MLH1/ PMS2共缺失1例。图1A-D为I级病例中检测到出现了 MSH2/MSH6共缺 失。4例II级病变中检测到出现MMR单个蛋白表达缺失，分别为MSH6，1例、PMS2，3 例。图2A-D为I级病例实性区中检测到出现了 PMS2缺失。本次实验中未在III级病变中检 测到MMR表达缺失。MMR的表达缺失主要出现在I级子宫内膜样癌病例中，其中MSI-L 较为常见，占76.92% (10/13), MSI-H亦可以发生，占23.08% (3/13)。11级子宫内膜 样癌病例中单独MMR表达缺失较为常见，PMS2为主要缺失的类型。MMR表达缺失主要发生于I期及40岁以下患者，尤其以I a期患者多见。I a期患者 常见的缺失类型为MSH6(4/9)，I b期患常见的缺失类型为PMS2 (3/4)，11期患者常见的缺 失类型为MSH2和PMS2 (均为2/4)I、II期患者的MMR表达缺失主要为单个蛋白，但 是两个蛋白的联合表达缺失亦可以发生(I期患者2例、II期患者1例)。本次实验中未在m 期及有淋巴结转移的患者中检测到MMR表达缺失。40岁及以下的患者中有11例检测到 MMR表达缺失，MSH2为最常见的缺失类型，大于40岁的患者以PMS2的缺失最为常见。表117例子宫内膜样癌中MLH l、MSH2、MSH6和PMS2的表达及临床参数病例病理分级临床分期年龄(岁)MLH lMSH2MSH6PMS21IPTIIN0M039+2IIPTIIN0M042+3IpT I a N0M037+4IPTIN0M035+5IpT I b N0M040+6IPTIa N0M035+7IpTIb N0M045+8IpTIa N0M031+9IpTIa N0M037+10IpTIa N0M033+11IpTIN0M050+12IpTIb N0M047+13IpTIa N0M041+14IpTIa N0M044+15IpTIb N0M038+16IpTIa N0M032+17IIpT I a N0M036+图1同一 I级病例中两个MMR蛋白的联合缺失及CD4、Ki-67的表达(En Vision法 x200) A： MLH1在病例中的表达，阳性部位为肿瘤细胞的胞核。B： MSH2在病例中表达 缺失，间质内淋巴细胞为内对照。C： MSH6在病例中表达缺失，间质内淋巴细胞为内对照。 D： PMS2在病例中的表达，阳性部位为肿瘤细胞的胞核。E： CD4在病例间质内淋巴细胞 中的高表达。F： Ki-67在病例肿瘤细胞中的低表达。图2 MMR、CD4、Ki-67的在同一II级病例实性区中的表达(En Vision法x200) A：MLH1在病例中的表达，阳性部位为肿瘤细胞的胞核。B： MSH2在病例中的表达，阳性部 位为肿瘤细胞的胞核。C： MSH6在病例中的表达，阳性部位为肿瘤细胞的胞核D： PMS2 在病例中的表达缺失。E： CD4在病例间质内淋巴细胞中的高表达。F： Ki-67在病例肿瘤细 胞中的低表达。2.3 MMR表达缺失与CD4、K-i67表达的关系17例子宫内膜样癌中MMR、CD4、K-i67表达见表2。不同程度的CD4表达中均可 检测到MMR的表达缺失，中等强度CD4表达的情况下各种MMR表达缺失均可见到。Ki-67+ 的表达时，各种MMR表达缺失均可见到。Ki-67+的表达时未出现MMR表达缺失。子宫内膜样癌中MMR表达情况与CD4、Ki-67的表达相关，MMR表达缺失的病例有着较高的 CD4表达及较低的Ki-67表达，见表3及图1E-F、图2E-F、图3，与MMR表达的病例相 比差异具有统计学意义，PV0.05。表217例子宫内膜样癌中MMR、CD4、K-i67表达指标MLH lMSH2MSH6PMS2CD4 +0211+2333+1013Ki-67 +2455+1102表3子宫内膜样癌中MMR的表达与CD4、K-i67表达的关系MMRCD4Ki-67P2+表达352172527110.0158.14缺失39514300.0061.24图3 MMR、CD4、Ki-67的在同一 II级病例中的表达（En Vision法x200） A： MLH1在病 例中的表达，阳性部位为肿瘤细胞的胞核B： MSH2在病例中的表达，阳性部位为肿瘤细 胞的胞核。C： MSH6在病例中的表达，阳性部位为肿瘤细胞的胞核。D： PMS2在病例中 的的表达，阳性部位为肿瘤细胞的胞核。E： CD4在病例间质内淋巴细胞中的低表达。F： Ki-67在病例肿瘤细胞中的高表达。3讨论MMR为一种核酸水解酶，通过在DNA复制过程中修复错配的碱基使DNA能精确复 制，并防止解旋的DNA序列重新结合，保证人类遗传的保守性和稳定性，这对于基础生理 功能维护和癌症豁免都发挥着十分重要的功能3。MMR蛋白可以识别多种例如由氧化、烷 化所引起的同源及异源损伤性习，或者修复因单个DNA损伤引起的细胞周期停滞或凋亡。 