人参三七提取物促血管生成的信号转导机制研究

1 人参三七提取物促血管生成的 信号转导机制研究 田伟 雷燕 朱凌群 陈可冀 中国中医科学院西苑医院 北京中医药大学东直门医院 2 研究背景 益气活血中药治疗冠心病取得较好疗效，促血管 生成可能是的重要机制之一 前期研究发现益气活血中药有促进血管生成、改 善心肌缺血，增强血管内皮细胞增殖与迁移的作 用，但其信号转导机制和作用靶标 ？ 3 研究背景 细胞信号通路是细胞应答内外环境信息，经信号网络整 合作用调节基因表达及细胞增殖、分化、发育的途径。 细胞的增殖、分化主要与有丝分裂原活化蛋白激酶 (MAPK)途径有关。 Ras是调节细胞生长的重要转导蛋白， 通过 Ras-Raf-MAPK最后产生级联反应 观察人参三七提取物对血管内皮细胞血管生成信号蛋白 的作用，以阐明益气活血药促血管生成信号转导途径 4 血管生成的过程 外因 活化邻近的血管内皮细胞 血管内皮细胞分泌蛋白酶降解基底膜及细胞外 基质 血管内皮细胞增生 血管内皮细胞改组形成小管，随后吻合成网状 并注入血流 5 研究思路 中药促进内皮细胞增殖 信号转导机制 中药作用靶点 血管生成信号通路 VEGF VEGFR-2 Ras MAPK 信号阻断 VEGFR-2 Ras 6 VEGF VEGFR Ras 血管生成信号通路： VEGF VEGFR-2 Ras MAPK 7 实验 1 人参和三七不同 配比、 浓度 、 时间 对 HUVEC增殖的影响 配比： 1： 1； 1： 2； 2： 1 浓度： 0.25mg/ml、 0.5mg/ml、 1mg/ml、 2mg/ml、 4mg/ml 时间： 24h， 48h 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 1 2 3 4 5 时间 （ 天 ） MTT A B C D E F HUVEC 不同浓度、不同时间点 生长曲线图 24h内皮细胞增殖直方图 人参三七提取物 配比 ： 2： 1 浓度 ： 4mg/ml 时间 ：培养 24h HUVEC增殖作用最强 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 人参：三七 (1:1) 人参：三七 (1:2) 人参：三七 (2:1) 空白对照组 0.25mg/mL 0.5mg/mL 1mg/mL 2mg/mL 4mg/mL MTT 9 实验 2 人参三七提取物促 VEC增殖 和分泌 VEGF 实验分为 5组 MTT 检测各组细胞增殖 ELISA 检测上清 VEGF含量 人参、三七能够促进 HUVEC增殖和分泌 VEGF 10 实验 3 人参三七提取物促 VEC上 VEGFR-2表达 免疫组化 SP法 0 5 10 15 20 25 30 组别 阳性细胞数 空白组 贝复济组 中药大剂量组 中药中剂量组 中药小剂量组 阳性细胞光密度 阳性细胞数 人参、三七能促进 VEGFR-2的表达，其作用和 bFGF相当 11 实验 4 人参三七提取物对血管生成 信号蛋白及其 mRNA的影响 检测血管生成信号通路上 VEGFR-2、 Ras、 MAPK 蛋 白及其 mRNA表达 探讨益气活血中药干预后，对血管生成信号蛋白 VEGFR-2、 Ras、 MAPK表达的影响 方法： western blotting ;RT-PCR 12 信号蛋白 VEGFR-2 、 Ras、 MAPK蛋白 及其 mRNA的表达 A B C D E A B C D E 21kD -actin VEGFR-2 -actin Ras A 空白组； B bFGF组； C 中药大剂量组； D 中药中剂量组； E 中药小剂量组 各组 VEGFR-2 蛋白的表达 各组 Ras 蛋白表达比较 43 kD 43 kD 215 kD -actin MAPK 43 kD 46 kD 各组 MAPK蛋白表达条带 A B C D E 13 表 1 