固定化酶和固定化细胞

第四章 固定化酶和固定化细胞 （ 2学时） 主要内容： 1 固定化酶的定义与优点 2 酶固定化技术发展史 3 固定化酶的制备方法 4 固定化酶的特性 5 固定化活细胞 6 酶催化反应器及其类型 游离酶的使用 蒸汽 酶解罐简易图 加热灭酶 酶无法回收 稳定性差 1 固定化酶的定义与优点 所谓固定化酶 (immobilized enzyme)， 是 指在一定的空间范围内起催化作用 ， 并能 反复 和连 续 使用的酶 。 固定化酶的优点： （ 1） 同一批固定化酶能在工艺流程中 重复多次地使用 ； （ 2） 固定化后 ， 和反应物分开 ， 有利于控制生产过程 ， 同时也 省去了热处理使酶失活的步骤 ； （ 3） 稳定性显著提高 ； （ 4） 可长期使用 ， 并可预测衰变的速度； （ 5） 提供了 研究酶动力学的良好模型 。 2 酶固定化技术发展史 起始研究 1916年 系统研究 1950年 - 工业化应用 1969年 - 1916年 ， Nelson和 Griffin将蔗糖酶吸附在骨炭粉上 ， 吸附以后酶不溶于水且具有和液体酶同样的活性 ， 实 现了酶的固定化 ， 可惜长期未得到重视 。 1953年 Grubhofer和 Schleith将聚氨基苯乙烯树脂重 氮化 ， 然后将淀粉酶等与这种载体结合 ， 制成了固定 化酶 。 60年代后期 ， 酶固定化技术迅速发展 ， 出现了 很多新的酶固定化方法 。 1969年，千畑一郎等将固定化氨基酰化酶应用于 DL-氨基酸的光学拆分上，来生产 L-氨基酸， 开创了 固定化酶应用于工业生产的先例 。 1973年，将固定 化微生物细胞首次应用于工业生产。 目前 ， 固定化技术已经取得了许多重要成果 ， 充分发挥了 固定化酶和固定化细胞在改革工艺和降低成本方面的巨大 潜力 。 但从目前的发展状况来看 ， 尽管酶种类繁多 ， 但已经固定 化的酶却相对有限 ， 采用固定化酶技术大规模生产的企业 尚属少数 ， 真正在工业上使用的固定化酶还仅限于 葡萄糖 异构酶 、 葡萄糖氧化酶和青霉素酰化酶 等为数不多的 十几 个酶种 ， 故仍需大力研究开发使更多的固定化酶和细胞能 适用于工业规模生产 。 应用现状： 3 固定化酶的制备方法 酶的固定化方法主要可分 为四类：吸附法 、 包埋法 、 共价键结合法和交联法 。 对于特定的目标酶 ， 要根 据酶自身的性质 、 应用目 的 、 应用环境来选择固定 化载体和方法 。 在具体选择时，一般应遵循以下 6个原则。 （ 1） 酶与载体的结合部位不应当是酶的活性部位 ， 固 定化时应采取尽可能温和的条件 。 （ 2） 酶与载体必须有一定的结合程度 ， 利于反复使用 。 （ 3） 用于固定化的载体必须 有一定的机械强度 ， 不易 破坏或受损 。 （ 4） 固定化应尽可能不妨碍酶与底物的接近 ， 以提高 催化效率和产物的量 。 （ 5） 所选载体应不和底物 、 产物或反应液发生化学反 应 。 （ 6） 固定化酶的成本适中 ， 以利于工业使用 。 3.1吸附法 吸附法是通过载体表面和酶分子表面间的次级键 相互作用而达到固定目的的方法 ， 是固定化中最 简单的方法 。 酶与载体之间的亲和力是范德华力 、 疏水相互作 用 、 离子键和氢键等 。 吸附法又可分为物理吸附法和离子吸附法 。 物理吸附法是通过 物理方法 将酶直接吸附在水不溶性载体 表面上而使酶固定化的方法 。 是制备固定化酶最早采用的 方法 。 常用的载体：纤维素 、 胶原 、 淀粉及面筋 、 活性炭 、 氧化 铝 、 皂土 、 多孔玻璃 、 硅胶 、 二氧化钛 、 羟基磷灰石等 。 