固定化酶及固定化技术

第五章 固定化酶及固定化技术 酶： 在水溶液中不稳定 一次性使用 -难回收，难连续化生产 用于医药 /化学分析纯度要求高 产物的分离纯化困难 。 要求将酶变成不溶性 实际上将酶限制在一定空间 固定化 固定酶具有催化活性 1916年，美国科学家发现 ， 酶和载体结合以后 ，在 水中呈不溶解状态时， 仍 然具有生物催化活性 。 固定化酶可重复使用 操作稳定性 酶在固定化后其活力可以缓慢释放 , 酶的稳定 性比天然状态高 , 可重复多次使用 . 结果如图所示 : 固定化酶的活力基本保持稳定活力损失 15% ,由此可见该固定化酶具有良好的 操作稳定性 例 :将 0.5g DEAE 纤维素固定化壳聚糖酶 与 10mL 1%壳聚糖 溶 液在 60 下连续反应 10 次每次反应时间为 6h 每次反应后 分别测定酶活力 一、固定化酶（ immobilized enzyme） 水溶性酶 水不溶性载体 固定化技术 水不溶性酶 （固定化酶） 什么是固定化酶？ 固定化酶：是指经物理或化学方法处理，限制 在一定的空间范围内，可以反复使用而又能发 挥催化作用的酶制剂。 酶的固定化技术包括 吸附、交联、共价结合（ 化学偶联）及包埋 等多种方法。 与固定化酶技术相配套的 是酶生物反应器 同一般的化工容器一样，需要对酶反应 器温度和 pH等条件进行严格的控制；不 同的是，酶反应器必须进行无菌操作。 酶生物反应器 简 史 1916年， Nelson 载体的影响 ： 在固定化酶的周围，形成了能对底物产生立体影响的 扩散层以及静电的相互作用等引起的变化。 载体与酶的相互作用： 载体与酶的直接作用可能表现为活力丧失、破坏酶结 构、封闭酶活性部位等。 改变之一：构象改变、立体屏蔽 构象改变： 酶分子构象发生某种扭曲，导致 酶与底物结合能力或催化能力下降 立体屏蔽： 固定化后，使得酶的活性中心或 调节部位造成某种空间障碍，使得效 应物或者底物与酶的临近或者接触受 到干扰 改变之二：分配效应、扩散限制 微环境： 微环境 是指在固定化酶附近 的局部环境，而把主体溶液 称为 宏观环境 。 分配效应： 由于载体性质，造成底物和 效应物等在微观体系和宏观 体系之间的不等性分配，从 而影响酶促反应速度 扩散限制效应：底物、产物和效应物等，在环 境中的迁移运转速度收到限制 DEAE 纤维素固定化壳聚糖酶 :以 DEAE 纤维素为载体戊二醛为交联剂 固定壳聚糖酶 改变之三：微扰 由于载体的亲水、疏水作用和介质的介电常数等性 质 , 直接影响酶的催化能力或酶对效应物作出反应 的能力 1.固定化后酶活力的变化 固定化酶的活力在 多数情况 下比天然酶小，其专一性也能发 生改变。 例如： 用羧甲基纤维素载体固定的胰蛋白酶消化不同底物： 酪蛋白（ 高分子）原酶活力的 30% 苯酞精氨酸 -对硝基酰替苯胺 (低分子 )原酶活力的 80%。 一般认为高分子底物受到 空间位阻的影响 比低 分子底物大。 原因： 酶结构的变化 空间位阻 不过，也有个别情况，酶在固定化后反 而比原酶活力提高，原因可能是偶联过 程中酶得到化学修饰，或固定化过程提 高了酶的稳定性。 Merlose曾选择 50种固定化酶，就其稳定性与固定化前的酶 进行比较，发现： 30种酶稳定性提高， 12种酶无变化， 8种酶稳定性降低。 然而，由于目前尚未找到固定化方法与稳定性之间规律性， 因此要预测怎样才能提高稳定性还有一定困难，但 大多数情 况下酶经过固定化后稳定性提高了 。 