枯草芽孢杆菌在生物菌肥中的应用

枯草芽孢杆菌在生物菌肥中的应用作者:级生物工程4班 陈聪指引教师：马传营 技术员 摘要:简介了生物菌肥的种类和特点,分析了菌肥在提高土壤肥力、协助营养吸取、增进矿质营养释放、改善品质及增产和减少病虫害等方面的作用。分析了生物菌肥相对于化肥的优势以及国内外对生物菌肥的研究状况,并对其发展进行了展望。枯草芽孢杆菌作为一种具有研究、应用和商业价值的微生物菌种在生物菌肥的研究中起到了重要作用，近年来国内外对枯草芽孢杆菌的研究应用有了很大的进展，运用其对玉米小斑病菌的拮抗作用可研发生产有效防治玉米小斑病的生物菌剂。核心词：生物菌肥;枯草芽孢杆菌；玉米小斑病菌;拮抗作用;生物防治Te aplatn ofBacilus subtlis n bioetilizeAstrat:Deribesthe type and charactestics of bo-ertilizer， alyses the uio of fertilizer t mprove soil fertli,helpnten bsorto, romoe theeeas of mner ntriets, proveopquaiy, crease crpprdution an reduceps nd disass et. Anlyse advnes o the bioloil fertilir cmpared to te chemicl fertlizes and theresearc siaton i Chia n aroad, so iscussed isdvelopent n the fuue. Bacilluubtis a a knd omicbial strains has payd n porat rolei testudy bio-fertlizrbecause ofits rsarc，appliction and cmmercal vale， in ren yea,theesearha ppication oBaclus subils in Ca an aro hs gained aeat progress, using ts antanstimecansmon Bipars mydiscn poduce new biologica antsoeffctivly pree te southern lef blght of cor.Keyword: bio-frtilir;Baius ubili; Biolaimydis ; Antonim； Biologial Conl 1引言1.1 生物菌肥的发展长期以来,由于国内在农业生产中大量使用化学肥料,使得所施肥料的运用率低，致使土壤板结、土壤微生物区系发生变化、食品质量不安全，还导致大量的经济损失和环境恶化等一系列的社会问题，由于化学农药的大量使用，使病虫产生了抗药性,化肥农药的残留严重危害了人类健康。在目前农业可持续发展的形势下，开辟微生物肥料部分替代化肥日益受到注重1。生物菌肥是近年来发展起来的一种新型肥料,它是一种多元素肥料，重要由固氮菌、解钾菌及多种微量元素和腐殖酸构成。由于具有大量的微生物，生物菌肥重要以微生物生命活动的产物来活化土壤，改善作物营养条件和生长环境，此外，生物菌肥还具有改良土壤、抗旱、培肥地力、促早熟、抵御病虫害等功能，还能解决土壤化肥农药残留等问题，从而发挥土壤的潜在肥力,提高农产品的产量和品质。枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种。是一种好氧型、内生抗逆孢子的杆状细菌,广泛存在于自然界中如土壤、湖泊、海洋和动植物的体表,自身没有致病性。该菌作为植物病害生防细菌之一,具有较强的防病作用,在极端的条件下，还可以诱导产生抗逆性很强的内源孢子2.由于该菌能产生耐热的芽孢,既易于生产，进行剂型加工,又易于存活,定殖与繁殖。枯草芽孢杆菌的批量生产工艺简朴，成本较低，施用以便,储存期长，并且其制剂的稳定性，与化学制剂的相容性和在不同植物、不同年份防治效果的一致性方面均优于不产生芽孢的细菌和真菌生防菌株，是一种较抱负的生防微生物。