利用生物合成原理寻找微生物新药

第四章 微生物药物的生物合成 微生物新药的发现 根据微生物药物的生物合成原理 发现微生物新药的方法和途径 通过非基因定向改变、基因定向改变，以 及组合生物催化的技术，或是改变原有微 生物药物的生物合成途径，或是对原有的 微生物药物（或先导化合物和中间体）进 行生物催化，以发现微生物新药 . 产生菌 前体物质 (1) 诱变处理 化学 修饰 天然产物 衍生物 天然产物 天然中间物 天然产物 衍生物 化学修饰 生物转化与 组合生物转化 阻断或非阻 断菌株 定向与杂交 生物合成 微生物或 酶转化 天然产物 类似物 杂合 工程菌 突变生物 合成 组合生物合成 (2) 基因操作 天然产物 类似物 (1) (2) 天然产物 类似物 微生物药物生物合成 与微生物新药发现的基本途径 通过非基因定向改变的方法包括：定向生 物合成、杂交生物合成、突变生物合成， 以及生物转化与组合生物转化； 基因定向改变，即为组合生物合成。 第一节 生物合成途径的非基因定向改变 与微生物新药的发现 一、非遗传操作的定向生物合成 与微生物新药的发现 已有的研究表明，在抗生素等次级代谢产物生 物合成中酶底物的特异性足以使结构相关的 代谢产物在其发酵液中积累； 但由于生物合成酶的底物专一性较低（宽泛 性），其野生型菌株或阻断突变株的发酵过程 中添加一些已知结构类似物作为前体物质，可 以产生含有与这种已知结构类似的新衍生物； 这种获得新次级代谢产物的途径，可以被称之 为非遗传操作的定向生物合成 (directed biosynthesis)。 前体（ precursor） 即在微生物培养过程中，外源添加的某一 化学物质，通过微生物的代谢，能够将其 整体地或部分地整合到某一特定的次级代 谢产物的分子中去的化合物，如苯乙酸或 苯乙酰胺及苯氧乙酸等）。 非遗传操作的定向生物合成 这种在发酵过程中通过添加某种特定的前体物质， 使微生物的生物合成朝着将这些前体物质掺入到 产物分子的某一特定部位而产生过量的含有这种 前体的产物的方法，即为非遗传操作的定向生物 合成。 其基本原理是由于参与这些反应的生物合成酶的 底物专一性较差，而能使外源添加的某些前体物 质竞争性地掺入到特定产物的分子中去。 定向生物合成与微生物新药的发现 次级代谢产物合成酶的特点： 是一个由一系列酶参与催化的多酶体系。 参与催化反应的酶的底物专一性比初级代 谢合成酶要差。 应用实例 应用非遗传操作定向生物合成的方法能够 制备获得许多新的抗生素，其中目前已进 行工业化生产的有： 青霉素 G和 V； 培罗霉素； 四环素和金霉素等。 青霉素定向生物合成 . 序号 侧 链 R 学 名 俗 名 1 对羟基苄青霉素 青霉素 X 2 苄青霉素 青霉素 G 3 戊烯 2青霉素 青霉素 F 4 戊青霉素 青霉素二氢 F 5 庚青霉素 青霉素 K 6 丙烯巯甲基青霉素 青霉素 O 7 苯氧甲基青霉素 青霉素 V 8 4氨基 4羧基 丁基青霉素 青霉素 N N C H S C C H C H 3 C H 3H C C H 2 N O C O O H 青霉素和 6 APA分子结构及各种天然青霉素的结构与名称 青霉素分子的化学结构 6 APA的化学结构 各种天然青霉素具有的侧链和名称 H O C H 2 C H 2 H 3 C C H 2 C H C H C H 2 H 3 C ( C H 2 ) 3 C H 2 H 3 C ( C H 2 ) 5 C H 2 H 2 C C H C H 2 S C H 2 C H 3O C H ( C H 2 ) 2 C H 2 N H 2 H O O C 培罗霉素定向生物合成 . 培罗霉素定向生物合成 可结合进入 BLM的末端胺基部分的非天然胺基化合物 . H 2 N C H 2 C H 2 N H 2 H 2 N C H 2 C H N H 2 C H 3 H 2 N ( C H 2 ) 3 N H C H 3 H 2 N ( C H 2 ) 3 N ( C H 3 ) 2 H 2 N ( C H 2 ) 3 N ( C H 3 ) 2 X - H 2 N ( C H 2 ) 3 N H ( C H 2 ) 3 N ( C H 3 ) 2 H 2 N ( C H 2 ) 3 N ( C H 2 ) 3 N H 2 C H 3 H 2 N ( C H 2 ) 3 N H C H C H 3 ( C H 2 ) 2 N H 2 H 2 N ( C H 2 ) 3 N H ( C H 2 ) 3 O H H 2 N ( C H 2 ) 3 N H ( C H 2 ) 3 O C H 3 H 2 N ( C H 2 ) 3 N H 2 N ( C H 2 ) 3 N H 2 N ( C H 2 ) 3 N O H 2 N ( C H 2 ) 2 N N H H 2 N ( C H 2 ) 3 N H C H 2 * H 2 N ( C H 2 ) 3 N H C H C H 3 H 2 N C H 2 C H 2 N H 2 H N ( C H 2 ) 3 N H * PEP的末端胺基 四环类抗生素的定向生物合成 R5 R6 R7 6去甲基四环素 H H H (1) 7氯 6去甲基四环 素 H H Cl (2) 四环素 H CH3 H (3) 5羟基四环素（土霉素） OH CH3 H (4) 7氯四环素（金霉素） H CH3 Cl (5) O H R 7 O O H N H 2 OO O H H O N ( C H 3 ) 2 H R 6 H R 5 H H 7 8 9 1 0 1 1 6 6 a 1 0 a 5 5 a 1 1 a 4 4 a 1 2 a 1 2 3 1 2 微生物发酵产生的一些四环素类抗生素 四环类抗生素的定向生物合成 在生产 金霉素 时需添加氯化物作为前体， 而当生产 四环素 时，则必须要在发酵培养 基中添加氯离子抑制剂，如溴化物或 M-促 进剂等，从而抑制金霉素的合成而得到四 环素产物。 