各组蛋白免疫印迹杂交信号强度 灰度平均值比较 (n=3) , 组别 VEGFR-2/-actin Ras/-actin MAPK/-actin 空白对照 1.58 0.102 0.28 0.001 0.38 .0110 bFGF组 2.11 0.211 0.42 0.017 0.58 .0206 中药大剂量 2.07 0.189 0.53 0.237 0.45 .0299 中药中剂量 1.48 0.173 0.34 0.029 0.38 .0215 中药小剂量 1.39 0.261 0.49 0.028 0.48 .0142 注：与空白组比较， P 0.05； P0.01 14 血管生成信号蛋白 MARK及其 -mRNA的表达 15 结果和结论 与空白组相比，中药大剂量 组 VEGFR-2、 Ras 蛋白表达 明显增强，小剂量组 MAPK、 Ras蛋白表达明显上调。 bFGF组 VEGFR-2、 Ras、 MAPK的表达显著增强，差 异均有统计学意义 （ P0.05 P0.01） 人参、三七可促进血管生成信 号蛋白 VEGFR-2 Ras MAPK的表达 可能是益气活血药促内皮增殖， 产生血管生成效应的基础 以上三个信号蛋白的 mRNA表 达未见增加 16 实验 5 SU5416阻断 对 VEGFR-2下游 信号蛋白的影响及中药干预 目的：观察下游信号蛋白 Ras/MAPK表达，明确中药 作用靶点 方法：加入半数抑制量的 SU5416，对信号通路关键蛋白 VEGFR-2进行 IC50 阻断，中药干预 SU5416： VEGFR-2 酪氨酸激酶的抑制剂，能阻断来自 细胞外血管生长刺激信号和已激活信号的转化通路 SU5416阻断后， Ras表达 A：空白组 B： SU5416组 C： SU5416+中药大剂量组 D： SU5416+中药中剂量组 E： SU5416+中药小剂量组 SU5416阻断后， MAPK表达 A：空白组； B： SU5416组； C： SU5416+中药大剂量组； D： SU5416+中药中剂量组； E： SU5416+中药小剂量组 19 结论 人参、三七组方可以 显著 促进 Ras蛋白的表达 促进 MAPK蛋白的表达 可以确定中药直接作用于 Ras 暂不能肯定中药是否作用于 Ras下游信号蛋白 MAPK 20 实验 6 FPP对下游信号蛋白 MARK 的影响及中药干预 目的：观察下游信号蛋白 MAPK表达， 明确 中药靶点 方法： 加入半数抑制量的 FPP，对 Ras 进行 IC50 阻断， 中药干预 FPP：是法尼基转移酶（ FTase）的竞争性抑制剂， FPP 和 Ras蛋白均为 FTase的底物， FPP可以竞争性抑制法尼 基转移酶，从而抑制 Ras信号蛋白的传导 FPP阻断后， MAPK 表达 A：空白组； B： FPP组； C： FPP+中药大剂量组； D： FPP+中药中剂量组； E： FPP+中药小剂量组 图 8-1 各组 MAPK蛋白表达条带 22 结论 人参、三七组方可以 促进 MAPK 蛋白的表达 中药直接作用于 MAPK这一靶点 23 实验 7 三维细胞培养 HUVEC形成 血管样结构 目的：比较二维与三维培养 HUVEC成血管样结 构，在形态学上的差别 方法：利用 Transwell 构建三维培养体系 24 二维细胞培养 （ x10） 25 二维细胞培养 （ x10） 26 细胞培养第 3天 （ x10） 27 细胞培养第 4天 （ x10） 28 细胞培养第 5天（ x10） 29 LSCM逐层扫描 30 LSCM合成立体图形 31 LSCM DNA三维成像后的俯视图 32 小结 探讨了血管生成信号通路上关键蛋白的表达，初步阐明 血管生成的信号转导机制 运用血管生成信号蛋白阻断剂进行逐级阻断，观察中药 对血管生成信号蛋白的干预作用，部分阐明了益气活血 中药促血管生成作用靶标 利用 Transwell成功构建三维细胞培养模型 33