1 生物菌肥的种类及特点狭义的生物肥料，是通过微生物生命活动,是农作物得到特定的肥料效应的制品，它自身不含营养元素，不可替代化肥。广义的生物肥料既具有作物所需的营养元素,又具有微生物制品,是生物、有机和无机的结合体,也可以说是运用高科技手段将野外环境中筛选出来的微生物经诱变、复壮后,再经工业发酵精加工而成的一种高含菌量的生物制品。.2.1 生物菌肥的分类生物菌肥从作用上可分为:生物固氮菌剂；分解土壤有机物菌剂(有机磷细菌肥、综合细菌肥)；分解土壤难溶性矿物质的菌剂（硅酸盐细菌肥料、无机磷细菌肥料)；抗病与刺激作物生长的菌剂(抗生菌肥料）。从成分上可分为：单纯生物肥和有机-无机-生物复合肥。单纯生物肥只富含微生物,单独使用不能给农作物供应充足的营养，需与化肥或者有机肥混合使用；有机无机-生物复合肥综合了各类肥料的特点,可以提供较为全面的营养需要。.2.2 生物菌肥的特点生物菌肥作为一种生物制剂与化学肥料相比具有如下特点：不破坏土壤构造，保护生态,不污染环境，对人、牲口和植物无毒无害;肥效持久;提高作物产量和改善作物产品品质;成本低廉；有些种类的生物菌肥对作物具有选择性;其效果往往受到土壤条件（如养分、有机质、水分、酸碱度等）和环境因素（如温度、通气、光照等）制约；一般不能与杀虫剂、杀菌剂(杀真菌或杀细菌)混用；易受紫外线的影响，不能长期暴露于阳光下照射4。1.3 生物菌肥的作用1. 增进土壤形成微生物在土壤形成过程中起到了至关重要的作用,土壤中具有的有机质和微生物的活动使土壤中具有丰富的矿物质元素，从而可以培养农作物,生物菌肥具有大量的微生物，进一步提高了土壤培养农作物的能力。1.3.2 提高土壤肥力水平微生物在生命活动中，不断分解土壤中的有机质,产生多种有机酸(如腐殖酸),增强土壤的保肥能力。在改善土壤物理性质、化学性质和生物性质的同步，生物菌肥的使用也很大限度提高了土壤的全氮量，使得土壤全量养分的含量提高。此外，生物菌肥使土壤养分可以反复运用,如氮、钾、磷等,提高了土壤养分的有效性。1.3.3 提高作物产量调查成果显示：生物菌肥在于化肥结合使用下，比老式化肥施用方式增产5%-10%，占增产报道总数的8,增产10-15%的占到220%，增产5%-2%的占13.8%，报道增产2%以上的占208%。.3.增长作物抗性在生物菌肥进入土壤之后,一方面有益菌在植物根际大量繁殖，在植物根区形成优势种群，同步有益菌在生长繁殖过程中，还会分泌出多种有机酸和抗生素等物质,从而克制病原菌等有害菌的繁殖;另一方面,有些有益菌群在植物根部形成一道生物屏障,以制止有害菌的入侵和定殖5。.3. 减少环境污染化肥的滥用、污水灌溉导致环境污染、土壤质量下降、农产品质量下降等问题，而生物肥料不会带来着这些负面影响，反而会协助解决工业垃圾和生活废弃物的解决,增长土壤肥力，降解土壤中残留农药化肥，减少环境污染。.3.6提高作物品质国内外大量研究和实验证明,生物菌肥的科学使用不尽可以提高作物产量,减少成本,保护环境,并且可以明显提高农产品的品质,如蛋白质、糖、维生素等物质的含量均有所提高，在有些状况下，改善产品品质比提高产量的好处更大。1. 生物菌肥中的有效微生物自然界中不少微生物（病毒、细菌、真菌和线虫）具有杀虫、杀菌、除草及植物生物调节活性。此类微生物具有很高的专一性,其对靶标害物具有极高的选择性,而对其她生物却十分安全。运用微生物的这种特性生产的菌肥分为细菌肥料、放线菌肥料、真菌类肥料、光合细菌肥料、复合菌剂肥料等。 枯草芽孢杆菌作为细菌的一种,也具有作为有效生物菌肥菌种的潜质。14.1 枯草芽孢杆菌在农业中的应用随着科学技术的发展，人们对微生物的研究更加进一步。由于生物防治对环境生态和人类健康无毒害的长处而备受注重，从而得到了越来越广泛的应用。枯草芽孢杆菌作为一种有效恢复土壤活性及防治害虫的优良菌种，具有较悠久的研究历史,目前在全球范畴内有数百株野生型枯草芽孢杆菌记录保存，该细菌可以产生40余种抗菌物质，其中诸多具有优良性状的菌株已应用于生产实践,例如，美国的GE3、B60、ST1和B. sbtilis. ar ayloli quecins,澳大利亚开发的B ubtilis 3, 日本东京技术研究所的B sbtilis R-14,中国研发的B96、B908、B、B3、XM6等6。