2.固定化对酶稳定性的影响 固定化后酶稳定性提高的原因 可能有以下几点： 固定化后酶分子与载体多点连接，可防止酶 分子伸展变形。 酶活力的缓慢释放。 抑制酶的自降解。将酶与固态载体结合后， 由于酶失去了分子间相互作用的机会，从而抑 制了降解 固定化青霉素酰化酶 将酶于 0.05 mol L的 PBS（ pH 7.5）中分别在 不同温度下保温 6小时， 冷却后测定酶活力。 固定化酶的热稳定性优 于自然酶 。 固定化酶的稳定性变化 1.固定化酶； 2. 自然酶 a.热稳定性提高 测试结果 :5天后其活性仍可保留 96% . 例 :将 DEAE 纤维素固定化壳聚糖酶 浸泡在 95%的 乙醇 中， 连续 5天测其催化活性 b.对有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高 提高固定化酶对各种有机溶剂的稳定性，使本来 不能在有机溶剂中进行的酶反应成为可能。 提高酶对某些抑制剂的稳定性 可以预计，今后固定化酶在有机合成中应用会进 一步发展。 c.对 pH的稳定性提高 青霉素酰化酶在不同 pH 值的缓冲液中，于 37 保温 16 h测定酶活力。 固定化酶在 pH 5.5- 10.3活力稳定； 游离酶则仅在 pH 7.0-9.0稳定。 固定化酶的 pH稳定性明 显优于游离酶。 d.对蛋白质水解酶的抗性 固定化后载体与酶的紧密连接对其起一定保护作用 , 并在空间上阻碍酶与大分子物质接近 , 从而降低了酶与 大分子物质结合的几率 ,防止酶被其他蛋白酶水解 . 此外： 有些固定化酶经过贮藏，可以提高其活性。 大多数酶经固定化后提高了贮藏的稳定性，如 固定化木瓜蛋白酶（琼脂）在 4 下， 120天酶活力 无变化。 对操作稳定性都有影响 如图：固定化酶的最适 温度为 60 C ，而游离酶 的最适温度为 50 C 而固 定化酶在 50- 65 C 范围 内都保持了较高的酶活力 ,这说明壳聚酶经固定化 后其在较高温度下的适应 范围有了明显提高 3.固定化酶的最适温度的变化 固定化后，酶的热稳定性提高， 所以固定化酶的最适温度提高 当然，也有报道最适温度不变或下降的。 4.最适 pH值的变化 酶的催化能力对外部环境特别是 pH非常敏感。 酶固定化后，对底物作用的最适 pH和 pH-活性曲 线常常发生偏移。 pH对固定化酶的影响 1） 载体带负电荷， pH向碱性方向移动。 载体带正电荷， pH向酸性方向移动。 （ 2）产物性质对体系 pH的影响 催化反应的产物为酸性时，固定化酶的最适 pH比游离酶的最适 pH值；反之则低 例 :取 0.2g DEAE 纤维素固定化壳聚糖酶与 5mL壳 聚糖酶液各 8份分别于不同 pH下测定固定化酶和游 离酶的活力 可见：固定化酶的最适 pH 向酸性偏移 例：取 0.15g固定化黄曲 霉毒素解毒酶 和 4ML黄曲 霉毒素解毒酶 液各 8份， 分别于不同 pH下测定固定 化酶和游离酶的活力 可见：固定化酶的最适 pH 向碱性偏移 影响固定化酶 Km的因素： 1.酶的空间立体障碍 载体为电中性时，由于 扩散限制 造成表观 Km上升。 2. 电荷效应 （ 1） 载体与底物带相同电荷， KmKm （ 2） 载体与底物电荷相反，静电作用， KmKm 3.溶液的离子强度 5.