《DNA的复制》PPT课件

第十一章 DNA的复制 第一节 半保留复制的验证 半保留模型 （ semioconservetive model） 全保留复制模型 (conservetive model) 分散模型 (Dispersive model)。 半保留复 全保留复 分散模型 制模型 制模型 15 N 15 N 15 N 15 N 15 N 15 N 第一次复制 1 4 N 15 N 15 N 14 N 15 N 15 N 14 N 14 N 14 N 14 N 15 N 15 N 15 N 15 N 14 N 14 N 第二次复制 图 1 1 - 1 三种不同的复制模型 验证半保留复制的实验 一、 Meselson-Stahl实验 二、 Taylar实验 三、 姐妹染色单体差别染色方法 （ sister- chromatid differential staining） 5溴脱氧尿嘧啶（ 5-Bromodeoxy uridine， 简称 BUdR） 斑色染色体 （ Harlequin chromosome） 四、 Cairns复制模型 型复制 15 N 15 N 14 N 14 N/ 15 N 1 5 N D N A 浓度 14 N 14 N/ 15 N 1 5 N 离心 第 1 4 N 一 14 N 15 N 14 N 15 N 次 离心 实 验 14 N 15 N 14 N 14 N 14 N 14 N 14 N 15 N 离心 第 离心 二 次 实 验 14 N 15 N 离心 密 度 ( a ) ( b ) ( c ) 图 1 1- 2 M e s el s o n- St ah l 实验 ( a) 实验结果的解释 ( b) Ss C l 梯度离心的结果； ( c ) 离心后 DNA 的吸受率 图 11-4 Taylor 蚕豆根尖放射自显影实验。 (a)按半保留复制预期 DNA在复制过程中标记情况； (b)实验结果染色体放射自显影的图示。 (a ) 2 H 3 H 2 H 2 H (b) 2 H 3 H 2 H 2 H T/ T 第一周期 M 1 T/BUdR BUdR/T 第二周期 M 2 B U d R 第三周期 M 3 第四周期 M 4 图 11 - 5 姊妹染色单体差别染色的原理和结果 3 H + C E D 1 . 5 代 B A 放射自显影 图 1 1 - 7 C a i r n s 实验原理及过程 第二节 复制的起点、方向和终点 一 . 研究方法： 1. 用同位素标记电镜观察及变性法 2. 用噬菌体插入标记法 同步培养 不同步培养 3. 变性定性法 （ denaturation mapping） 4. 双向电泳法 O r i t / O r i t (a) ( b) 图 11 8 ( a ) 若有固定起始点，双向负制， 则复制终点应在起点的对面。 ( b ) 若有固 定起始点 , 单向复制 ，则复制终点应和 起点重叠。 图例：未标记 ，轻标记 ， 重标记 图 1 1 - 1 0 用同位素标记复制叉来确定是单向复制还是双向复制 图 11-11不同步培养时各标记的拷贝数不同 复制起点标记的拷贝数应最多 1 2 3 4 1 2 3 1 2 1 R R 0 1 2 3 第一组中性琼脂糖电泳 + 第二组碱性琼脂糖电泳 + ( b) ( a ) ( c) 探针 1 杂交 探针 2 杂交 探针 3 杂交 图 1 2 - 1 3 双向电泳定位法 二、原核的复制起点和方向 E.coli定点 、 双向对称复制 。 T7在近一端的 17 处开始 ， 向两端延伸 。 枯草杆菌有固定的起始点 ， 双向不对称复制 。 质粒 R6K早期为单向复制 ， 复制了约 1/5基因组 进行时双向复制 。 质粒 Col E1有固定起始点 ， 但却为单向复制 。 mt DNA进行 D（ displaced loop） 环复制 真核有多个复制起点 （ i） ， 双向等速复制 。 O ri O ri O ri (a) 枯草杆菌 (b ) R 6 K 质粒 ( c ) Co l E 1 图 1 1 -1 4 原核生物中特殊的复制类型 D环复制 第三节 DNA复制突变型的筛选 一. 根据温度敏感性筛选 二. 同位素标记法筛选 三. 5溴尿嘧啶掺入法 四. 质粒温度敏感性的筛选 五. 根据抗药性筛选 六. 根据与突变有关的生物学功能筛选 七. 快停突变与慢停突变 第四节 原核生物复制的酶系统 一. DNA合成酶 DNA聚合酶的共同特点是： （ 1） 需要提供合成模板； （ 2） 不能起始新的 DNA链 ， 必须要有引 物提供 3 OH； （ 3） 合成的方向都是 5 3 （ 4） 除聚合 DNA外还有其它功能 。 