另外，用金色链霉菌在发酵的金霉素过程 中添加适量的甲基化反应抑制剂如磺胺嘧 啶钠，能够获得 去甲基金霉素。 杜拉克丁的定向生物合成 杜拉克丁的定向生物合成 组分 R1 R2 X Y 备注 A1a A1b A2a A2b B1a B2b B2a B2b OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 OH OH OH OH CH=CH CH=CH CH2 CH（ OH） CH2 CH（ OH） CH=CH CH=CH CH2 CH（ OH） CH2 CH（ OH） 25-环己烷基 -B2 25-环己烷基 -B1 OH OH CH2CH（ OH） CH=CH 外源添加环 己烷羧酸钠 CH3 C2H5 CH3 C2H5 CH3 C2H5 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 非基因改变定向生物合成的研究进展 尽管近年来基因改变的定向生物合成 发展很快，但利用非遗传操作定向生物合 成原理寻找新的生理活性物质的研究还在 不少实验室继续进行，特别是对一些肽类 如 环孢菌素 A、 aureobasidins及糖肽类如 替考拉宁产生菌 的定向生物合成研究取得 二、添加外源酶抑制剂的杂交生物合成 与微生物新药的发现 杂交生物全成（ hybrid biosynthesis）似乎可以 理解为是 一种 “ 强化 ” 的非遗传定向生物合成 ，如 在苦霉素产生菌生酵过程中添加聚乙酰途径中 -酮 酯酰基合成酶抑制剂 线兰菌素 (cerulenin)，使 其失去合成链霉素大环内酯苷元 (picronolide)的 能力而只能合成糖基。同时在发酵过程中添加泰乐 菌素大环内酯苷元 (protylonolide)，使其与苦霉 素生产菌产生的糖基结合，得到一种被称之为 M4365G1的杂合抗生素 (hybrid antibiotic)。 杂交生物合成与微生物新药的发现 O H O M e N H O M e M e葡萄糖 1 CH3COOH 6 CH3CH2COOH M e M e O O O H M e O H M e M e O M e 2 CH3COOH 5 CH3CH2COH CH3CH2CH2COOH S.fradia KA 427 NO.261 Protylonolide Picronolide O M e O M e H O M e O H M e M e Desosamine O M e N H O M e M e O M e O M e H O e M e M e O O M e N H O M e M e M e M e O O O H M e O M e M e O M ePicromycin D Desosaminyl Protylonolide （ M4365G1） 在浅蓝菌素存在下，用苦味霉素产生菌（ S.sp.AM 4900） 与 protylonolide 杂交生物合成 M 4365G 杂交生物合成产物工业化的可能性 尽管通过杂交生物合成能够得到 一些新的抗生素，但由于所添加的 浅 蓝菌素 本身就是一种昂贵的抗生素， 再则所添加的 苷元的结构 受到限制， 所以这种方法似乎没有很大的实际意 义。 三、非定向诱变的突变生物合成 与微生物新药的发现 突变生物合成（ mutational biosynthesis）： 突变生物合成是指野生型产生菌经化学或物理等 因素诱变处理后，丧失合成原来次级代谢产物的 能力而成为阻断突变株，然后在发酵培养阻断突 变株时添加某种外源物质，参与生物合成以获得 新的次级代谢产物的过程。 另外，突变生物合成也包括由于突变而引起产生 新的次级代谢产物。 突变生物合成原理 阻断突变株的类型 营养缺陷型突变株： 由于编码菌体生长之必须的酶的基因发生了突 变，而使菌体不能生长，导致不能合成次级代 谢产物。因此，这类突变株也可以称为初级代 谢阻断突变株。 独需型突变株： 这种突变株的生长和初级代谢正常，但由于编 码次级代谢产物合成的某一基因发生突变，而 使丧失了合成次级代谢产物的能力。这是突变 生物合成所需要的突变株。 双重阻断突变株： 即突变既发生在编码初级代谢酶的基因上，也 发生在编码次级代谢酶的基因上。 突变生物合成与微生物新药发现 . 野生型产生菌 独需型突变株 A B 正常途径 某抗生素 阻断变株 A 阻断变株 B A B + B A + A B A B A， B为某一抗生素分子结构的两个部分 A B 为发酵液培养时阻断变株的代谢产物 B A 为发酵培养时添加的 A B 的结构类似物 A B A B 即为新的杂合抗生素 利用独需型突变株合成产生新抗生素的基本原理 突变生物合成的 基本流程 . 出发菌株的选择 诱变处理 阻断突变株筛选 琼脂块法选择 有生理活力的突变株 无生理活力的突变株 摇瓶复筛 有生理活力的突变株 无生理活力的突变株 区段合成产物 ， 连接 酶等生化特性的研究 有区段合成产物 、 无 连接酶等活性的突变 株 有区段产物 A有连接 酶等活性的突变株 有区段产物 B有连接 酶等活性的突变株 发酵培养 添加结构类似物 A或 B 样品收集 TLC、 HPLC检测及制备 结构检测 突变生物合成产生的新抗生素 . 菌种 抗生素 特殊营养 增补物 新抗生素 伊尼奥小单孢菌 西梭霉素 DOS 链霉胺等 突变霉素 1等 绛红小单孢菌 庆大霉素 DOS 链霉胺等 2羟基 GM等 红霉素链霉菌 红霉素 Erythronolide 8， 8 deoxyoleanolie 未鉴别 弗氏链霉菌 新霉素 DOS 链霉胍等 杂交霉素 A， B 加利利链霉菌 阿克拉霉素 阿克拉酮 紫红霉酮等 11羟基阿克拉霉 素 A 灰色链霉菌 链霉素 紫红霉酮等 2脱氧链霉胍 streptomutin A 卡那霉素链霉菌 卡那霉素 DOS 1 N甲基 DOS等 1 N甲基 GM等 雪白链霉菌 新生霉素 氨基香豆 氨基香豆素同系物 未鉴明 核糖苷链霉菌 核糖霉素 DOS 1 N甲基 DOS等 1 N甲基 RSMC等 普拉特链霉菌 普拉特霉素 Platenolide Narbonolide 5 O mycaminosyl narbonolide 龟裂链霉菌 巴龙霉素 DOS 链霉胍 杂交霉素 C 巴龙链霉菌 尼可霉素 尿嘧啶 嘧啶 尼可霉素 Z等 唐德链霉菌 红霉素生物 合成途径 . 