优点：操作简单 、 价廉 、 条件温和 ， 载体可反复使用 ， 酶 与载体结合后 ， 活性部位及空间构象变化不大 ， 固定化酶 活力较高 。 缺点：酶和载体结合不牢固 ， 在使用过程中容易脱落 ， 常 与交联法结合使用 。 （ 1）物理吸附法 离子吸附法 (ion adsorption)是 将酶与含有离子 交换基团的水不溶性载体以静电作用力相结合的 固定化方法 ， 即通过离子键使酶与载体相结合的 固定化方法 。 DEAE-纤维素吸附的 -淀粉酶 、 蔗糖酶已作为商 品固定化酶 。 具有操作简便 、 条件温和 、 酶活力不易丧失等优 点 。 此外 ， 吸附过程同时可以纯化酶 。 （ 2）离子吸附法 3.2包埋法 包埋法是将 酶包埋在高聚物的细微凝胶网格中或 高分子半透膜内的固定化方法 。 前者又称为凝胶 包埋法 ， 酶被包埋成网格型；后者又称为微胶囊 包埋法 ， 酶被包埋成微胶囊型 。 （ 1）凝胶包埋法 凝胶包埋法常用的载体 有 海藻酸钠 凝胶 、 角叉 菜胶 、 明胶 、 琼脂凝胶 、 卡拉胶等天然凝胶以及 聚丙烯酰胺 、 聚乙烯醇 和光交联树脂等合成凝 胶或树脂 。 1-2%海藻酸钠 +酶液 E E E E 5%CaCl2溶液 （ 2）微胶囊包埋法 微胶囊包埋即将酶包埋在各种高聚物制成的半 透膜微胶囊内的方法 。 它使酶存在于类似细胞内的环境中 ， 可以防止 酶的脱落 ， 防止微囊外的环境直接接触 ， 从而 增加了酶的稳定性 。 常用于制造微胶囊的材料有聚酰胺 、 火棉胶 、 醋酸纤维素等 。 适合于 小分子 为底物和产物的酶的固定化 。 如 脲酶 、 天冬酰胺酶 、 尿酸酶 、 过氧化氢酶等 。 3.3共价键结合法 共价键结合法 (covalent binding） 是 将酶与 聚合物载体以共价键结合的固定化方法 。 酶蛋 白上可供载体结合的功能基团有以下几种： （ 1） 酶蛋白 N末端的 -氨基或赖氨酸残基的 -氨基 。 （ 2） 酶蛋白 C末端的 -羧基 、 天门冬氨酸残基的 -羧 基以及谷氨酸残基的 -羧基 。 （ 3） 半胱氨酸残基的 巯基 。 （ 4） 丝氨酸 、 苏氨酸和酪氨酸残基的羟基 。 （ 5） 组氨酸残基的咪唑基 。 （ 6） 色氨酸残基的吲哚 基 。 （ 7） 苯丙氨酸和酪氨酸残基的苯环 。 其中最普遍的共价键结合基团是 氨基 、 羧基以及 苯环 。 常用来和酶共价偶联的载体的功能基团有 芳香氨基 、 羟基 、 羧基和羧甲基等 。 这种方法是 固定化酶研究中最活跃的一大类方法 ， 但必须注意 ， 参加共价结合的氨基酸残基应当是 酶催化活性非必需基团 ， 如若共价结合包括了酶 活性中心有关的基团 ， 会导致酶的活力损失 。 用共价键结合法制备的固定化酶 ， 酶和载体之间都是通过 化学反应以共价键偶联 。 由于共价键的键能高 ， 酶和载体 之间的结合相当牢固 ， 即使用高浓度底物溶液或盐溶液 ， 也不会使酶分子从载体上脱落下来 ， 具有酶 稳定性好 、 可 连续使用较长时间的优点 。 但是采用该方法时 ， 载体活化的难度较大 ， 操作复杂 ， 反 应条件较剧烈 ， 制备过程中酶直接参与化学反应 ， 易引起 酶蛋白空间构象变化 ， 酶活回收率一般为 30%左右 ， 甚 至酶的底物的专一性等性质也会发生变化 ， 往往需要严格 控制操作条件才能获得活力较高的固定化酶 。 3.4交联法 交联法 （ cross-linking） 是 使用双功能或多功能试剂使酶 分子之间相互交联呈网状结构的固定化方法 。 由于酶蛋白的功能团 ， 如氨基 、 酚基 、 巯基等参与反应 ， 所 以酶的活性中心构造可能受到影响 ， 使酶明显失活 。 