表 11-1 E.coli 中的三种 DNA多聚酶 DNApol DNApol DNA pol 结 构 分子量 109 KD 90 KD 900 KD 构成 单体 单体 异多聚体 分子数 /细胞 400 ？ 10-20 酶 活 性： 5 3聚合酶 + + + 3 5外切酶 + + + 5 3外切酶 + (可切单链 ) 突 变 体 突变位点 pol A pol B polC(dnaE), dnaN, dnaZX, dnaQ, dnaT 突变表型 修复有缺陷 能修复 阻止复制 (一 ). DNA聚合酶 I的结构 DNA聚合酶有 6个结合位点： (1) 模板结合位点； (2) 引物结合位点； (3) 引物 3 OH结合位点； (4) 底物 dNTP结合位点； (5) 53 外切酶结合位点； (6) 35 校正位点。 聚合 3 5 外切 5 3 外切 3 5 dN TP N M P 5 3 图 11-19 DN A 聚 合 酶的 结 构 和 功 能 (二 ). DNA聚合酶 的功能 1. 5 3聚合功能 2. 3 5外切活性 3. 5 3外切活性 (1)切口平移 （ nick translation） ； (2)链的置换 ； (3)模板转换 （ template-switching） 4. 内切酶活性 5 3 G T A A G T C G C T C A G C 5 3 3 5 外切 核 酸酶水解部位 图 1 1 - 2 0 D N A 聚合酶的 3 5 外切酶活性 ( 仿 D . Fre i f el d e r : M O L E C U L A R B I O L O G Y 1 9 8 3 , F i g . 8 - 1 6 ) 3 5 G G A C A A G A G A C G T T C T 5 3 内切酸酶水解部位 图 1 1 -2 2 D N A 聚合酶的内切酸活性 ( 仿 D . Fre i f el d e r : M O L E C U L A R B I O L O G Y 1 9 8 3 , F i g . 8 - 2 0 ) 5 3 - O H 5 - P 3 5 3 3 5 缺口平移 链的置换 模板转换 5 3 5 5 3 5 3 3 5 3 5 3 5 ( a ) ( b ) ( c ) 图 1 2 - 2 1 D N A 聚合酶 5 3 外切活性的功能 (三 )DNA多聚酶 的结构 P o l * 核心酶 ： 1 3 0 K ( p o l C 即 d n a E) D N A 合成 ( 4 7 0 K ) ( 1 6 5 K ) ： 2 5 K ( dna ) 3 5 外切酶活性 , 校对 2 核心 2 合成 D N A ： 10K 使核心酶相互连接。 Pol 增加进行性 ( 7 5 0 K ) ： 7 1 K ( d n a Z X ) 使核心酶形成二聚体，与模板连接。具有 全酶 使 复 ATP 活性。 合成前 合体结合 导 链和 模板 ： 3 2 K E F , 催化 亚基转移到模板链上。 E F 后滞链 复合体 ： 5 2 K ( d n a Z X ) 催化 亚基转移到模板链上。 ( 附加亚基 ) ： 35K ： 1 5 K ： 12K ： 4 0 K ( d n a N ) 识别模板链，将酶 “夹”到 D N A 链上。 图 1 1 - 2 3 D N A 聚合酶 的成分与功能 全酶在 DNA上的装配分为三个阶段： （ 1） 一个 二聚体加上一个 复合体识别引 物模板形成一种 前起始复合物 。 （ 2） DNA在于 ,复合体结合的位点构象 发生改变 ， 而对核心酶产生了高亲和 。 使核心酶能与 DNA结合 。 （ 3） 二聚体结合核心聚合酶 ， 使其二聚化 。 二 . DNA连接酶 其作用机制是分三步进行： 1、 E ATPE AMP ppi 在 E.coli中 ， E NADE AMP NMN（ 烟酰胺单核苷酸 ） 2、 E-AMP上的 AMP转移到 DNA的 5-PO4上使其活 化 3、 活化的 5 PO4与相邻的 3 OH作用形成 3 5 磷酸二酯键 ， 并释放出 AMP。 三 . 单链结合蛋白 又称为双螺旋去稳定蛋白（ helix destabilizing protein） 由 177个 aa组成 在 E.coli 中以四聚存在 分子量为 74KDa 在原核中 SSB与 DNA结合表现出协同效应。 （ 1） SSB之间的相互作用； （ 2） 第一个 SSB和 DNA的结合改变了 DNA的结构 。 四 .