三种常见花茶有效成分的提取及抑菌作用的研究生物学专业

摘要目的：研究三种常见花茶有效成分的提取工艺的优化及其抑菌作用。通过不同超声时间取值的最适时间实验、不同超声功率取值的最适功率实验、不同料液比取值的最佳比例实验、不同提取时间取值的最适时间实验、不同乙醇浓度取值的最佳浓度实验，先进行了单因素实证试验并展开分析，之后又进行正交实验，从而确定三种常见花茶有效成分的最适提取条件；通过测量抑菌圈大小、MIC、MBC值，比较绿原酸和总黄酮提取液这两种不同场景环境下，对大肠杆菌能够发挥的抑菌效果，及对金黄色葡萄球菌起到有效抑菌作用，同时还有枯草芽孢杆菌能够达到的抑菌效果，实验结果表明，针对金银花绿原酸进行提取过程中最适条件具体分别是：超声时间有效取值是15min，料液比有效取值是1:30(g/mL)；超声功能有效取值是180W，提取时间有效取值为60min；与此同时，针对杭白菊总黄酮进行提取过程中最适条件具体分别是：料液比有效取值是1:15(g/mL)；提取温度有效取值是50；提取时间有效取值是70min；另外，针对玫瑰花总黄酮进行提取过程中最适条件具体分别是：乙醇浓度有效取值是70%，超声次数有效取值是3次，超声时间有效取值是30min，料液比有效取值是1:25(g/mL)；从实验所得各种数据和结果显示，绿原酸表现显著，另外总黄酮也表现突出，二者的提取液对枯草芽孢杆菌的抑制作用最显著。结论：通过对三种花茶有效成分的提取及抑菌效果研究，为天然抑菌剂的开发和生产应用提供参考。关键词：金银花；杭白菊；玫瑰花；绿原酸；黄酮；提取；抑菌圈；MIC；MBCAbstractObjective: To study the extraction process optimization and bacteriostasis of three kinds of effective components of scented tea. Through different ultrasonic time, the different values between the most timely experiments of ultrasonic power value of the optimal power experiment, different solid-liquid ratio value as the number of the best proportion of the experiment, different extracting time between the most timely experiment, the optimal concentration of ethanol concentration, experiment, first has carried on the empirical test and analysis, single factor and orthogonal experiments, after To determine the optimal extraction conditions of three common active components of scented tea; By measuring the bacteriostatic circle size, MIC and MBC values, the bacteriostatic effects of chlorogenic acid and total flavonoid extracts on Escherichia coli, Staphylococcus aureus, and Bacillus subtilis were compared under two different environments. The experimental results showed that, The optimal conditions for the extraction of chlorogenic acid from Lonicerae japonicae were as follows: the effective