4. 枯草芽孢杆菌国内研究概况国内对枯草芽孢杆菌的研究重要涉及大田作物的叶部病害、果实病害和土传病害等。枯草芽孢杆菌可以从植物体内分离出来,研究表白植物内生菌对植物生长具有增进作用，内生菌可增进宿主植物对N、P等营养元素的吸取,对宿主植物的生长起增进作用7。不同菌株的作用机理存在很大的差别。现已从作物的根际土壤、根表、植株及叶片上分离筛选出多株可以拮抗不同作物病害的枯草芽孢菌株，并对这些菌株进行了发酵条件的研究,对其中分离处得抗菌物质进行了特性研究，同步开展了温室和大田实验。国内已成功开发并投入生产的枯草芽孢杆菌商品制剂有麦丰宁、纹曲宁、依天得、百抗、根腐消等。其中麦丰宁对小麦纹枯病田间防效达5080，它重要产生一种抗菌物质来始终病原菌菌丝的生长、菌核形成及萌发。纹曲宁是00亿活芽孢/l枯草芽孢杆菌水剂和25井冈霉素的复混制剂。“百抗”已在多种省推广使用。百抗对水稻纹枯病防效0%以上，其作用机制为位点占领、营养竞争等。根腐消重要防治三七根腐病。枯草芽孢杆菌为细菌性植物保护剂，是多种植物病原菌的竞争性克制剂。它通过竞争性生长繁殖占据生存空间的方式来制止植物病原菌的生长,能在植物表面迅速形成一层保护膜，使农作物免受病原菌为害。枯草芽孢杆菌还能分泌抑菌物质，克制病菌孢子发芽和菌丝生长。下表列出了国内研发的重要枯草芽孢杆菌制剂。表1 国内已注册的枯草芽孢杆菌菌剂产品8Tale 1Bacilus sbli bacium agent produt regiteed in hn产品名公司有效成分剂型重要防治对象文曲宁江苏农业科学院植保研究所B. sbtlis 916+井冈霉素水剂水稻纹枯病、稻曲病百抗云南农业大学，中国农业大学和云南星耀生物制品厂B. sutil B90可湿性粉剂水稻纹枯病，三七、烟草、花卉、小麦、白菜等土传病害台湾宝光华化工股份有限公司B. subtis可湿性粉剂白粉病、灰斑病、炭疽病等疾病麦丰灵南京农业大学B. suili 3粉剂小麦纹枯病亚宝香港经纶全汛有限公司B.subls可湿性粉剂水稻纹枯病、稻瘟病、甘蓝黑斑病枯草芽孢杆菌S08杀菌剂武汉天惠生物有限公司B. tilisBs-2可湿性粉剂,水剂黄瓜白粉病、草莓白粉病和灰霉病、番茄灰霉病、棉花黄萎病、枯萎病和立枯病等增产剂中国农业大学植物生态工程研究所与上海农乐生物工程为制品厂Bacillus. spp可湿性粉剂,水剂活体微生物生长调节剂,对作物具有壮苗、抗病及增产作用威绿达浙江大学生物技术研究所 uis 绿色木霉毛壳酶菌肥有效防治猝倒病、根瘤病、立枯病、枯萎病等病害,增进作物生长,增长作物产量1.4.3 枯草芽孢杆菌国外研究概况二十世纪四十年代,枯草芽孢杆菌被证明具有避免植物病害的作用。自此之后,对枯草芽孢杆菌的研究成为各国的研究热点。枯草芽孢杆菌可以防治水稻等作物的多种土传真菌病害、豌豆根腐病等。迄今为止，已有多种枯草芽孢杆菌制剂应用于农业生产中,例如由美国研发并登记注册的杀菌剂erede和SouataS, 可防治蔬菜水果灰霉病、白粉病等真菌和细菌病害。韩国研制的杀菌剂Mildewide， 重要防治霜霉病、白粉病等真菌病害。俄罗斯开发的可湿性粉剂Aliine-B， 重要防治做种作物真菌病害。迄今为止美国己有4株枯草芽抱杆菌 ( B subi)生防菌株 （ST713、 MB160、 GB03和FZB2 )得到了美国环保署( EA)商品化或有限商品化生产应用许可。QS T713为美国 gra ue公司开发出来的活菌制剂, 商品名Senade ， 不仅通过美国环保局 ( EA)的登记并且还得到食用作物病害应用的审批和承认,通过叶面施用能防治蔬菜、樱桃、 葡萄、葫芦和胡桃多种作物的白粉病、烂根病、霜霉病、疫病、灰霉病等细菌和真菌引起的病害。下表2具体列出了近年来世界各国研发的重要枯草芽孢杆菌制剂。