解旋酶 (helicase) 表 1 1 - 3 E . c o l i 及噬菌体的解旋酶 解 旋 酶 结 构 功 能 D n a B 3 3 0 K 六聚体 结合与 O r i C , O r i 参与前引发分 离双链，水解 ATP , 提供能量。 rep 蛋白 66 K 单体 ATP 依赖性解旋酶，在 X 1 7 4 滚环 复制中推进复制叉 P r i A ( w 蛋白 ) 82 K 单体 X 1 7 4 R f 形成中参与前引发体 3 5 移动取代 S S B ，识别特异位点。 T r a Y / I 多聚体 F 因子滚环复制中解链。 基因 4 蛋白 58 K T7 噬菌体复制中延 5 3 解 链。 第五节原核生物，噬菌体和病毒的复制起 始和终止 一 .环状 DNA的复制 GATCTNTTNTTT TCTGGATA A T TtGG A TAA R 1 R 3 L M R 1 2 3 4 2 3 6 2 8 0 8 8 1 8 6 1 9 4 2 3 1 2 3 9 2 6 0 2 6 8 R 2 R 4 A A T A t G T G A A A T A G G T G T 1 3 聚体 9 聚体 2 4 5 b p 图 1 1 - 2 7 E . c o l i 复制 起点 O r i C 的结构 复制起始区的结构特点是： （ 1） 富含 A T， 这可能和双链易于解开起始 复制有关； （ 2） 含有多个回文结构 （ 9 14个 GATC） 8个 GATC较保守 ,CATC中的 “ A”已甲基化 ; （ 3） 具有 4个反向重复顺序 ， 作为蛋白结合 位点； （ 4） 此顺序的右侧毗邻区域有两个起动子 ， 其可能的作用是： 转录产生引物； 产生复 制必要的蛋白； 产生调节功能的 RNA； 起 转录激活作用 。 复制起点具有 3 个 1 3 b p 和 4 个 9 b p 的重复顺序 G A T CT N T T N T T T T T T A T N CA N A D n a A 单体结合在 9 b p 的重复顺序上 1 3 b p 9 b p 20 40 个 D n a A 单体形成一个大的复合物 在 1 3 b p 重复顺序上 D N A 解链 D n a B / D n a C 结合成复合体，产生了复制叉 D n a B D n a B D n a C 图 1 1 -2 8 前引发涉及到系列蛋白的连续装配并导致 D N A 的解链 ( 引自 B. L ew i n : G E N E S , 1 9 9 7 ， Fi g 1 5 . 1 8 ) 表 1 1 - 4 在 O r i C 上前引发所需的六种蛋白 蛋白 功能 对蛋白质的要求 D n a A ( S ) 协同结合于 9 bp 和 13 bp 重 复顺序 2 0 - 4 0 单体 D n a B ( F , S ) 结合于 D n a A ，提供解旋酶 活性 1-2 六聚体 D n a C ( F , S ) 和 D n a B 形成复合体 六个单体 HU 组蛋白样蛋白，激发复合 体形成 5 个双体 G y r a s e 旋转酶，解除正超螺旋， 引入负超螺旋 催化 s s B ( F ) 稳定单链 化学剂量，四聚体 ( S ) : 慢停突变； （ F ）：快停突变 P R /O R O ri c r o c o p 右向转录 复制起 启动子 始区 图 1 1 - 3 1 噬菌体右向转录启动子对复制起始的激活 是必须的 ( 仿 B . L ew i n : G E N E S , 1 9 9 7 ， Fi g 1 9 . 1 8 ) 表 1 1 - 5 在 O r i C 和 O r i 上起始涉及相同的反应 阶段 O r i C Ori Ori 的识别与解链 D n a A O D n a B D n a B D n a C P 解旋酶的结合与解链 R N A p o l R N A p o l D n a J ? D n a J ?释放复合体 D n a K ? D n a K G y r a s e ?复制叉的移动 SSB ? 引发 D n a G D n a G 摘自 G e n e V ， 1 9 9 4 ， B . L e w i n . T a b l e 1 9 . 6 表 1 1 - 6 1 7 4 的复制周期 阶段 时间 （分） 行为 SS RF 0 1 吸附和穿透。病毒单链经复制 成复制形 （ RF1 ）， R F 1 转录。 RF SS 1 20 25 亲代 RF 经复制产生 60 个子代 RF ， RF 和宿主 D N A 的半保留复 制停止。 RF SS 20 33 40 子代 RF 形成 35 个滚环，复制 出 500 个 ss 分子，包装入噬菌 体颗粒，细菌裂解。