value of ultrasonic time was 15min, and the effective value of solid-liquid ratio was 1:30(g/mL); The effective value of ultrasonic function was 180W, and the effective value of extraction time was 60min. At the same time, the optimal conditions for the extraction of total flavonoids from Chrysanthemum sinensis were as follows: the effective value of solid-liquid ratio was 1:15(g/mL); The effective value of extraction temperature is 50. The effective value of extraction time was 70min. In addition, the optimal conditions for the extraction of total flavonoids from rose were as follows: the effective value of ethanol concentration was 70%, the effective value of ultrasonic frequency was 3 times, the effective value of ultrasonic time was 30min, and the effective value of solid-liquid ratio was 1:25(g/mL). Various data and results obtained from the experiment showed that chlorogenic acid and total flavonoids were prominent, and their extracts had the most significant inhibitory effect on Bacillus subtilis. Conclusion: The extraction and antibacterial effect of three active components of scented tea were studied to provide reference for the development, production and application of natural antibacterial agents.Keywords: LonicerajaponicaThurb; Chrysanthemum morifolium; Rosa rugosaThunb; Chlorogenic acid; Flavonoids; Extract; Zone of inhibition; MIC；MBCV目 录毕业论文原创性声明和毕业论文版权使用授权书I摘要IIIABSTRACTIV前言11 实验材料21.1实验仪器21.2实验材料及供试菌种21.3培养基22 金银花、杭白菊、玫瑰花中绿原酸和总黄酮提取工艺的优化22.1提取物绿原酸和总黄酮的检测方法22.2单因素实验22.3正交试验42.4抑菌活性实验53 结果与分析63.1单因素实验的结果62.2正交试验的结果102.3三种花茶最佳工艺提取物抗菌活性的对比134 讨论165 结论16参考文献18附录20致谢28V前言随着人民生活水平的日益提高，对有害细菌的消灭和控制成为人们探索的方向。花茶是如今十分流行的保健茶，其受欢迎程度较高，有一定的抑菌活性。其不仅在体内外具有良好的抑菌和杀菌能力，而且在体内残留少、副作用少，不会对人体造成危害，有望将其开发成天然抗菌剂，具有广阔的应用前景。金银花又名忍冬(LonicerajaponicaThurb),为忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬属(Lonicera)植物，简称银花。