MMR基因突变可发生于任何种族，当MMR发生突变破坏了 MMR蛋白的功能，错配修 复蛋白的表达量下降、不表达或出现截短，对DNA复制过程中发生的缺失和插入不能校正 或纠错，引起基因组DNA出现微卫星不稳定（MSI），则会导致大约15%的散发性肿瘤6。 MMR基因突变相应的蛋白缺失率在不同肿瘤中的变异较大，具体发生率分别为：80%及以 上见于胃癌、卵巢癌、结肠癌和输尿管癌；80-50%见于膀胱癌、子宫内膜癌、肾癌；35% 及以下见于乳腺癌和大脑发生的癌症7,8。此次实验中，子宫内膜样癌中MMR表达缺失的 发生率为21.25%，毕蕊等，研究的子宫内膜癌中MSI的发生率28.7%，两者结果较为相近， 检测到的联合缺失也都集中在MLHI/PMS2、MSH2 / MSH6这两种类型。可能由于样本 含量低的限制此次子宫内膜样癌中MMR表达缺失的发生率低于国外学者报道的45%。 但这些都提示MMR参与了子宫内膜癌的发生发展，不仅在LS相关的病例中，在散发的病 例中同样也发挥了作用。人类中已经鉴定出5种E. coli MMR同系物： MutS同系物，包括：MSH2、MSH6、 MSH3、MSH4 和 MSH5； 4 种 MutL 同系物，包括：MLH1、PMS2、PMS1 和 MLH3。 MLH l、MSH2、MSH6和PMS2是MMR突变为常见的4种致病基因，所以对这四种基因 进行检测在MSI判断方面尤为重要。研究提示I，免疫组化检测MMR的灵敏度与特异度 （分别为83%和88. 8%）与MSI检测的灵敏度与特异度（89%和90% ）相差不大。在临 床的实际工作中利用免疫组化进行MMR情况检测是一种较为可靠的辅助手段。这些MMR 蛋白可以通过不同的组合构成异源二聚体，即MutSa复合物和MutSp复合物来发挥作用 11-13。MutSa是主要的错配结合因子，由 MSH6和 MSH2构成，与 MLH1和PMS2复 合物（hMutLa）结合主要修复单碱基的错配；MutSp由MSH2和MSH3构成，与MLH1 和PMS2复合物结合主要修复大的插入或缺失循环（insertion/deletion loops， IDL） 14。其 中MLH l和MSH2是最重要的LS前处理基因，因其蛋白产物是所有异源二聚体的必须组 成成分，MSH6和PMS2的作用次之。不同MMR基因突变所发生的癌症具有相对组织特异 性，增加了这些组织内在免疫监测的类型及改变了这些组织内在免疫监测的效率，其中 MSH2和MLH1的突变最常见于结直肠癌，其次为子宫内膜癌及其它癌症，而且研究发现 MSH2的突变较MLH1的突变更常见于结直肠癌以外的癌症3，携带MSH6突变的女性更 有机会发生子宫内膜癌ML PMS2杂合子突变也易发生子宫内膜癌。此次研究也发现，在子 宫内膜样癌的病例中PMS2为最常见的缺失类型，其次为MSH2和MSH6，MLH1的缺失 较为少见。进一步研究显示MSH6和PMS2突变会导致更高年龄患者发生癌症，而MSH2或 MLH1突变携带者发生癌症的年龄相对较轻17。此次研究中PMS2为的缺失主要集中在40 岁以后的患者。但是并没有发现与临床表现相关的特异性突变类型及位点。MMR缺陷也会影响机体的免疫系统，一般认为MMR缺陷的肿瘤患者有着较好的预后。 在T细胞发育过程中，不成熟的T细胞进入到胸腺后经历阳性、阴性选择可以识别机体自 身抗原产生免疫耐受，并执行免疫监测功能18。由于肿瘤是起源于机体的自身组织，并且 还可以表达突变或异常的蛋白，影响细胞表面蛋白对抗原的提呈及处理的过程，机体T细 胞往往不能很好的识别肿瘤抗原。所以就此而言这就为恶变细胞发生免疫逃逸提供了便利条 件19。错配修复系统就是一个可以产生突变蛋白的系统，产生这种突变蛋白的关键就是在 错配修复基因中存在的单核苷酸重复序列。带有MSI的肿瘤能够使MMR平移阅读框出现 移码突变，这样会产生一些新的肽段，其中一些新肽段就可以被机体的免疫系统当作异源肽 段来识别和处理。所以MMR缺陷相关的结直肠癌、子宫内膜癌或其它肿瘤病人会出现较高 水平的淋巴细胞反应。Linnebacher20和S&terdal21在体外实验也证实要产生对肿瘤细胞的异 源肽段的识别就要需要T细胞持续产生这种免疫效果，CD4+ T细胞则是这种持续、强烈免 疫效果产生所需要的。此次实验的结果提示:有MMR表达缺失的病人有着更高的免疫活性， CD4+ T细胞的表达更为强烈，同时肿瘤细胞的增殖活性也很能受到这方面的影响而下降， 所以有MMR表达缺失的病人肿瘤细胞Ki-67的表达多不活跃。有研究显示，具有DNA修复机制缺陷的病例对铂类药物，例如，奥沙利铂，敏感性增 加四，尤其对于II、III期的结直肠癌MMR缺陷的病人，这对子宫内膜癌的治疗同样具有 参考意义，这需要在后续的实验中加以验证。参考文献1 Siegel RL, Miller KD, Jemal A. 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