表美国已注册的防治植物病害的枯草芽孢杆菌生物制剂Tale 2 Seled sulis-based diease b-ontrol protsin American0ouct nameCmpanBaills comontorulon ypmar targetSeradAgr Qst. Davis. B. ubilisQST713W. qeoussusesionu. bateriao ltiplevegetabe, fruitsEco GuarNovoewSalemVAB. ichoniformis SB 308HowableScerotiia hmoecapa on turfKdiakGustaon Po. B. subtiis GB03WP（Cc） foebleFung n ton lgeeeedlemes sobnsYield sldustafso. pluGB34P(Conc.）uni in soybensBoYieldGustasonB. myloli qufacins GB9+B. sbilis GB122Dry fauni on bdng lans in ottigmixsSubtilxMcrobio Ltd.sbtl M00W(onc)Fungoncotton, largsededegu, soybensi Sick L +StleBeer UnderwoodB. subtili BI600+izbimFableFngi on soybans, peanuts15 枯草芽孢杆菌的研发存在的问题尽管在枯草芽孢杆菌生物菌剂研究中已经获得了相称瞩目的成就,但仍然存在着某些迫于解决的问题。枯草芽孢杆菌作为一种生防微生物，在对农作物施用过程中易受到土壤、温度、土壤微环境及作物生长状况等因素的影响,从而使得生物防治效果不稳定,还不可以合用于大范畴的作物施用。大多数的枯草芽孢杆菌制剂还处在实验室研究阶段,没有进入实际应用。.1产品原则化 在衡量农药产品的原则中,只把侧重点放在药效上而忽视了有害杂质的含量，没有明确规定对对有害杂质进行限量导致某些农药产品产生副作用。国家工商总局组织辽宁地区市场抽查，共抽查了3个经销单位的个产点，杀菌剂的合格率仅为3.7%11。目前国内没有严格的原则来衡量枯草芽孢杆菌的有效成分，有些以有效杀菌成分为原则,有些以活芽孢数位原则，并且国家统一的原则来进行有效杀菌成分的检测。15.生产成本高在枯草芽孢杆菌发酵过程中分泌的有效杀菌物质较低，并且在生产发酵过程中容易感染杂菌，种种因素使得发酵操作规定的成本过高,研究开发一种新产品所耗费的时间较长,应用于农作物后效果不明显,防治对象单一等等问题都提高了生产成本。15 实际应用中存在问题 枯草芽孢杆菌菌剂从实验室研发到走向田间是一种复杂的过程，重要问题是菌剂的货架储存期短。此外,有关枯草芽孢杆菌的基本理论研究不够多，在实际应用过程中,往往要考虑多方面的因素,而不单单是菌剂的作用机理,例如,土壤的温度、湿度、H等都也许对枯草芽孢杆菌的活性导致影响,从而使枯草芽孢杆菌活性减少或者使其产生的有效杀菌物质降解,因此防治效果不抱负。此外,由于菌剂的价格问题，使得许多农业生产者不会选择此类制剂。16 立题根据玉米小斑病是由Bipolris aydis所引起的一种真菌病害,是甜玉米生育期的常发性病害。病菌以菌丝和分生孢子在病株残体上越冬，次年产生分生孢子,成为初次侵染源。分生孢子靠风力和雨水的飞溅传播,在田间形成再次侵染。其发病轻重,和品种、气候、菌源量、栽培条件等密切有关。一般,抗病力弱的品种,生长期中露日多、露期长、露温高、田间闷热潮湿以及地势低洼、施肥局限性等状况下,发病较重。近年来随着种植面积的逐年扩大和感病品种的扩种，发病有加重趋势,已成为甜玉米的严重病害之一。目前生产上用于防治玉米小斑病的化学试剂重要是常用的杀菌剂,玉米小斑病重要用40%克瘟散,5%多菌灵，75%代森锰锌等药剂500-8倍进行页面喷雾防治12。但效果不是很抱负,由于枯草芽孢杆菌对玉米小斑病菌的生长具有克制作用，因此探讨玉米小斑病的生物防治具有重要意义。. 