常用的双功能试剂有戊二醛 、 己二胺 、 异氰酸衍生物 、 双偶 氮联苯和 N,N-乙烯双顺丁烯二酰亚胺等 ， 其中使用最广泛 的是戊二醛 。 戊二醛和酶蛋白中的游离氨基发生 Schiff反应 ， 形成薛夫碱 ， 从而使酶分子之间相互交联形成固定化酶 。 以上四种固定化酶方法各有其优缺点 （ 见表 4-1） 。 往往一种酶可以用 不同方法固定化 ， 但没有一种固定化方法可以普遍地适用于每一种酶 。 在实际应用时 ， 常将两种或数种固定化方法并用 ， 以取长补短 。 4 固定化酶的特性 4.1固定化酶的形状 固定化酶的形式多样 ， 依不同用途有颗粒 、 线 条 、 薄膜和酶管等形状 。 其中 颗粒占绝大多数 ， 它和线条主要用于工业 发酵生产 ， 如装成酶柱用于连续生产 ， 或在反 应器中进行批式搅拌反应； 薄膜主要用于酶电极 ， 应用于分析化学； 酶管机械强度较大 ， 亦宜用于工业生产 。 4.2酶活力 固定化酶的活力在多数情况下比天然酶的活力 低 ， 其原因可能是： 酶活性中心的重要氨基酸残基与水不溶性载体相 结合； 当酶与载体结合时 ， 它的高级结构发生了变化； 酶与底物间的相互作用受到空间位阻的影响 。 也有在个别情况下 ， 酶经固定化后其活力升高 ， 可能 是由于固定化后酶的抗抑能力提高使得它反而比游离 酶活力高 。 4.3固定化酶的稳定性 1） 操作稳定性 一般情况下，半衰期在一个月以上，即有工业应用价值。 3）热稳定性 大多数酶在固定化后，热稳定性提高，但有些酶采用吸附法固定化时会降低。 2） 贮藏稳定性 可延长酶的贮藏有效期。如果贮藏条件 比较好，亦可较长时间保持活力。 4）对蛋白酶的 稳定性 由于酶固定化后受到空间位阻的影响， 蛋白酶不能有效接触，因此抵抗力提高。 5）酸碱 稳定性 多数固定化酶的酸碱稳定性提高。极少 数酶固定化后由于酶活性构象的敏感区受 到牵连导致稳定性下降。 4.4固定化酶的反应特性 固定化酶的反应特性 ， 例如 ， 底物特异性 、 酶反应的 最适 pH、 酶反应的最适温度 、 动力学常数 、 最大反应 速度等均与游离酶有所不同 。 （ 1）底物特异性 固定化酶的底物特异性与底物分子量的大小有一定关系。 一般来说， 当酶的底物为小分子化合物时，固定化酶的 底物特异性大多数情况下不发生变化。 而当酶的底物为大分子化合物时 ， 如蛋白酶 、 -淀粉酶 、 磷酸二酯酶等 ， 一般随着底物分子量的增大 ， 固定化酶 的活力下降 。 这是由于载体引起的 空间位阻作用 ， 使大分子底物难以 与酶分子接近而无法进行催化反应 ， 酶的催化活力难以 发挥出来 ， 催化活性大大下降 。 例如 ， 糖化酶用 CMC叠氮衍生物固定化时 ， 对分子量 8000的直链淀粉的活性为游离酶的 77 ， 而对分子量 为 50万的直链淀粉的活性只有 15% 17 。 （ 2）反应的最适 pH 酶被固定后 ， 其最适 pH和 pH曲线常会发生偏 移 。 一般来说 ， 产物为酸性时 ， 固定化酶的最适 pH与游离酶相比升高；产物为碱性时 ， 固定 化酶的最适 pH与游离酶相比降低 。 （ 3）反应的最适温度 固定化酶的最适反应温度多数较游离酶高 。 如色氨酸酶经共价结合后最适温度比固定前提 高 5 15 ， 但也有不变甚至降低的 。 固定化 酶的作用最适温度会受固定化方法以及固定化 载体的影响 。 （ 4）米氏常数 酶经固定化后 ， 酶蛋白分子的高级结构的变化 以及载体电荷的影响可导致底物和酶的亲合力 的变化 。 