具有清热解毒、抗炎等诸多功效，自古就以为人们所知所用，对此本草纲目中也有提到，指出金银花在功效上具有一定解毒作用，长期坚持服用能够身轻体健，同时又着重强调其具体疗效中对于“诸恶疮”具有显著效用，如肿毒疮、杨梅疮等 1-3。从药用成分看，金银花中主要起效的成分为绿原酸(chlorogenicacid，CHA)，金银花的主要功能性有机酸为绿原酸，其化学名为3-O-咖啡酰奎酸，其半水合形式结晶为白色或黄色的针状结晶。具有清热解毒，抗菌消炎抗病毒等作用，绿原酸能抑制或杀死多种微生物，是多种抗菌药物的重要组成部分，尤其是针对金黄色葡萄球菌的抑制作用4。卫生部对外发行的权威性药品标准中对于涉及到具有清热解毒功效，同时还具备抗菌消炎作用的药品种类总计高达170余种，其中多指中成药，在这些药物的成分列表中都显示具有一定绿原酸，在当前中成药制造和生产中，如银黄亦或双黄连等多种不同类别制剂，绿原酸的具体含量已经成为一个质量重要指标5。杭白菊(Chrysanthemum morifolium Ramat)是一种在日常生活常见的菊科植物，因其颜色和大小又名小白菊，常用来制作花茶饮品，也是一种功效显著的中草药，浙江桐乡盛产此物，是当地特色之一，名列“浙八味”。杭白菊药气显示为甘，微微发苦，归肺经，也可以归肝经，在外在功效表现上为平肝明目等多种方面，可以用治疗风热感冒，对于视线不清眼前模糊及眼部发肿疼痛、眼部发红等症状能环节，用于疮痈肿毒等也有效用6-8。玫瑰花(Rosa rugosaThunb)是一种兼具观赏和药用的蔷薇科植物的花蕾，是一种常用中药,最早记载于食物本草9，有抗菌、抗肿瘤10等功效。对于玫瑰所具备的功效，在中药学中将其纳入理气药之中，玫瑰药气显示为甘，药性显示为温，对肺部脾脏都有显著益处，另外对肝胆也具有较多好处，因此能够理顺气脉疏通肝脏，还有缓解淤积畅通血脉等功效，因此肝胃气痛、厌食烦呕等相关治疗中常会用到玫瑰，同时还可以用于跌打伤痛治疗，对于女性月经不调也可以用作辅助性治疗手段。气味芬芳怡人，具有良好的食用价值与保健功能11-12。总黄酮（flavonoids）是以2-苯基色原酮作为基本结构的多酚类物质，广泛存在于植物体中，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗自由基、降血糖等药理作用，近年来，国内外科学家做了大量实验证实了总黄酮对自然界中许多病原微生物具有广泛的抑制和杀灭作用13-15。11实验材料1.1实验仪器在仪器设备选择上，分光光度计和工作台这两种设备都出自苏洁净化，具体型号为分光光度计是该公司生产的紫外分光光度计（型号：722），工作台则是该公司生产的超净工作台（型号：SW-CJ-2F）；灭菌器这种设备出自上海申安，具体型号是该公司生产的立式压力蒸汽灭菌器（LDZX-75KB）；天平和清洗器这两种设备都出自上海精密，具体型号为天平是该公司生产的电子天平 （YP1201N），而清洗器是该公司生产的超声波清洗器（型号：LQ-300DE）；对于蒸发仪的选择，选定上海耀裕，具体型号为该公司生产的旋转蒸发仪（RE- 2000E）；另外还有一些基础性仪器，如微量加样器，锥形瓶，滤纸片等。1.2实验材料及供试菌种涉及到金银花、杭白菊、玫瑰花购于千金大药房，经鉴定无误后，洁净烘干粉碎过筛后备用。涉及到菌种选择，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌等三种不同类型的实验菌种均由长沙医学院基础医学院微生物实验室提供。无水乙醇；甲醇；亚硝酸钠；硝酸铝均为分析纯；蒸馏水。1.3培养基细菌培养过程中对于综合各种情况和需求后选择了LB培养基。该培养基具体组成如下：蛋白肽取值为10g、酵母膏取值为5g、抗氧NaC取值为110g、蒸馏水取值为1000mL，环境设置中pH取值为7，琼脂取值为20g。2金银花、杭白菊、玫瑰花中绿原酸和总黄酮提取工艺优化2.1提取物绿原酸和总黄酮检测方法参考赖海涛16和吕亭亭17的方法采用紫外分光光度法和亚硝酸钠-硝酸铝(NaNO2-Al(NO3)3)比色法进行检测绿原酸和总黄酮的含量。