固定化酶的米氏常数（ Km）变化 例：取 DEAE 纤维素固定化 壳聚糖酶 0.2g 与 1%壳聚糖 酶液 5mL 各 6 份分别加入 2mL 不同浓度的 壳聚糖溶 液 (0.4% 1.5%)于 50 C 水 浴中保温 60min 测定还原 糖浓度，用双倒数作图求 得米氏常数 如图 ：经线性拟合可求得 Km(固 )=18.87g/L Km(游 ) =2.49g/L 五、评价固定化酶的指标 一般评价： 1 酶活定义（ IU)：在特定条件下，每一分钟 催化一个微摩尔底物转化为产物的酶量定义为 1 个酶活单位。 2. 酶比活定义（游离）：每毫克所具有的酶 活力单位 固定化酶 1. 固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有 的酶活力单位。 或：单位面积（ cm2）的酶活力单位表示（酶膜、 酶管、酶板）。 2. 操作半衰期：衡量稳定性的指标。 连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活 力一半所需要的时间（ t1/2） 3.偶联效率以载体结合酶量 (或酶活力 )的百分数表示： 由于在偶联反应中酶往往会有些失活，因此，测 定残留活力还不能正确反映与载体结合的酶活力， 所以，仍以测定蛋白量较为难确。 4. 活力回收 酶固定化 般比溶液酶的活力下降，固定化酶活 力占溶液酶活力的百分数称为活力回收率 。 5.相对酶活力：具有相同酶蛋白量的固定化酶活力与 游离酶活力的比值称为相对酶活力 六、固定化细胞 利用胞内酶制作固定化酶时，需要破碎细胞，然 后提取酶，这就增加了工序和成本。 科学家设想直接固定含所需胞内酶的细胞 固定化细胞与固定化酶比较，其 优越性 在于： 保持了胞内酶系的原始状态与天然环境 ，因而更稳定。 保持了胞内原有的多酶系统，而且无需辅酶再生 。 20世纪 70年代，科学家研制成固定化细胞，并且用于 生产。 例如，将酵母菌细胞吸附到多孔塑料的表面上或 包埋在琼脂中，制成的固定化酵母菌细胞，可以 用于酒类的发酵生产 固定化增殖细胞 发酵 更具有显著优越性 固定化细胞分类、形态特征和生理状态 ： 分类方式 固定化细胞类型 细胞类型 微生物、植 物、动 物 生理状态 死细胞：完整细胞，细胞碎片，细胞器 活细胞：增殖细胞，静止细胞，饥饿细胞 形态特征： 固定化细胞由于其用途和制备方法的不同，可以是颗粒 状、块状、条状、薄膜状或不规则状（与吸附物形状相 同）等， 目前大多数制备成颗粒状珠体，这是因为： 不规则形状的固定化细胞易磨损，在反应器内尤其是 柱反应器内易受压变形，流速不好， 圆形珠体由于其表面积最大，与底物接触面较大，所 以生产效率相对较高。 细胞被固定在载体内在形态学上一般没有明显的变化 。但是，扫描电镜观察到固定化酵母细胞膜有内陷现 象。无论用海藻酸钙、聚乙烯醇或聚丙烯酰胺凝胶包 埋，都有类似情况。形成 “ 凹池 ” 的原因尚待进一步 研究。 固定化死细胞： 一般在固定化之前或之后细胞经 过物理或化学方法的处理，如加热、匀浆、干燥 、冷冻、酸及表面活性剂等处理，目的在于增加 细胞膜的渗透性或抑制副反应，所以比较适于单 酶催化的反应。 固定化静止细胞 和 饥饿细胞 在固定化之后细胞是 活的，但是由于采用了控制措施，细胞并不生长 繁殖，而是处于休眠状态或饥饿状态。 固定化增殖细胞 又称固定化生长细胞，是将活细 胞固定在载体上并使其在连续反应过程中保持旺 盛的生长、繁殖能力的一种固定化方法。 