丙酮 CoA 丙酰 S ACP 甲基丙二酰 甲基丙二酰 S ACP 丙酰丙酰 S ACP 聚酮体途径 6脱氧红霉内脂 B 红霉内脂 B TDP L碳霉糖 葡萄糖 TDP D葡萄糖 3 O碳霉糖基红霉内脂 TDP脱氧氨基己糖 红霉素 D 红霉素 C 红霉素 A 红霉素 E 红霉素 B 缩合酶 突变株产生的 新蒽环类抗生素 . O O OR R 1 O H O H R 2 N H 2 O H H 3 C 1 2 3 4 5 6 7 8 91 01 11 2 1 2 3 4 5 6 4 O C H O C H 2 C H O H C H 3 C H C H 3 C H 2 O H R R1 R2 道若霉素（原株产生） OCH3 COCH3 OH 亚德里亚霉素（变株产生） OCH3 COCH2OH OH 13双氢道若霉素（变株产生） OCH3 CHOHCH3 OH 13双氢洋红霉素 OH COCH3 OH 11去氧道若霉素（变株产生） OCH3 COCH2OH H 11去氧亚德里亚霉素（变株产生） OCH3 CH2CH3 H BaumycinA*（原株产生） OCH3 CH2COCH3 OH Feudomycin A（变株产生） OCH3 CH2CH3 OH Feudomycin B OCH3 CH2COCH3 OH 突变株产生的一些新的次级代谢产物 . 原菌种 原抗生素 突变株产生的新抗生素 普拉特链霉菌 普拉特霉素 demycarosyl普拉特霉素 9 dehydromycarosyle普拉特霉素 波赛链霉菌 紫产色链霉菌 柔红霉素 烬灰红菌素 阿霉素 烬灰红菌素 X 波赛链霉菌 baumycin oxaunomycin 棘孢小单孢菌 庆大霉素 小诺霉素 生金链霉菌 四环素 去甲基四环素 生金链霉菌 金霉素 去甲基金霉素 龟裂链霉菌 土霉素 去甲基土霉素 吸水链霉菌 carriomycin carromycinA 我国应用突变生物合成原理找到的小诺霉素 . O O O O H O H O H 3 C H N O H H O H 2 N N H 2 H 2 N C H R 2 R 1 2H2SO4 庆大霉素和小诺霉素的化学结构 抗生素 R1 R2 分子式 硫酸庆大霉素 C1 CH3 NHCH3 C21H43N5O72H2SO4 硫酸庆大霉素 C1a H NH2 C19H39N5O72H2SO4 硫酸庆大霉素 C2 CH3 NH2 C20H41N5O72H2SO4 小诺霉素 H NHCH3 C20H41N5O72H2SO4 四、原生质体融合与微生物新药的发现 微生物原生质体融合，即是指将双新株的微生物 细胞分别通过酶解脱壁，使之形成原生质体，然 后在高渗溶液的条件下混合，并加入物理的（如 电融合）或化学的 (如聚乙二醇 )或生物的（如仙 台病毒）助融条件，使双亲株的原生质发生相互 凝集，通过细胞质融合，核融合，尔后发生基因 组间的交换，重组，进而可以在适宜的条件下再 生出微生物细胞壁，获得重组子的过程。 四、原生质体融合与微生物新药的发现 利用微生物厚生质融合寻找新抗生素的基 本原理是来源于两种已知产生不同抗生素 的产生菌的融合子，有可能将它们的部分 生物合成基因整合在一起而产生新的杂合 抗生素；另一个原理是由于抗生素产生菌 中存在着沈默基因，当这些沉默基因受到 外源物质刺激后，有可能被激活而产生， 结构与亲株完全不同的新的抗生素。 四、原生质体融合与微生物新药的发现 应用这种方法获得的第一个新抗生素是吲 哚佐霉素（ indloizomycin）： 其亲株为链霉素产生菌灰色霉菌和天神霉 素（ istamycin）产生菌天神链霉菌 S.tenjimariensis。 （目前的报道较少） 第二节 生物合成途径的基因定向改变 与微生物新药的发现 组合生物合成 Combinatorial biosynthesis 是一种通过对天然产物生物合成途径中的 基因进行中断、置换及重组等操作，改变 原来抗生素产生菌或其他天然产物产生菌 生物合成代谢产物的途径，产生具有新颖 结构的 “ 非天然的天然杂合产物 （ unnatural natural hybrid compounds） ” 的技术或方法。 组合生物合成的潜能 potential 重组、组合、互补、替换 R=可利用的基因 n=基因的等位形 式 化合物数 Rn R=4, n=4 Compounds=44=256 组合生物合成的原理 生物合成酶基因的结构和组成 生物合成酶基因的特异性及底物宽容性 生物合成酶基因之间的相互作用 生物合成途径的研究基础 一、具有聚酮体生物合成途径的 微生物药物产生菌的组合生物合成 基于商业性的原因，迄今为止，对一些具有 聚 酮体生物合成（ polyketide synthases， PKSs） 途径的 “ 天然产物 ” ，如红霉素、阿维菌素、 泰乐菌素、柔红霉素、阿克拉霉素、西罗莫司 和利福霉素等； 具 PKS途径的抗生素 药物类别 化 合 物 大环内酯类抗生素 红霉素、螺旋霉素、麦迪霉素 四环类抗生素 四环素、金霉素、土霉素 抗肿瘤抗生素 柔红霉素，阿克拉霉素、 enediynes 抗寄生虫药 avermectin， nemadectin 免疫抑制剂 FK506, rapamycin 抗真菌药 两性霉素，制霉菌素 心血管药物 lovastatin,， compactin 兽药 莫能星 （ monensin） ， 泰乐菌素 (tylosin)， 盐霉素 1、红霉素产生菌的组合生物合成 通过操作 PKS的模块中 单个基因 的组合生物 合成； 在 非天然产物产生菌 中过量表达组合生物 合成产物； 通过操作 PKS模块之间连接 的组合生物合 成 ； 通过操作 脱氧糖途径基因 的组合生物合成。 