使用载体结合法制成的固定化酶 Km有时变动 的原因 ， 主要是由于载体与底物间的静电相互 作用的缘故 。 （ 5）最大反应速度 固定化酶的最大反应速度与游离酶大多数是相同 的 。 有些酶的最大反应速度会因固定化方法的 不同而有所差异 。 5 固定化活细胞 20世纪 70年代 ， 在固定化酶的基础上科学家们研制成固 定化细胞 （ Immobilized Cell） ， 并且用于生产 。 直接固定那些含有所需胞内酶的细胞 ， 并且利用这样的细 胞来催化化学反应 。 70年代末 ， 法国研究成功固定化细胞生产啤酒 ， 80年代 初我国居乃琥等用固定化细胞批量生产啤酒和酒精取得重 要研究成果 。 固定化细胞按其生理状态又可分为固定化死细胞和活细胞 两大类 。 固定化细胞的优点和缺点： 固 定 化 活 细 胞 优点 缺点 必须保持菌体的完整 ， 防止菌体的自溶 ， 否则 影响产物的纯度； 必须抑制细胞内蛋白 酶对目的酶的分解； 胞内多酶的存在 ， 会 形成副产物； 载体 、 细胞膜或细胞 壁会造成底物渗透与扩 散的障碍等 。 无需进行酶的分离和 纯化 ， 减少酶活损失 ， 降 低成本； 可进行多酶反应 ， 且不 需添加辅助因子； 活细胞保持了酶的原始 状态 ， 稳定性更高 ， 对污 染的抵抗力更强； 细胞生长停滞时间短 ， 细胞多 ， 反应快等等 。 物理吸附法 包埋法 6 酶催化反应器及其类型 以酶为催化剂进行反应所需要的设备称 之为酶催化反应器，简称 酶反应器 。 6.1酶反应器的类型 酶反应器有两种类型： 一类是直接用游离酶进行反应 ， 即均相酶反应器； 另一类是应用固定化酶进行的非均相酶反应器 。 均相酶反应能在批量式搅拌桶反应器或超滤膜反应器中进 行 ， 而非均相酶反应则可在多种反应器中进行 ， 适用于连 续催化反应 ， 包括： 连续流搅拌桶反应器 、 填充床反应器 、 流化床反应器 、 连续搅拌桶 -超滤和循环式反应器等 。 6.2反应器的结构特点 这类反应器结构简单 ， 造价较低 ， 传 质阻力很小 ， 反应能迅速达到稳态 ， 主要应用在 饮料等食品工业中 。 其缺点是操作麻烦 ， 在反复回收过程 中固定化酶容易损失 ， 所以工业规模 的固定化酶很少采用 。 但是 ， 常用于 游离酶 。 图 4-2 批量式搅拌桶反应器 6.2.1 批量式搅拌桶反应器 这种反应器在运转过程中 ， 底 物以恒定的流速流入反应器 ， 与此同时 ， 反应液则以同样的 流速流出反应器 。 反应桶内装 有搅拌器 ， 使反应组分与 固定 化酶颗粒 混合均一 ， 出口处有 过滤膜 ， 可使不断补充新鲜底 物与反应液流量维持动态平衡 ， 如图 4-3。 6.2.2 连续流搅拌桶反应器 图 4-3 连续流搅拌桶反应器 6.2.3 填充床反应器 图 4-4填充床反应器 PBR具有高效率、 易操作、结构简单 等优点。 它适用于各种形状 的固定化酶和不含 固体颗粒、黏度不 大的底物溶液，以 及有产物抑制的转 化反应。 其缺点是传质系数 和传热系数相对较低。 当底物溶液含固体 颗粒或黏度很大时， 不宜采用 目前工业生产及研究中应用最为普遍的反应器。 6.2.4 流化床反应器 图 4-5 流化床反应器 主要被用来处理一些 粘度高 的液体和颗粒细小 的底物，如 用于水解牛乳中的蛋白质。同 时，亦可用于需要供气体或排 放气体的酶反应（即固、液、 气三相反应）。 但因 FBR混合均匀，故不适 用于有产物抑制的酶反应。 6.2.5 连续搅拌桶 -超滤反应器 (CSTR UF) 图 4-6 连续搅拌桶 -超滤反应器 适用于颗粒较细 的固定化酶、游离 酶和细胞以及小分 子产物与大分子底 物。 