与固定化酶和固定化死细胞比较 固定化增殖细胞能够不断繁殖、更新，反应所需的酶也就可以 不断更新，而且反应酶处于天然的环境中，更加稳定，因此， 固定化增殖细胞更适宜于连续使用。从理论上讲，只要载体不 解体，不污染，就可以长期使用。固定化细胞保持了细胞原有 的全部酶活性，因此，更适合于进行多酶顺序连续反应，所以 说，固定化增殖细胞在发酵工业中最有发展前途。 固定化增殖细胞发酵的优越性 1、可增殖，细胞密度大，可获得高度密集而体积小的生 产菌集合体 2、发酵稳定性好，可以较长时间反复使用或连续使用 3、发酵液中含菌体较少，有利于产品分离纯化。 (膜的 选择通透性） 4、有利于需要辅酶和多酶系统才能进行的反应 5、抗污染能力强 固定化细胞技术的局限性： (1)必须保持菌体完整，防止菌体自溶，否则，将影响产品纯度。 (2)必须防止细胞内蛋白酶对所需酶的分解，同时，需抑制胞内其 他酶的活性止副产物的形成。 (3)细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制作用 ,载体形成的孔隙 大小影响高分子底物的通透性 . (4)如利用的仅是胞内酶，而细胞内多种酶的存在，会形成不需要 的副产物； 但这些缺点并不影响它的实用价值。 固定化酶与细胞的选择依据： 对一个特定的目的和过程来说，是采用细胞，还是采用 分离后的酶作催化剂。要 根据过程本身来决定。 一般说 :对于一步或两步的转化过程用固定化酶较合适 。对多步转换，采用整细胞显然有利。 缺点： 固定化后的细胞不易与反应物接近，可能导致反应效果下降 固定化微生物和动植物细胞的应用 固定化微生物细胞：用于生产酒类、氨基酸、有 机酸、抗生素以及酶和辅酶，也可以用于有机溶 剂生产，废水处理等 固定化植物细胞：主要用于生产人工种子、香精 、色素、药物、酶等 固定化动物细胞主要用于生产疫苗 七、固定化酶的应用 1、在工业上的应用 用固定化酶可以生产 L-氨基酸，葡萄糖及葡糖浆、核苷酸、 半合成的抗生素母核等 L氨基酸的生产：用固定化酶（氨基酰化酶）折分 DL氨 基酸可连续生产 L氨基酸。如固定化的细胞（大肠杆菌） 生产 L Asp：以 120L柱式反应器 60天可生产 5吨的 L Asp。 乙酰 -DL -Ala L -Ala +乙酸 乙酰 -D Ala （ A-D-Ala） Aminoacylase 氨 基 酰 化 酶 泵 储 罐 反应产物 离心机 消 旋 反 应 器 固定化酶 柱子 晶体 L-Ala L-Ala A-D-Ala A-L-Ala A-D-Ala 固定化酶用于 水解牛奶中的 乳糖 牛奶中含有 4 3 -4 5的乳糖，乳 糖酶缺乏症的人饮用牛奶后将导致不 良后果。用乳糖酶可以将乳糖分解为 组成乳糖的两个单糖：半乳糖和葡萄 糖。用固定化乳糖酶反应器可以连续 处理牛奶，将乳糖分解 乳糖在温度较低时易结晶，用固定化 乳糖酶处理后，可以防止其在冰激淋 类产品中结晶改善口感。 严重肾脏疾病，需血液透析。过滤尿素和尿酸等代谢废物 利用固定化脲酶透析液和活性碳构成的体外循环装臵 固定化脲酶：脲酶与离子交换树脂通过微囊法制备而成的 脲酶水解尿素为氨和 CO2，氨被树脂吸附， CO2由肺呼出， 其他代谢物由活性碳吸附 2.在医药治疗上的应用 人工肾： 治疗癌症 正常细胞： L-Asn合成酶， Asn被消耗的同时不断 合成维持细胞蛋白质合成需要 癌细胞：缺少活无 L-Asn合成酶， Asn被消耗， 影响蛋白质合成，细胞 “ 饿死 ” 用固定化的 天冬酰胺酶 治疗 白血病 利用尼龙或尿素聚合物半透膜制备成微囊型 L-天冬酰胺酶 , 用于白血病治疗。 