红霉素产生菌的组合生物合成的可能性 参与红霉素生物合成的 PKSs，或 6脱氧红霉内酯 合成酶（ 6-deoxyerythronolide B synthase， DEBS）有 6个模块组成，每个模块负责合成聚酮体 中的一部分。 由于各模块之间的协调性，以及每个模块编码决 定延伸单位的选择、功能和立体化学性质的催化 结构域，因此，就有可能通过对 PKSs结构域或模 块的操作获得具有新颖结构的化合物。 由于具有聚酮体结构的化合物其结构非常复杂和 具有众多的立体异构体，因而，难以用常规的化 学方法来获得。 红 霉 素 的 生 物 合 成 途 径 PKS中的每一个模块的组成 酮基合成酶（ ketosynthase， KS） 酰基转移酶（ acyl transferase， AT） 酰基载体蛋白（ acyl carrier protein， ACP -酮基修饰酶：包括酮基还原酶 （ ketoreductase， KR）、脱氢酶 （ dehydrogenase， DH）和烯酰还原酶 （ enoylreductase， ER） DEBS含有编码三个独立的多肽亚单位的 6个模块 大多数典型的聚酮体合成途径的产物包括对 PKS产 物的修饰，如将脱氧糖或氨基糖进行糖苷化以及 通过细胞色素 P450进行氧化。图中所示的 LD为装 载域（ loading domains）， TE为硫酯酶 （ esterases）。 1）通过操作 PKS的模块中单个基因的组合生物合成 一是用利福霉素 PKS模 块 2中的 DH/ER/KR结构 域取代红霉素 PKS模块 2中的 KR； 二是将模块 5中的 KR缺 失； 三是用利福霉素模块 2 中的丙二酰特异性 AT取代模块 6中的甲基 丙二酰特异性的 AT），将得到一个发 生三重突变的 PKS产物。 2）在非天然产物产生菌中过量 表达组合生物合成产物 将 E.coli 开发成能够表达 PKS产物需要解 决的问题主要有三个方面： 一是能够功能性表达巨大的蛋白 （ 330kDa）； 二是 PKS亚单位的 ACP结构域的翻译后磷酸 泛酰巯基乙胺酰化； 三是聚酮体途径中的前体物质，特别是 （ 2S）甲基丙二酰 CoA在 E.coli中不存 在。 Pfeifer等的工作包括： 运用来源于枯草芽孢杆菌非核糖体多肽合成酶 （ NRPS）基因簇的磷酸泛酰巯基乙胺酰转移酶 （ phosphopantetheinyl transferase）基因 sfp， 以对 PKS亚单位的 ACP结构域的翻译后磷酸泛酰巯 基乙胺酰化； 过量表达 E.coli中的丙酰 CoA合成酶基因 prpE， 扰乱丙酰 CoA代谢途径，以及过量表达来自 S.coelicolar的丙酰 CoA羧化酶基因 pcc，使丙 酰 CoA转化为（ 2S）甲基丙二酰 CoA 3）通过操作 PKS模块之间连接的组合生物合成 通过对 DEBS模块在 E.coli和体外的表达研究，发 现在 PKS装配过程中那些短的模块内和多肽内的 “ 连接件 ” 是至关重要的成分。研究发现在相继 非共价连接的模块中，其氨基和羧基末端存在有 多肽内连接件，这种连接件与单个多肽内的模块 之间的连接件不同。 因此，使用一种合适的连接件就有可能允许杂合 的模块之间进行功能性连接。 a：已经鉴定了不同的 模块内和多肽内的连接 件，并由此指导合成模 块之间的聚酮体中间体， 这里需要合适的氨基和 羧基末端连接配对，以 产生功能性连接模块； b：在构建功能性互补 体时，可以使用编码来 源于不同微生物多个模 块的全亚基； 如图所示：来源于苦霉 素（ picromycin）的 PKS（ PikAI和 PikAII）， 与来源于竹桃霉素 （ oleandomycin）的 PKS（ OleA3）相结合。 4）通过操作脱氧糖途径基因的组合生物合成 对已经发现的由自然界中植物、真菌和细菌产生 的很多具有生理活性的糖苷类化合物的分析发现， 连接在苷元上的糖基的结构大多为 6-脱氧己糖 （ 6-deoxyhexoses, 6DOHs）。 据统计，这些具有生理活性的糖苷类化合物的结 构上含有 70多种不同的 6-脱氧己糖。 6-脱氧己糖的种类 具有生理活性的化合物 产生菌 * D-Desosamine 红霉素 竹桃霉素 苦霉素 巨大霉素 Sacc.erythraea S.antibioticus S.Venezuelae M.megalomicea D-Olivose 光辉霉素 乌达霉素 Landomycin S.argillaceus S.fradiae S.cyanogenus D-Oliose 光辉霉素 S.argillaceus D-Mycarose 光辉霉素 S.argillaceus D-Mycaminose 泰乐星 S.fradiae D-Mycinose 泰乐星 S.fradiae D-Mycosamine 制霉菌素 S.noursei L-Dihydrostreptose 链霉素 S.griseus L-Oleandrose 竹桃霉素 阿弗米丁 S.antibioticus S.avermitillis L-Mycarose 红霉素 巨大霉素 泰乐星 Sacc.erythraea M.megalomicea S.fradiae L-Noviose 新生霉素 S.spheroides L-Rhodinose 乌达霉素 Landomycin Granaticin S.fradiae S.cyanogenus S.violaceoruber L-Daunosamine 柔红霉素 S.peucetius L-Nogalose Nogalamycin S.nogalater L-Megosamine* 