2.2单因素实验参考李萍；高红；王晓林18-20等人的方法进行单因素实验。2.2.1金银花绿原酸的单因素2.2.1.1超声时间对绿原酸提取效果的影响准确称取10 g金银花样品于100mL锥形瓶中，超声处理时间以5min为单次增加时间，即第一次时间设置为5min，第二次时间设置为10min，以此类推，直到时长达到25min，其间每一项操作处理都需要进行3次重复操作，以确定不同超声时间环境下对绿原酸提取效率的影响，确定最适超声时间。2.2.1.2料液比对绿原酸提取效果的影响准确称取10 g金银花样品于100mL锥形瓶中，料液比为1:10、1:20、1:30、1:40、1:50(g/mL)，超声处理时间为上述实验中所得最佳超声时间，每项处理重复3次，研究料液比对绿原酸提取率的影响，确定最适料液比。2.2.1.3提取时间对绿原酸提取效果的影响准确称取10 g金银花样品于100mL锥形瓶中，所选择的料液比为前述实验中已经通过验证的最佳数值，与此同时超声处理时间也以前述实验中已经通过验证的最佳数值，提取时间以10min为单次增加时间，即第一次时间设置 为30min，第二次时间设置为40min，以此类推，直至时长达到80min，其间每一项操作处理都需要进行3次重复操作，以确定不同提取时间环境下对绿原酸提取效率的影响，对提取时间效率性做出明确判断，确定最佳时长。2.2.1.4超声功率对绿原酸提取效果的影响准确称取10 g金银花样品于100mL锥形瓶中，所选择的料液比为前述实验中已经通过验证的最佳数值，与此同时超声处理时间也以前述实验中已经通过验证的最佳数值，超声功率分别以60W为单次增加功率，即第一次功率设置为60W，第二次功率设置为120W，以此类推，直至功率增加至300W，其间每一项操作处理都需要进行3次重复操作，以确定不同超声功率环境下对绿原酸提取效率的影响，确定最适超声功率。2.2.2杭白菊总黄酮的单因素实验2.2.2.1料液比对总黄酮提取效果的影响在本次实验中，杭白菊样品取值为2.50g，将之置入100mL锥形瓶中，其中液体为乙醇，浓度取值为70%，料液比取值中乙醇以7.5mL为单次增加容积，即第一次乙醇容积取值为22.5mL，此时料液比为1：9(g/mL)，第二次容积取值为30mL，此时料液比为1:12(g/mL)，以此类推，直至乙醇取值达到52.5mL，此时料液比为1：21(g/mL)，已确定不同料液比环境下对杭白菊总黄酮提起效率所起的作用和影响，确定最适料液比。2.2.2.2提取时间对总黄酮提取效果的影响在本次实验中，杭白菊样品取值为2.50g，将之置入100mL锥形瓶中，所选择的料液比为前述实验中已经通过验证的最佳数值，乙醇浓度取值为70%，提取时间以20min为单次增加时间，即第一次时间设置 为30min，第二次时间设置为50min，以此类推，直至时长达到110min，以确定不同提取时间环境下对杭白菊总黄酮提取效率的影响，对提取时间效率性做出明确判断，确定最佳时长。2.2.2.3提取温度对总黄酮提取效果的影响在本次实验中，杭白菊样品取值为2.50g，将之置入100mL锥形瓶中，所选择的料液比取值为1：10，与此同时，乙醇浓度取值为70%，所选择的提取时间为前述实验中已经通过验证的最佳数值，提取温度以10为单次增加温度，即第一次温度设置为30，第二次温度设置为40，以此类推，直至温度达到70，以确定不同温度环境下对杭白菊总黄酮提取效率所产生的作用和影响，确定最适提取温度。2.2.3玫瑰花总黄酮的单因素实验2.2.3. 1乙醇浓度对玫瑰花总黄酮提取率的影响在本次实验中，玫瑰花样品取值为10g，将之置入100mL锥形瓶中，所选择的提取温度设置为50，乙醇浓度以10%为单次增加浓度，即第一次浓度设置为50%，第二次浓度设置为70%，以此类推，直至浓度达到90%，从而确定不同乙醇浓度环境下对玫瑰花总黄酮提取效率的影响，对乙醇浓度的最佳配比。2.2.3. 2料液比对玫瑰花总黄酮提取率的影响在本次实验中，玫瑰花样品取值为10g，将之置入100mL锥形瓶中，所选择的提取温度设置为50，所选择的乙醇浓度设置为上述实验最佳乙醇浓度，料液比分别为1:10、1:20、1:30、1:40(g/mL)，研究料液比对玫瑰花总黄酮提取率的影响，确定最适料液比。