如： 纤维素的连续糖 化、 -淀粉酶水解淀 粉 6.2.6 循环反应器（ Recycle Reactor， RCR） 外循环反应器 内循环反应器 循环操作仍能为底物与酶提供足够的接触 机会，以达到所需的转化率。这种反应器可 用于 难溶或者不溶性底物 的转化反应。 6.3膜式反应器 膜式反应器是 20世纪 70年代以来发展起来的一种新型反 应器 ， 它是利用膜的分离功能 ， 同时完成反应和分离过程 的一种反应器 。 6.3.1膜式反应器的类型： 根据酶的存在状态 、 相数 、 膜组件型式 、 膜材料类型 、 耦 合方式 、 传质推动力等的不同 ， 酶膜反应器有不同的分类 方式 。 根据膜组件的型式不同 ， 可把酶膜反应器分为板框 式 、 螺旋卷式 、 管式和中空纤维式酶膜反应器 。 以下以螺 旋卷膜式反应器和中空纤维膜式反应器为例来说明 。 （ 1）螺旋卷膜式反应器 此反应器的螺旋结构是将 含酶的膜片与支持材料交替 地缠绕在中心棒上 。 所用的 膜片一般是胶原蛋白；而支 持材料则是一种称为凡克塞 的惰性聚合网状物 。 把上述螺旋元件装进圆筒 ， 筒两端加盖板 ， 并安装进出 口管 ， 这样 ， 就制成了螺旋 卷膜式反应器 。 螺旋模型可将流体流动的单 元分隔成许多独立空间 ， 改 善接触效果 ， 消除短路； 另外 ， 网状支持材料可以提 高每一流动间隔的混合效果 ， 加快物质传递 。 （ 2）中空纤维膜式反应器 外层： 中空纤维膜 水 和 小 分 子 产 物 多孔海绵状的支 持层（固定酶） 半透性膜 大分子底物 用这种固定化酶填充的 反应器 可以提供较大的 催化表面 ， 缺点：中空纤维的制造 极为困难，难以保证纤 维束内流体流动的均匀 性，以及存在较大的物 质传递阻力等。 6.3.2 膜式反应器的特点 （ 1） 膜的选择透过性使某些组分 (如产物 )连续脱除 ， 使 反应转化率不受 化学平衡转化率的限制 ， 提高了反应的转化率 。 （ 2） 酶膜反应器可将目的产物分离出去 ， 而酶可以重复利用 ， 可实现连 续操作 ， 并有可能提高复杂反应的选择性 。 （ 3） 膜作为酶的固定化载体可以使酶在类似生物膜的环境中高效发挥作 用 。 （ 4） 可实现对流传质代替自由扩散 ， 强化了传质速率 ， 提高了反应速率 。 （ 5） 可以简化工艺流程和操作步骤 ， 降低生产成本和增加产量的作用 。 （ 6） 膜作为相分离器和相接触器 ， 避免了乳化和破乳等问题 ， 也摆脱了 液泛的限制 。 但是膜反应器在使用过程中也存在着一些问题 ， 这些问题 严重制约了膜反应器的推广应用： 膜孔分布与形态结构的均一性差 ， 造成酶分子和小分子激活剂 (金 属离子或辅助因子等 )的泄漏损失 。 酶在膜表面的随机吸附引起酶空间构型的改变或活性位点的遮蔽 ， 降低或破坏酶的催化活性 。 酶分子在酶膜反应器中容易因湍流等原因而发生剪切失活 。 有些情形下 ， 由于产物分子在靠近膜面的位置逐渐积聚而形成凝 胶层 ， 造成酶膜反应器中严重的产物抑制 。 浓差极化和膜污染使酶膜反应器的传质速率和生产能力急剧下降 ， 膜孔堵塞 、 膜厚增加使膜的结构形态发生不利变化 ， 膜需要频繁 地清洗或更换 。 6.3.3 膜式反应器的应用 其在食品中的应用如： 透过果胶水解来降低果汁粘度； 通过将乳糖转化为可以消化的糖类来降低牛奶和乳 清中乳糖的含量； 通过多酚化合物和花色素的转化来进行白酒的处理； 从牛奶产品中去除过氧化物等 。 本章重点： 1、 固定化酶的优点及应用实例 。 2、 酶被固定化后的理化性质的变化 ， 对工业应用的利弊