巨大霉素 M.megalomicea L-Rhodosamine 阿克拉霉素 S.galilaeus L-Epivancosamine Chloroeremomycin A.orientalis 2-Deoxy-L-fucose 阿克拉霉素 S.galilaeus O O O O O O O O O O D - D e o x y h e x o s e s C H 3 N ( C H 3 ) 2 O H O H O H o h O H O H O H O H O H O H C H 3 C H 3 O H C H 3 O H O M e O M e C H 3 N ( C H 3 ) 2 O H O H C H 3 N ( C H 3 ) 2 O H C H 3 C H 3 O H O H O H C H 3 O M e O H C H 3 O H O H C H 3 O H N H 2 O H N H 2 O H C H 3 O H D - F o r o s a m i n e D - O l i o s e D - M y c i n o s e D - M y c a m i n o s e D - D e s o s a m i n e D - M y c a r o s e D - C h a l c o s e D - O l i v o s e D - P e r o s a m i n e D - M y c o s a m i n e O O O O O O O O C H 3 O H O H O H O H O H O H O H O H O H O H O H O M e C H 3 O H C H 3 O H N H 2 O H N ( C H 3 ) 2 C H 3 C H 3 O H O H C H 3 C H 3 O M e O H C H 3 C H 3 C H 3 O H O H O H C H 3 O H O H O H C H 3 O H O H O H N H 2 C H 3 C H 3 O H L - D e o x y h e x o s e s L - O l e a n d r o s e L - R h o d i n o s e L - D a u n o s a m i n e L - R n o d o s a m i n e L - M y c a r o s e L - C l a c i n o s e L - N o g a i o s e L - O l i o s e L - N o v i o s e L - E p i v a n c o s a m i n e 由放线菌产生的具有不同生理活性 的糖苷化合物的结构特性 具有 单糖残基 的化合物：红霉素 A、柔红霉素、 urdamycin A和 rebeccamycin； 具有 双糖残基 的化合物：光辉霉素 （ mithramycin）； 具有 三糖残基 的化合物：乌达霉素 A（ urdamycin A） 和光辉霉素（前者同时具有单糖和三糖残基，后者 同时具有双糖和三糖残基）； 以 O-糖苷键连接 的化合物：红霉素 A、光辉霉素、 柔红霉素和乌达霉素 A； 以 C-糖苷键连接 的化合物：乌达霉素 A； 以 N-糖苷键连接 的化合物： rebeccamycin。 O O H C H 3 O O H O O C H 3 O H O O H 3 C N H 2 H O D o x o r u b i c i n O O O O O O O O O O C H 3 O H O HO C H 3 H O OO HO H H 3 C H O H 3 C H O H O H 3 C H 3 C H O O H H 3 C H O H 3 C O H C H 3 M i t h r a m y c i n O H O H 3 C C H 3 O O O O C H 3H 3 C H O H 3 C O H C H 3 C H 3 O H O N ( C H 3 ) 2 C H 3 O O M e C H 3 O H C H 3 E r y t h r o m y c i n A H N N N H O O C l C l O O H O H O M e H O R e b e c c a m y c i n O OO H C H 3 O H O H O O O H C H 3 O O C H 3 H O O O H 3 C O O H 3 C H O H O U r d a m y c i n A 由放线 菌产生 的具有 不同生 理活性 的糖苷 化合物 的化学 结构 a）通过将竹桃霉素产生菌 S.antibioticus中齐墩果糖基转移酶基因在不同的 S.erythraea中的表达，得到了 3 O鼠李糖基红霉素和 6 dEB衍生物，以及一 个 desosaminylated tylactone； b）改造来源于刺孢霉素（ calicheamicin）产生菌的基因，可以得到一个新的脱 氧氨基糖，并将其附着在 S.lividans产生的苷元上； c）在 S.lividans产生菌中构建 desosamine的途径，然后导 入通过遗传操作的 DEBS，可以得到具有新颖结构的 desosaminylated大环内酯类文库。 ( a ) S . e r y t h r a e a B V 8 8 ( e r y B V - ) ( + o i e G l l ) S u g a r s O l e G i l O C H 3 O H O H C H 3 O H 3 C O C H 3 O H H 3 C C H 3 H 3 C G T F O H 3 C C H 3 O O O O C H 3 C H 3 O H H 3 C C H 3 H 3 C O H O N ( C H 3 ) 2 C H 3 O O H O H C H 3 O H 3 - O - r h a m n o s y l - 6 - d e o x y e r y t h r o m y c i n B 将竹桃霉素产生菌抗生链 霉菌中编码竹桃霉素 oleandrose糖基转移酶的基 因 oleGII，（该酶负责将 相应的糖基转移到 8， 8a- 脱氧竹桃内酯（ 8， 8a- deoxyoleandolide）的 4 位羟基上），整合到红霉 素产生菌 eryBV缺失突变株 中， eryBV基因编码的糖 基转移酶负责将 L- mycarose糖基转移到 6-脱 氧红霉内酯（ 6- deoxyerythronolide）甙元 的相同位置 ，并进行表达， 结果得到了将天然糖基 L- rhamnose转移到 6-脱氧红 霉内酯 4位的新红霉素衍 生物，其具有抗菌活性 ， 将 泰乐菌素产生菌弗氏链霉菌中编 码 mycaminose糖基转移到泰乐菌 素甙元上的转移酶基因 tylM2整合 到红霉素产生菌三缺失突变株 SGT2，（分别缺失聚酮体合成酶 基因、 mycarose和 desosamine糖基 转移酶基因，但仍然具有合成 L- mycarose和 D-desosamine的能力）， 并使之表达，同时在培养过程中外 源加入 16-元环的泰乐酮 （ tylactone），结果得到一种新的 泰乐星衍生物 5-O-desosaminyl- tylactone，如图）所示。说明泰乐 菌素产生菌中的转移酶 TylM2能够 识别和转移不同的氨基糖。 这两个例子同时也表明抗生素糖基 转移酶具有较宽的底物专一性 。 ( b ) S . e r y t h r a e a S G T 2 ( e r y A - , e r y B V - , e r y C l l l - ) ( + t y l M 2 ) t r y M 2 G T F S u g a r s O O H O H O O C H 3 C H 2 H 3 C C H 3 H 3 C H 3 C O H 3 C O O H O O C H 3 C H 3 H 3 C H 3 C C H 3 O H O N ( C H 3 ) 2 C H 3 5 - O - d e s o s a m i n y l - t y l a c t o n e 5）通过表达杂合基因方法 的组合生物合成 第一个例子是应用有些大环内酯类抗生素 3或 4位 的羟基酰化酶基因，使某些大环内酯类抗生素在相 应的位置酰化： 1）异戊酰螺旋霉素 （来自碳霉素的 4”异戊酰辅酶 A 转移酶的 carE基因 ）； 2）丙酰螺旋霉素 （来自麦迪霉素的 4”丙酰化酶的 mpt基因）； 3）乙酰泰乐菌素 等（来自碳霉素的 3 O乙酰转移 酶的 acyA基因）。 引入外源酶基因产生杂合抗生素 丙酰螺旋霉素基因工程菌构建图 必特螺旋霉素的结构 R1 H R2 COCH2CH(CH3)2 COCH3 COCH2CH2CH3 COCH2CH3 COCH2CH3 COCH3 2、蒽环类抗生素产生菌 的组合生物合成 蒽环类抗生素是一类临床上非常重要的抗 肿瘤抗生素，它们同样是 PKS生物合成途径， 因此，通过以下集中组合生物合成的方法， 可以得到一系列 “ 非天然的天然杂合化合 物 ” 。 1）通过破坏靶基因的组合生物合成 通过基因框内的诱变或缺失，或插入抗生 素耐药基因盒的方法，可以将所选择的靶 基因特异性地钝化； 尽管靶基因的破坏可以得到新的化合物， 但会出现错误的结果，这是因为一方面由 于极性效应影响下游基因的表达，另一方 面受到由于外源 DNA片断的插入造成的反义 RNA合成影响上游基因。 1）通过破坏靶基因的组合生物合成 在光神霉素（ mithramycin）产生菌 S.argillaceus中， 破坏编码葡萄糖 1磷酸 胸苷 5三磷酸胸苷转移酶的基因 mtmD后，获 得了两个四环类的光神霉素衍生物： premithramycinone和 4脱甲基 premithramycinone衍生物； Premithramycinone的抗肿瘤生物活性与光神霉 素相似，且有趣的是其化学结构与来源于黑曲霉 A.niger的神经肽受体抑制剂 BMS非常相似，如图 所示。 通过基因破坏后得到的两个光神霉素 衍生物和 BMS-192548 2）通过表达杂合基因方法 的组合生物合成 来源于 S.fradiae的 urdE基因，编码一种氧 化酶，其可能涉及到将 1分子氧引入到乌达 霉素结构中； 在控制启动子 ermE的条件下，将其在丁省 霉素 C产生菌 S.glaucescens中表达，产生 一种新的杂合化合物， 6羟基丁省霉素 C， 如图所示。 通过将乌达霉素产生菌的 urdE基因在丁省霉素 C产生菌 中表达，得到一种杂合产物 6羟基丁省霉素 C 2）通过表达杂合基因方法 的组合生物合成 另外一个实例是，将柔红霉素产生菌 S.peucetius中 编码 11-aklavinone-羟化酶 的基因（ dnrF），在阿克拉霉素产生菌 S.galilaeus中表达， 结果得到了一种新的 杂合化合物， 11羟基阿克拉霉素 A，如图 所示。 这种羟基化的产物，其对白血病细胞和黑 色素瘤细胞的生物活性比阿克拉霉素要强。 杂合化合物 11羟基阿克拉霉素 A的组合生物合成 2）通过表达杂合基因方法 的组合生物合成 通过这种组合生物合成的方法，已经获得了数 个杂合糖苷化的丁省霉素，如用含有一个完整 埃罗霉素（ elloramycin）基因簇（具有产生 8 去甲基丁省霉素 C的能力）的黏粒转化乌达霉 素产生菌或光神霉素产生菌，可以得到四种新 的糖苷化合物：齐墩果糖基、鼠李糖基、 mycarosyl丁省霉素 C和双齐墩果糖基丁省霉素 C， 如图所示。 有趣的是，这些脱氧糖在乌达霉素和光神霉 素苷元上的附着位置，与在埃罗霉素的附着位 置不同。表明，这些聚酮体的糖基转移酶具有 底物宽泛性。 