2.2.3.3超声次数对玫瑰总黄酮提取率的影响在本次实验中，玫瑰花样品取值为10g，将之置入100mL锥形瓶中，所选择的提取温度设置为50，所选择的乙醇浓度设置为上述实验中最佳料液比，乙醇浓度为上述实验中最适乙醇浓度，保鲜膜封口，分别超声提取1、2、3、4、5次，研究超声次数对玫瑰花总黄酮的影响，确定最适超声次数。2.2.3.4超声时间对玫瑰总黄酮提取率的影响固称取玫瑰花样品10g于100mL锥形瓶中，提取温度50，所选择的料液比取值、乙醇浓度取值及超声提取次数取值都是前述实验中已经通过验证的最佳数值，保鲜膜封口，超声时间取值除了第一次取值时间设置为5min，之后均以10min为单次递增时间，即第二次时间取值为10min，第二次时间取值为20min，以此类推，直至时长达到40min，以确定不同超声时间环境下对玫瑰花总黄酮提取效率的影响，对超声时间效率性做出明确判断，确定最佳时长。2.3正交试验参考李萍；高红；王晓林等人18-20的方法进行正交试验。2.3.1金银花绿原酸正交实验从前文所进行的金银花绿原酸提取效率的实验显示出的各个不同单因素所获得的试验结果，以超声时间的不同取值、提取时间的不同取值、超声功率的不同取值，展开3因素3 水平正交试验，具体详情如表1所示。表1金银花绿原酸正交试验因素表水平因素超声时间min (A)提取时间min (B)超声功率W(C)1125015021560180318702102.3.2杭白菊总黄酮正交试验从前文所进行的杭白菊总黄酮提取效率的实验显示出的各个不同单因素所获得的试验结果，以料液比的不同取值、提取时间的不同取值、提取温度的不同取值，展开3因素3 水平正交试验，具体详情如表2所示。表2杭白菊总黄酮正交试验因素表水平因素料液比g/mL(A)提取时间min(B)提取温度(C)11:10504021:15705031:2090602.3.3玫瑰花总黄酮正交试验从前文所进行的玫瑰花总黄酮提取效率的实验显示出的各个不同单因素所获得的试验结果，以乙醇浓度的不同取值、超声次数的不同取值、超声时间的不同取值，展开3因素3 水平正交试验，具体详情如表3所示。表3玫瑰花总黄酮正交试验因素表水平因素乙醇浓度% (A)超声次数(B)超声时间min(C)1652252703303754352.4抑菌活性实验2.4.1金银花、杭白菊和玫瑰花提取液的制备取金银花、杭白菊和玫瑰花粉末各2g，置入50mL甲醇中，甲醇浓度取值为50%，利用超声效应进行滤液提取，将提取物进一步蒸发浓缩，所得物质放入锥形瓶，最终获取到的药液浓度取值为每毫升0.1g，进行灭菌操作，以高压蒸汽方式进行，灭菌温度设置为121，灭菌时间设置为10min，保存环境为4左右，将之放入温度调试后的冰箱备用。2.4.2菌种的制备将备好的菌种取出，将金黄色葡萄球菌放入预先准备好的LB培养基中，之后的枯草芽孢杆菌和大肠杆菌依次进行相同操作，即放入LB培养基，温度环境设置为37，需要培养时间区间为18到24小时。计数法选取上使用普遍适用的平板计数。将培养所得菌液再分别进行稀释操作得到菌悬液，所用稀释液选取为生理盐水，稀释效果为每毫升含有活菌1107个，备用。2.4.3体外抑菌活性测定（1） 参照马绪荣等的方法21。活性测定，也就是体外抑菌活性的取值表达范围测定，通过琼脂平板扩散法实现。具体操作流程为，预先备好100L稀释菌液，同时也准备好15mL的琼脂培养基，确保其温度冷却维持在40，二者进行均匀混合，置入9cm平皿，放置若干时间进行冷凝备用。对琼脂平板进行打孔操作，3个6mm却保持均匀距离的小孔，确保小孔间维持30mm的间隔，把孔内培养基进行取出操作，与此同时在小孔中置入6mm左右大小的无菌滤纸片，将前面备好的30 L混合溶液，为了进行有效对照，另外以30L无菌水作为参照组，放入培养箱，环境温度取值37，实验时间24h，取出平板观察，对抑菌圈具体表现进行数值确定，确保每组有6个重复实验平板。（2） MIC测定，也就是进行最小抑菌浓度的取值范围测定，采用的是比较常见的等倍稀释法，具体操作流程为，选取1.0mL的浓度取值表达是50mg/mL的样品滴入第一支试管，随后置入1mL取值的灭菌培养基；从前一个操作所获取溶液中吸取1mL样本，滴入第二支试管，依此类推至第九管。