材料与措施2.1 实验材料与器材.1.1 实验材料蔗糖，马铃薯,麦芽糖,酵母膏，琼脂，燕麦片,胰蛋白胨,牛肉膏,硫酸铵,K2O4，5孔雀绿溶液，0.0%碱性复红溶液，香柏油,擦镜液，无菌水2.1.2 实验菌种枯草芽孢杆菌A16（Bcius btilis 16) 玉米小斑病菌(Bipolris maydi）21.3 实验仪器显微镜,酒精灯，载玻片，盖玻片，吸水纸，胶头滴管，试管,试管夹,培养皿,三角瓶,烧杯，控温摇床，移液枪，高压蒸汽灭菌锅，电子天平,PH测试仪,接种环,直尺，无菌操作台22 实验措施2.21 发酵种子培养2.21.1 配制LB培养基用烧杯称取32g马铃薯，32Cl,16g酵母膏放至锅中,烧杯用水冲洗,加入部分水,使药物溶解用30% NaOH调pH,至，补齐3200ml水分装至6个三角瓶中,每个50m12灭菌23min。得500m LB培养基,待用(如下实验部分需用不同容量及数量的B培养基,按照比例重新配备即可）21. 活化菌种将装有acillus sbtilis A16的种子瓶拿入无菌操作室,同步将200l的LB培养基拿进超净工作台,紫外灭菌20mn.按1:1比例,每瓶培养基中加入20种子将接种完的LB培养基放入摇床内6,200rmn培养过夜将种子瓶放回冰箱保存22.1. 菌种扩大培养将上步得到的00ml接种枯草芽孢杆菌的B培养基，18500m LB培养基拿入无菌操作台,开紫外灯对超净工作台灭菌20in左右把上步实验中接种到200ml培养瓶中的菌种按照3%的接种量接种到00ml的B培养基中，共有18个大瓶36,00r/min摇床培养,预得上罐前种子2.22 发酵生产监测（对0004,05,06罐进行实验室发酵罐模拟实验）222.1 取样从004,005,0三罐中分别取样2.2. 压片复染制作菌种常规涂片:取干净载玻片，滴一滴取样液于玻片中央,室温自然干燥,涂面朝上,通过火焰2-3次进行热固定于图片上滴-5滴孔雀绿溶液；用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上浮现蒸汽时开始计时约4-5mn;倾去染液,待玻片冷却后,用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止;用005%的碱性复红溶液进行复染min，水洗;2.2 观测成果将制作好的压片置片干燥后用油镜观测2.3 Bacllus ubtli A16与Bipolrs mydis的拮抗实验22.1 多种培养基的配制酵母浸膏培养液：蔗糖,酵母浸膏1g,K2H 4g，无菌水1000酵母浸膏培养基：酵母浸膏培养液+琼脂0g燕麦培养基：燕麦片30g，琼脂1g,无菌水10m2.22 玉米小斑病菌（Bipolaismays）的培养将玉米叶表面分离的玉米小斑病菌移植于燕麦片培养基上,25-3培养7d左右，待菌落表面达培养皿面积23时，2光照培养2.2. 拮抗细菌（Bacills btili A6)的培养将A,B,C三罐的枯草芽孢杆菌分别接种于盛有1ml酵母浸膏培养液的三角瓶中，3,20r/min震荡培养4822.3.4 拮抗实验以玉米小斑病菌为靶标菌，采用平板对峙法测定枯草芽孢杆菌对玉米小斑病菌的拮抗作用。将2m大小的玉米小斑病菌菌丝块接在燕麦培养基中央,25培养3d，在离接种处25mm处的左右两边等距划线接种枯草芽孢杆菌,对照组只接种病原菌玉米小斑病菌，25培养5d，每组解决次反复3 实验成果3.1 发酵生产监测（004，05,00实验室种子罐）00罐发酵实验进行得比00,006罐相对早某些,比005和00提迈进入发酵阶段，0005和0006罐进行同步发酵实验,如下表格记录三天内三个罐的发酵状况表3 0004,0005，00罐的发酵状况记录Table 3Fermetationcndions record f ferentor00,0,0发酵罐编号发酵状况记录第一天上午0004视野内大量菌体，少量芽孢，应处在对数生长期末期0005视野内菌体量多,无污染,正处在对数生长期0006视野内菌体量多，无污染，正处在对数生长期第一天下午0004视野内芽孢占大概5，处在发酵生产末期005视野内大量菌体,少量芽孢，处在对数生长期末期006视野内大量菌体,少量芽孢，处在对数生长期末期第二天上午0004视野内大量芽孢,几乎发酵结束005视野内大量杆菌,发酵正常，与正常发酵周期相符006视野内大量杆菌,发酵正常第二天下午00视野内大量杆菌，少量芽孢，发酵正常006视野内大量杆菌,发酵正常第三天上午05视野内大量菌体，少量芽孢,发酵正常0006视野内菌体与芽孢数量都较少，有较多杂质第三天下午005视野内大量菌体，芽孢较上午多某些，发酵正常0006视野内大量杂质，应当已污染32拮抗实验成果3.2.1 