杂合糖苷化丁省霉素的组合生物合成 能够被 ElmGT糖基转移酶转移的一些 糖基和 elloramycin甙元的结构 O C H 3 OO O O HC H 3 H 3 C O O C R 2 O O H O H O R 1 R 2 R 1 L - R h a m n o s e OH 3 C H O H O O H L - R h o d i n o s e O O H H 3 C L - O l i v o s e O H O H O H 3 C L - O l e a n d r o s e O H 3 C H O M e O O H 3 C M e O M e O O H 3 C H O H O O H 3 C H O H 3 C O H 3 C H O O O H O H O H 3 C 3 , 4 - D i m e t h o x y - L - o l i v o s e D - O l i v o s e D - M y c a r o s e D - D i o l i v o s e 表柔红霉素和表阿霉素基因工程菌的构建 O OO C H 3 O H O H O H O H C H 3 O O H 3 C O H H 2 N D a u n o m y c i n o n e D a u n o s a m i n e 柔 红 霉 素 O O O H O HO C H 3 O O H H C H 3 O O H O H 3 C H 2 N 表 柔 红 霉 素 O OO C H 3 O H O H O O H H O O H 3 C O H O H N H 2 A d r i a m y c i n o n e D a u n o s a m i n e 阿 霉 素 O O O HO C H 3 O H O O H H O H O O H 2 N H O H 3 C 表 阿 霉 素 表柔红霉素和表阿霉素基因工程菌的构建 通过 钝化 dnmV基因 ，得到一个柔红霉素和阿霉素产 生菌的阻断突变株， dnmV基因编码 4酮基还原酶， 其与合成这类抗生素结构中的脱氧糖，柔毛霉胺的 合成有关。 分别将阿维菌素产生菌中编码 合成齐墩果糖的基因 avrE，以及红霉素产生菌中编码 合成 mycarose的基 因 eryBIV，克隆到 dnmV基因阻断突变株中。 由于重组工程菌中的外源基因表达的 4-酮基还原酶 的特性与柔红霉素产生菌中的 4-酮基还原酶不同， 前者具有非对映立体催化特性而能够形成 L- epidaunosamine（表柔毛霉氨） 。而突变株 dnmV生 物合成甙元的能力和合成糖基转移酶的能力仍然保 持，且由于糖基转移酶的底物专一性较差而不影响 将表柔毛霉氨连接在原来的蒽环酮上，从而得到 4- 表柔红霉素和 4-表阿霉素 ，如图所示。 表柔红霉素和表阿霉素基因工程菌的构建 O O H O O H O O O H O H O O M e N H 2 C H 3 O H O O H O O H O O O H O H O O M e N H 2 C H 3OH a ve E e r yE I V 阿霉素 4 - 表阿霉素 二、具有非核糖体生物合成肽类途径的 微生物药物产生菌的组合生物合成 具有 非核糖体生物合成途径（ none ribosomal peptide synthases， NRPSs） 的环肽或糖肽类 “ 天然产物 ” ，如万古霉 素、博莱霉素、环孢菌素 A和埃坡霉素等进 行了大量的研究工作，并取得了令人注目 的成果。 Chloroeremomycin 生物合成 （ 1）小分子准备 在酶的催化下生成装配过程中 需要的小分子化合物，对于万古霉素族糖肽类抗 生素而言包括： 非蛋白氨基酸和 TDP-L-b- epivancosamine； （ 2）装配 上步准备好的氨基酸通过腺苷化反应 （ adenylation）转换成为腺苷酸，而后与邻近肽 载体蛋白（ peptide carrier protein, PCP）上 的巯基形成硫酯（ thiolation）， PCP之间的缩合 功能域（ condensation）催化肽键形成。经过几 个延伸过程，最后 TE域将完成的肽切下。有时过 程中还会有差向异构作用 (epimerisation)。 （ 3）装配后修饰 在这步反应中通常进行氧化反 应和糖基化，对于有的化合物还存在 N端甲基化反 应。 万古霉素的生物合成 另据研究，天然的万古霉素生物合成共有 35 步，其先以 五种自由的氨基酸单体合成一线 形的七肽 ，然后芳基边链在交联酶的催化下 适时地组合、交联，形成复杂的七肽骨架， 最后 UDP-glucose和 UDP-4-epi-vancosamine 在糖基转移酶的作用下连接到七肽骨架上。 万古霉素生物合成的五种起始自由氨基酸单体 万古霉素生物合成的逆向合成分析图 在万古霉素家族中发现的糖基 GtfE糖基转移酶识别并将 UDP-glucose 转移至七肽骨架上 GtfD糖基 转移酶 识别并 将 4 epi vancosamine 连接至 万古霉 素骨架上 2、糖肽类抗生素的组合生物合成的研究现状 糖肽类抗生素的组合生物合成主要有 4条途经 : 第一，提供新的氨基酸单体，或者是利用已知生物合成途 经中的酶来催化生成新的我们所需要的氨基酸单体，使合 成新的七肽骨架 ; 第二，改变七肽 NRPS装配线上的基因，从而达到重新设计 生物合成途经的目的 ; 第三，在七肽装配之后，干预修饰酶（ tailoring）作用 的步骤，包括 N甲基化、酪氨酸的 羟化等 ; 第四，利用糖基转移酶将不同结构的糖基与不同苷元连接 以及连接不同的个数，从而产生具有不同生理活性的最终 产物。因此糖苷化酶可以作为一种制备各种不同糖苷化合 物的催化剂，有可能从中找到具有潜在应用价值的新活性 物质。 