改变了酶的最适 pH； 微囊型酶对蛋白酶稳定； 注射到大白鼠腹腔内，急性毒性很低、也不会产生抗体； 除制成微囊型外，还有人采用酶管或酶板形式进行体外循 环治疗，也达到了预期的疗效。 微囊型固定化酶 将酶包埋在半透膜性质的聚合物内，制成所谓的 微囊型固定化酶 。小分子底物或产物可自由地透过 胶囊的半透膜，而酶作为大分子则不能透过胶囊； 此外，胶囊外的一些蛋白质、酶、抗体等高分子物 质也不能进入胶囊内部，这就避免了发生过敏性反 应。 胶囊型固定化 酶的另一大 优点 是， 胶囊内的酶仍以 溶解状态作用于底物 。因此突破了狭义的固定化酶的 定义，也为固定化酶应用于临床提供了可能性。 与此同时，人们采用人血清白蛋白替代尼龙、硝酸 纤维等作为制造胶囊的材料，使包装材料更具有安全、 稳定和体内易代谢等特点。 是一种与 x染色体连锁 的遗传代谢病 患者由于先天性缺 乏 HGPRT，导致体内次 黄嘌呤和鸟嘌呤补救途 径的障碍，并进而引起 肾结石、痛风。 Lesch-Nyhan综合症 Chang等人利用 微囊型 嘌呤氧化酶治疗 Lesch-Nyhan综合症，使次黄嘌呤的水平显 著下降，同时发现次黄嘌呤能很快地进 入 微 囊体 中并被代谢。 在以两岁半大的病孩所 做的临床试验中，他们也发现效果很好。 药物控释载体： 新的药物（包括化学合成药、天然药物及基因工程药物）不 断问世，但将它们应用于临床却并不很顺利： 很多药物尤其是蛋白质类药物，口服易被胃酸破坏或沉淀； 单纯注射后瞬时血药浓度升高，但马上被肝脏及血液中的酶 系统所清除，需要反复注射，不仅增加治疗费用，而且增加 了感染的机会； 肿瘤化疗用细胞毒性物质选择性较差，全身毒副作用严重； 有些药物如反义核酸亲水性强难于穿过细胞膜； 蛋白质类药物容易引起免疫反应； 很多药物稳定性差，不耐贮存。 以上问题往往不能用简单的药物改构来完成，因此， 为药剂学工作者提出了严峻的任务。近 30年来，药物 的新剂型发展很快，已逐步建立了基于药物理化性质 及作用特点的合理给药体系， 其核心特点是从时间和 空间分布上控制药物的释放。 在肿瘤的化学治疗及重组蛋白质类药物制剂中比较 重要的几种控释体系有 聚合物修饰、凝胶包埋、微 球、脂质体及免疫导向等 。 这几种控释体系都涉及到将药物与聚合物载体偶联 或固定于某种聚合物载体上，因此也可称为 载体药 物 聚合物修饰 多用于 蛋白质类药物 。这类药物生物半衰期短、免疫 原性强，可用适当的水溶性高分子聚合物加以修饰以 改善其性能。 羧甲基壳聚糖对天门冬酰胺酶的修饰 ,聚 乙二醇对原核表达重组人血小板生成素 分子的修饰等，均可起到降低毒性、延 长半衰期的作用。 此外，小分子药物也可使用这一系统， 如将抗癌药，羟基硫胺素及氨甲蝶呤偶 联于羧甲基纤维素后注射，可使荷瘤小 鼠平均生存时间较对照组延长 2倍左右。 凝胶包埋 即用生物相容性好的高分子聚合物与药物混合制 成含有药物的凝胶，植入体内特定部位，以达到 缓释给药的效果。 药物从凝胶中释出后，经周围组织吸收，然后进 入血液循环或直接局部作用， 避开了首过效应 ， 生物利用度高，作用时间长。 微球制剂 用高聚物微球包埋或化学偶联药物可制成微球 制剂，它具有：靶向性、缓释性及减少抗药性 等特点。微球与靶细胞接触，可以通过胞饮进 入胞内发生作用，不影响细胞膜通透性，不会 产生抗药性。 