菌丝直径表 菌丝直径abe 4 iater mycliu组号直径天数123实验组直径/mm对照组直径mm实验组直径m对照组直径mm实验组直径m对照组直径m4515344124217334511750040836352163442421834444852 为了更清晰地显示枯草芽孢杆菌对玉米小斑病菌生长的始终状况,将第一组的量组数据绘制成折线图显示如下图菌丝直径与时间的关系Fig.1 therlatinship o myceli diameterd i3.2.2拮抗实验观测在拮抗实验的过程中，无论是对照组还是实验组，前两天菌丝的生长都较快,从第三天开始，接种了枯草芽孢杆菌的培养皿中病原菌的菌丝生长几乎停滞，而对照组的病原菌菌丝仍处在继续生长状态。在培养基上培养了3d之后，接种了枯草芽孢杆菌的培养基上已经明显浮现了抑菌带，在菌丝直径与时间关系图表中也可以明显地看出没有接种枯草芽孢杆菌的对照组菌丝生长状况比实验组要好某些。实验观测成果显示，在接种了枯草芽孢杆菌的培养基上，玉米小斑病菌的菌丝较对照组所占的培养皿面积少诸多,菌体生长受到克制。 讨论4.1 实验室发酵生产监测工业生产之前一般都要进行实验室小规模的发酵罐实验，在该实验发酵生产监测过程中,实验室小罐发酵周期与工业生产发酵周期基本相符。在最初阶段,菌体处在对数生长阶段,由于对数生长期的种子是发酵生产中的最适种龄,此时菌体尚未达到最高峰。待菌体进入稳定期之后，发酵进入产物合成阶段，菌体稳定期的生长规律对生产实践有着重要的指引意义,例如，对生产菌株或与菌体生长相平行的代谢产物(SCP、乳酸等)为目的的某些发酵来说，稳定期是产物的最佳收获期13。在该发酵模拟实验中,当取样观测发现视野内有大量芽孢存在时,既阐明发酵已经处在发酵末期。在发酵前期过程中观测006罐始终发酵正常,但从第三天观测发现发酵罐里具有大量杂质而菌体量和芽孢量很少,也许因素就是发酵过程中被污染,应属于发酵中期污染,在该种状况下会严重影响产生菌的代谢，杂菌大量产酸致使培养液H下降,糖、氮消耗快，发酵液发粘，菌丝自溶,产物分泌减少或停止，有时甚至会会使已产生的产物分解。在染杂菌的状况下,如果状况较轻,可以减少培养,减少补料,如果发酵单位达到一定遂平可以提前放罐,对于0005罐,整个实验发酵过程中状况良好,基本与工业化生产发酵的周期相似，菌体生长状况正常，发酵条件控制恰当，无污染状况发生；004大罐较0005和0006大罐早进行发酵实验一天左右,因此观测到的状况与005和0006大罐不一致，但是总体的趋势是同样的,没有污染发生,并且整个发酵过程几乎与工业生产的正常发酵周期相符,因此004和006大罐发酵实验较为抱负。4.2 枯草芽孢杆菌拮抗实验分析在枯草芽孢杆菌克制玉米小斑病菌生长的实验成果表白，枯草芽孢杆菌A16对玉米小斑病菌的生长的确起到了一定的克制作用。在拮抗实验中，接种枯草芽孢杆菌的培养基中玉米小斑的有明显的抑菌带,阐明枯草芽孢杆菌的拮抗性强且稳定，对玉米小斑病菌有较好的拮抗作用,在第一天和第二天，实验组和对照组的病原菌菌丝生长状态几乎同步，由于所接种的枯草芽孢杆菌距离病原菌距离较远,还不能对病原菌的生长起到一定的克制作用，从第三天开始对照组与实验组的菌丝生长状况开始浮现变化，实验组的枯草芽孢杆菌已经明显发挥抑菌作用而使得病原菌菌丝的生长几乎停滞,而对照组的菌丝仍然处在生长状态,可见枯草芽孢杆菌是一种较为抱负的拮抗细菌,在植物病害特别是农作物的生物防治方面体现出一定的生防潜力。该实验只是粗略地测定了枯草芽孢杆菌对玉米小斑病菌生长的克制作用,对于枯草芽孢杆菌作用的最适条件还应有进一步的规定,例如培养基成分、培养温度、溶氧量、p等。对于此拮抗关系，需要进行更进一步的研究来拟定枯草芽孢杆菌作用的最适条件，为后来更好地防治玉米小斑病奠定基本。