2、糖肽类抗生素的组合生物合成的研究现状 Solenberg等从万古霉素产生菌东方拟无枝酸菌 C329.4中克隆到了两个糖基转移酶基因 gtfE和 gtfD，并从 chloroeremomycin产生菌中克隆到了 3 个糖基转移酶基因 gtfA、 gtfB和 gtfC; 将 gtfB和 gtfE在大肠埃希氏菌中表达，研究了其 体外活性。结果表明当 TDP-葡萄糖存在时，从大 肠埃希氏菌中表达的糖基转移酶 GtfB和 GtfE能够 在体外将葡萄糖转移到万古霉素糖苷上，从而得 到中间体 DVV（ desvancosaminyl vancomycin） ; 当底物换为 UDP葡萄糖， UDP-D-木糖时，仍然能 够转移到万古霉素糖苷上 ; GtfE也能够将 TDP/UDP-葡萄糖转移到无糖基化的 化合物 A47934和 A41030上，而 GtfB不能将化合物 A47934糖基化，表明 GtfE相对于 GtfB底物特异性 差。 2、糖肽类抗生素的组合生物合成的研究现状 在 Matsushima等建立地无糖基化合物 A47934产生菌丰加链霉菌（ Streptomyces toyocanesis）基因转移系统的基础上， Solenberg等还成功地将含有糖基转移酶基 因 gtfE的质粒导入到丰加链霉菌中，得到 了糖基化的 A47934衍生物。 GtfE和 GtfB在体内进行的糖苷化反应 2、糖肽类抗生素的组合生物合成的研究现状 Losey等采用化学酶法合成了很多 NDP-葡萄糖的类 似物来研究 GtfD和 GtfE的催化活性。结果表明， GtfE不但能用 UDP-葡萄糖类似物， TDP-葡萄糖类 似物作为糖基供体，同时还可以采用脱氧葡萄糖 类似物以及氨基在 2、 3、 4、或 6位的 TDP/UDP-葡 萄糖类似物作为糖基供体 ; 更值得注意的是，一般来讲 GtfD将 vancosamine连 接至万古霉素的假糖苷的葡萄糖配基上，试验结 果表明 GtfD还可以将 4-epi-vancosamine连接至 GtfE以不同的糖基供体为底物所催化生成的衍生 物上（糖基化位点在 2-脱氧的除外）。这样产生 的带有两个氨基糖的万古霉素衍生物就提供了一 种新的结构，以便于继续进行类似于 oritavancin 的烷基化从而提高生物活性。 2、糖肽类抗生素的组合生物合成的研究现状 Chen等从 chloroeremomycin 的生物合成基因 簇中克隆到了 L-epivancosamine的合成基因， 在大肠埃希氏菌中表达，并成功地在体外重建了 从 TDP-4-酮基 -6-脱氧 D-葡萄糖经过 C-2脱氧合作 用 (deoxygenation)、 C-3胺化 (amination)、甲 基化 (methylation)、 C-4酮基还原、 C-5表构异化 等步骤得到了 TDP-L epivancosamine。这个糖 基的基因克隆和表达为以后组合生物合成提供了 信息。 2、糖肽类抗生素的组合生物合成的研究现状 对万古霉素等糖肽类抗生素进行的组合生 物合成，不单单可以通过外源添加不同的 糖基供体，还可以通过将产生菌体内原有 的糖合成途径进行破坏或置换、以及对糖 基转移酶进行改造等改变糖基化方式产生 新的化合物 ; 另外，对肽骨架装配时所需的氨基酸生物 合成的了解以及相关基因的分离和表达， 也为万古霉素等糖肽类抗生素的组合生物 合成提供了有益的信息。 2、糖肽类抗生素的组合生物合成的研究现状 目前对于研发新的万古霉素等糖肽类杂合抗生素 主要集中在对糖基化方式的研究和改造，但至今 为止绝大多数的研究是在大肠埃希氏菌中或在 S. toyocanesis等链霉菌中进行异源表达 ; 美国 Christopher领导的小组以及德国 Wohlleben 所领导的小组对万古霉素生物合成途径中的很多 酶进行了体外表达，并对酶学性质，立体结构等 进行了详细的研究，为万古霉素等糖肽类抗生素 的组合生物合成做了充分的准备 ; 但目前在万古霉素等糖肽类抗生素产生菌体内进 行组合生物合成还未见报道，关键可能是缺乏完 善的拟无枝酸菌遗传操作系统。 3、类胡萝卜素的组合生物合成 作为抗氧化剂，类胡萝卜素具有很大的药物应用 前景，如已经显示这类化合物对心血管疾病和肿 瘤具有相当的疗效 ; 迄今为止，已有 600多种类胡萝卜素的结构被确证， 但由于化学合成的困难，以及从微生物代谢产物 和植物组织中分离困难而难以实现产业化 ; 但是，近年来发展的组合生物合成技术，有可能 通过外源基因在 E.coli中的杂合表达，来制备这 些稀少的衍生物甚至产生新的类胡萝卜素化合物。 第三节 组合生物催化与 微生物新药的发现 组合生物转化（催化） （ combinatorial biocatalysis） 是指利用一种以上的具有特殊转化功能的 微生物或酶，对同一个母体化合物进行组 合转化，以得到化学结构的多样性，它是 从已知化合物中寻找新型衍生物以及从简 单化合物制备复杂化合物的有效手段 ; 从某种角度讲，它比化学合成的方法更为 简单和有效 ; 这是一个新的研究领域。 模拟生物体的生命过程，利用组合生物 催化技术构建先导化合物库 可用 于组 合合 成的 生物 催化 反应 反应类型 特异性反应 引进功能基团 CC键的形成 羟化反应 卤化反应 卤代醇的形成 环加成 加入胺 对已有功能基团的改造 氧化醇至醛和酮 还原醛和酮至醇 氧化硫化物至亚砜 氧化氨基至硝基 氧化硫至硫醛 水解腈至羧酸 用羟基置换氨基 内酯化 异构化 差向异构化 脱烷基化 甲基转移 加入基团至功能基团 酯化作用 酯的形成 氨基甲酸酯的形成 环化 胺化 磷酸化 利用生物催化发现先导化合物的优越性 可能进行反应的范围广； 能够定向进行区域选择性和立体选择性； 不需基团保护和脱保护，一步实现所需的反应； 在温和和均一的条件下可容易地实现自动化和一 步反应的重现性； 温和的反应条件复杂易变的分子结构的稳定性； 高的催化活性可以降低催化剂的用量； 酶的固定化可以使催化剂反复和循环使用； 生物催化剂在环境中完全被降解。 生物催化产生的分子库 前导化合物 库容量 内容 腺苷 92 2代 3