早期使用的微球制剂为不被生物降解的，多为口 服制剂。现在用于注射的多为可生物降解小于 1 m的微球， 如以生物可降解微球包埋入生长激素肌注动物， 血药浓度稳定、不产生抗体，注射部位组织无病 变。微球还可用于基因治疗及基因疫苗的载体。 脂质体 -磷脂双分子层在水溶液中，自发形成的超微型中空小泡。 现查明是因缺乏氨基己糖酶 A，使神经节苷脂累积在组 织内，从而出现神经迟钝、肌肉无力、失聪、视网膜有樱 桃红点等症状 . 黑蒙性痴呆 (Tay-Sach病 ) Weisman等用被覆抗体的脂质体（内含 氨基己糖酶 A）引入到 4例黑蒙性痴呆患者 细胞中，此时细胞不会把含酶的 脂质体 当 作异物。故能通过细胞膜进入细胞内，在 细胞内发挥酶的作用 。 此外，还有人利用嵌入从胎盘中提 纯的葡萄糖脑苷酯酶的脂质体来治疗 Gaucher病，发现也能获得较好的疗效。 缺点 : 单纯脂质体也还是依靠被动靶向性，因而 限制了其在肿瘤化疗中的应用； 脂质体在胃肠道转运、分布不稳定，缺乏 对血管的通透性。 等等 导向药物 导向药物具有主动靶向性，将针对肿瘤细胞的单 克隆抗体与化疗药物化学交联，可以直接作用于 肿瘤细胞产生杀伤作用，并且降低全身毒性。 半透膜 酶胶层 感应电极 酶电极示意图 3.在分析化学中的应用 在分析化学与临床诊断中 ， 固定化酶被制成酶试纸 、 酶柱 与酶管 、 酶电极而得到广泛的应用 。 4.在基础理论研究中的应用 主要集中在酶本身的生化和分子生物学研究以及蛋白质 、 核 酸和遗传工程中的研究应用 。 此外，固定化酶及其技术，还可以用于研究微生物的代谢机 理，研究生物发光机理等。 1）生物化学及分子生物学基础研究 如：酶的结构与功能的研究、多亚基酶及多酶体 系组装方式的研究及凝血及血栓溶解的生化过程 研究等。利用固定化酶在相界面催化反应的特点 ，还可用它来复制酶膜的模型。将多酶系统包埋 于微囊内，可用于酶系统的组装、定位及代谢的 研究等 阐明酶反应机理 对于葡萄糖生成 3-磷酸甘油醛反应，中间要经过 已糖激酶、磷酸葡萄糖异构酶、磷酸果糖激酶、 醛缩酶的作用。将这些酶固定化后装柱，让葡萄 糖依次过柱，果然可得 3-磷酸甘油醛，这既说明 了每一个酶的作用，也可证明了该反应的反应机 制。 酶亚基性质的研究 因为亚基不易分离，正常条件下无法比较 由于载体的空间限制，脱落的亚基不能再与载体上的亚基 重新结合，利于单亚基的研究 8 M 尿 素 透 析 醛缩酶有 4个亚基，控制条件使酶分子只有一个亚基通过共 价键与 CNBr活化的琼脂糖凝胶结合。当用 8 mol/L的尿素使 蛋白变性后，未被固定的亚基被透析除去，只有固定化的亚 基保留，这样就可对单亚基进行研究， 醛缩酶的亚基可有活性。 固定化衍生物 活力 蛋白质 比活 全酶 100 100 4.5 亚基 9.8 27.5 1.6 揭示酶原激活机理 有时酶原激活并不涉及蛋白水解。酪氨酸酶原固定 化后，不须肽链水解就可活化至天然酶的 2030%活 力。荧光技术证明，活化酶原在结构上与固定化酪 氨酸酶类似，证明了 结构重排在酶原激活中的重要 性 。 此外： 蛋白质在载体上的固定化可用于粗略阐明蛋白质 的结构。例如，蔗糖酶固定在带电载体上，蛋白 质三级结构中的许多盐桥被破坏，而酶在很大程 度上失去稳定性。这个事实说明，静电相互作用 （特别是盐桥）是蔗糖酶结构完整性所必须的 固定化酶在实际中的其他应用 医药 农业 环保 食品 其他