5 存在问题及展望5.1 枯草芽孢杆菌生物肥料研发的展望及应用对策在对枯草芽孢杆菌已有的研究基本上，再进行进一步的研发，如对植物内外微生物区系及微生态平衡的影响；对土壤性质改良的长效机理；也可以研发在畜禽鱼免疫方面的研发，扩大其应用范畴。同步，枯草芽孢菌剂在不同条件下使用时,对菌体自身也许产生的影响，密切注意它们的变化趋势和也许发生的不良变异和影响,并提出合理有效的避免措施4。通过这些作用机理的研究,可以有效指引枯草芽孢杆菌制剂的产品生产工艺和应用技术措施，是其的应用和研究水平有更大的发展和提高。为理解决大多数菌剂还在实验室开发阶段而不能大范畴施用的问题, 目前重要采用与化学农药复配防和与其她拮抗微生物协同防病这两种措施。这样在某种限度上实现了枯草芽孢杆菌菌剂的使用，也使得其使用效果在其她微生物的协同作用下得到提高。在产品原则化的问题上,国家应逐渐建立、完善行业生产及检测原则,制定有关法律及实行细则,使生产原则化。同步建立与完善市场检查和监督机制,一旦发现不合格产品,立即根据法律予以相应的惩罚。52生物菌肥研发使用中存在的问题国内的微生物肥料行业还处在起步阶段，诸多的肥料生产公司还徘徊在幼稚发展阶段,没有完善的管理制度，生产技术尚有待发展，没有明显的效益。目前，国家对农业生产资料有相应的免税政策,其中涉及饲料、农膜、部分化学农药与部分化学肥料,对销售种子、种苗、农机、化肥、农药的销售商也有相应的免税政策，但这些都不涉及微生物肥料行业与产品。与化肥行业、农药行业相比，微生物肥料行业还处在稚嫩的发展阶段，但是,它又与国内农业可持续发展战略息息有关,在有机食品生产方面有着不可替代的地位，是国内肥料行业发展的方向之一。 目前市场上发售的生物菌肥大部分对土壤的温度、湿度、pH等规定比较严格，使得施用后菌种也许不能发挥最大的作用。在施用过程中，受到某些因素的影响，例如与杀菌剂、杀虫剂等混合使用会导致菌肥中生物菌的死亡；高温、低温、干燥等较恶劣的条件不可施用。 生物菌肥的研发面临的一种问题是生物菌的生物活性如何在产期保存的状况下保存完好,有些菌肥只能进行短期保存,这样对工业生产来说会导致较大承当。此外新菌种有待开发来生产更多功能的菌肥，能用于工业生产的微生物只占所有微生物很小的一部分,因此对新型工业菌的开发研究是目前一项有待解决的任务。5.3 生物菌肥的推广使用及展望5.1 生物菌肥的推广使用从目前的农业生产形势和肥料使用状况来看,农药化肥将逐渐被生物肥料、生物农药所取代，化学制剂防治害虫是一种治标不治本的方案，虽然在短期内也许达到消灭害虫，提供作物营养的目的,但是但是时间久了害虫杂草逐渐产生了抗性，土壤中残留大量的化肥农药，都将严重影响人类及牲口的健康以及环境的协调稳定。从农业生产特点的角度来讲，推广生物菌肥具有一定的重要性。由于过去农田耕作大量使用化学肥料，土壤中的氮过量,难溶解的磷、钾又不能被植物吸取，使得土壤越来越板结,农作物的耕种也就越困难，从而导致了农作物的质量与产量的下降。生物菌肥中的有效微生物可以同通过其新陈代谢的产物来降解难溶物质，活化土壤,增进植物对磷、钾等元素的吸取，从而提高农作物的品质及产量。 从示范和施用效果的角度来看，推广和应用生物菌肥具有一定的可行性。大量的调查显示，使用生物菌肥的农田作物产量均比未使用前不同限度的提高。在生物菌肥的推广使用过程中，强有力的调查成果会提供更好地说服力。 从生物菌肥使用的范畴来看，其推广应用品有一定的广泛性。不同的生物菌肥可以适应不同的种植环境,从而改善不同质量的土壤，也就是说，生物菌肥的多样化使得生物菌肥在多种地质上都能发挥充足的效果。 各级农业技术推广部门要加强生物菌肥的推广，从生物菌肥产品的特性、作用功能、使用措施等方面，进行多角度、全方位的推广5。从而响应“发展绿色农业,发展生态农业”的号召。5.3. 生物菌肥的发展前景 生物菌肥的作用已逐渐被人们承认。现已有多种国家进行生物菌肥的生产机推广使用。尽管目前生物菌肥的生产量以及应用量远比不上老式的化学肥料,但是由于其明显的作用，已初步形成了小规模的生产并获得了一定的经济效益。通过长期的研究开发，生物菌肥已形成了如下几种趋势：() 由单一菌种向复合菌种转化；（2) 由单一功能向多功能转化;() 由豆科作物接种剂向非豆科作物肥料转化;（4)由单一接种剂向复合生物肥转化;（5)由用无芽胞菌种生产向用有芽胞菌种生产转化16。现已有部分国家对生物菌肥的监测衡量制定了一种明确的原则，以便对生物菌肥规格有一种明确的规定,避免了市场销售及应用的混乱。为了增进国内微生物肥料行业的发展,建议国家在有关法律上予以生物菌肥一定的优惠政策,例如免收增值税。同步，国家应当加强菌种资源的管理,加大执法力度，完善检测体系，规范市场,保证微生物肥料的产品质量。此外,国家应当加大对微生物肥料基本研究的投入,收集更多珍贵的资源，对微生物肥料的作用机理进行更加进一步彻底的研究，使国内的微生物肥料行业可以更好的发展17。目前，国内也制定了农业部原则和成立微生物质量检测中心,并已于196年正式对微生物肥料制品进行产品登记、检测及发放生产许可证等工作。 随着环境问题在全球范畴内越来越受到注重以及农业可持续发展方略的应用，生物菌肥的开发、生产及应用力度在不断扩大。随着科学技术的不断发展,生物菌肥的研制一定会获得突破性进展,逐渐形成大规模的应用，从而对土壤修复，农作物增产等发挥其应有的作用。生物菌肥作为一种无毒无害的产品将越来越受到人们的青睐，生物菌肥的推广势将成为肥料发展的必然趋势。参照文献 葛诚，吴薇.国内微生物肥料的生产、应用及问题中国农学通报，994,(）;4-8 沈卫锋，牛宝龙,翁宏飚等.枯草芽孢杆菌作为外源基因体现系统的研究进展J浙江农业学报，,，1（4):234-383 Mnica EzethADJ, Willi EB.et al. Viaily adailit of bioloca orol agentsonott nd snap ean ees. Ps. Mnag Sci. ,5(8):69576 于同立浅谈细菌生物肥料J.山东轻工业学院学报,18（2）：35.5 李维炯.微生态制剂的应用研究M化学工业出版社，.60-161 陈中义.多功能质粒载体与组合B1杀虫蛋白基因工程菌研究D.北京;中国农业科学院，7 HallmanJ A， Quadt Hlln A，Mahaffe W F, et. Bacteralentphytesi agriculturaro J. Cn J Mcrobial，1997,3:95-94810王星云,宋卡魏，张荣意.枯草芽孢杆菌紧急的开发应用J广西热带农业，7（4):0-4 PjolM,Badsa ,Maeu , t Assesmetof hEnvronenalae of te BologiclCotro get o Fie Bgt , Pseumna florescens ES , App yltr ad Real-TimePCR Mthods pplidAndEnviromeal Mcrobology ,7(4 )： 421 逄奉辉，曹贤香.微生物在农业生产上的应用M. 中国商业出版社,.7-731 吉林玉米网，玉米苗期管理技术OL。WWWhtt;/linai. 13 周德庆.微生物学教程M北京:高等教育出版社,56-1714 张彦杰,罗俊彩等生防枯草芽孢杆菌的研究进展N生命科学仪器，4月份第7卷1 石晶莹，陈维信,刘媛媛.植物内生菌及其防治植物病害的研究进展J.生态学报，,(7)：23-201 沈德龙,曹凤明，李力.国内生物有机肥的发呈现状及展望J. 中国土壤与肥料， ,(6):1517 姜成林，徐丽华微生物资源开发运用北京；中国轻工业出版社, 5-8道谢我的实习是在山东中北生物科技有限公司进行的。感谢公司可以给我这次锻炼的机会，让我迈出了从学校走向社会的第一步。 在实习期间，实验室的师兄师姐在生活和学习上给了我极大的关怀和协助，在平常的实验操作中细心地指引我完毕每一项实验内容；在论文课题研究过程中,马传营教师，汤艳超师兄为我提供了大力的支持、懂得和协助。在我论文的写作过程中,马传营教师为我论文方向的制定及论文思路的改善提供了很大协助,并不断地帮我修改论文中存在的问题。再次，向所有协助过我的教师、师兄师姐及同窗表达最衷心的感谢和最诚挚的敬意。谨向所有关怀和协助过我的教师、师兄师姐和同窗以深深的道谢。 陈聪 六月