第10管含有2mL培养基，并弃去1mL；同时以1 mL相同浓度的DMSO和纯水代替药物提取物与培养基混合做空白对照，相同浓度的对羟基苯甲酸乙酯为阳性对照。向各个试管中加入预先准备好的菌悬液，具体取值为100L，操作工具是微量加样器，放入培养箱，环境温度取值37，实验时间24h，到达时间取出充分震匀，并逐一对试管进行观察，以肉眼判定试管的浑浊情况，判断其中菌生长情况；对照管中菌呈现浑浊状生长，溶液开始出现澄清的最低浓度确定为样品的MIC值。（3）MBC测定，也就是进行最小杀菌浓度的取值范围测定。提起合适菌悬液，具体取值为100L，该液体样本必须确保具有高于或等于MIC浓度，分别滴入灭菌的培养基中，并让其呈现均匀分布状态，放入培养箱，环境温度取值37，实验时间24h，取出平板用肉眼观察，一般情况下最低样品MBC浓度表现为无菌落或菌落数值表现低于5个。3结果与分析3.1单因素实验的结果3.1.1金银花绿原酸单因素实验的结果3.1.1.1超声时间对绿原酸提取效果的影响图1超声时间对金银花绿原酸提取率的影响依据图1数据可知，当超声时间取值表达为15min时，针对绿原酸所进行的提取率环境实验得到成果，指标达最高，之后出现下降趋向，分析原因是其中诸多可溶性物质也被溶出，由此推之，超声时间有效最佳取值示15min。3.1.1.2提取时间对绿原酸提取效果的影响图2料液比对金银花绿原酸提取率的影响依据图2数据可知，料液比取值表达是1:30(g/mL)时，针对绿原酸所进行的提取率环境实验得到成果，指标达到最高，实现基本平衡，由此推之，料液比有效最佳配比是1:30(g/mL)，但综合试验结果来看，料液比对提取所得结果并无显著作用。3.1.1.3提取时间对绿原酸提取效果的影响图3提取时间对金银花绿原酸提取率的影响如图3所示，当提取时间取值表达为60min时，针对总黄酮所进行的提取率环境实验得到成果，指标达到最高，之后时间再继续延长则对提取率无明显影响，由此推之，提取时间有效最佳取值是60min，此时提取表现最优。3.1.1.4超声功率对绿原酸提取效果的影响图4超声功率对金银花绿原酸提取率的影响如图4所示，超声功率的取值表达在180W这个数值时出现最大平衡，低于该取值，则会出现绿源夜提取率随取值提高而跟着提高，大于该取值，反而有下降的趋势，所以最适的超声功率为180W。3.1.2杭白菊总黄酮单因素试验结果3.1.2.1料液比对总黄酮提取量的影响图5料液比对杭白菊总黄酮提取量的影响依据图5数据可知，料液比取值表达是1:9(g/mL)时，针对总黄酮所进行的提取率环境实验得到成果，指标达到最高，之后出现下降，经分析原因是溶剂只有一定配比才能发挥有效作用，过多溶剂会导致出现溶解对象溶解量饱和情况，进而让其他杂质也出现一定溶出现象，由此推出，料液比有效最佳取值是1:9(g/mL)。此时提取表现最优。3.1.2.2提取时间对总黄酮提取量的影响图6提取时间对杭白菊总黄酮提取量的影响依据图6数据可知，当提取时间取值表达是70min时，针对总黄酮所进行的提取率环境实验得到成果，指标达到最高，之后出现下降，分析原因是过长时间作用导致超声影响发生改变，破坏了黄酮结构，所以杭白菊最适的提取时间为70min。3.1.2.3提取温度对总黄酮提取率的影响图7提取温度对杭白菊总黄酮提取率的影响如图7所示，当提取温度在 3050 时，提取的总黄酮量随提取温度的升高而升高，当提取温度为 50 时，总黄酮提取量最大；而随后开始下降，所以杭白菊总黄酮最适的提取温度为 50 。3.1.3玫瑰花总黄酮单因素试验结果3.1.3.1乙醇浓度对玫瑰花总黄酮提取率的影响图8乙醇浓度对玫瑰花总黄酮提取率的影响依据图8数据可知，当乙醇浓度取值表达为70%时，显示出最合适的提取作用，由此推之，乙醇浓度有效最佳取值是705%，此时提取表现最佳。3.1.3.2料液比对玫瑰花总黄酮提取率的影响图9料液比对玫瑰花总黄酮提取率的影响依据图9可知，当料液比配比取值表达为1:25(g/mL)时，针对玫瑰花总黄酮所进行的提取率环境实验得到成果，此时总黄酮提取效果最佳总黄酮含量也达到最高点，由此推之，料液比有效最佳取值是1:25(g/mL)，此时提取表现最优。3.1.3.3超声次数对玫瑰花总黄酮提取率的影响图10超声次数对玫瑰花总黄酮提取率的影响如图10所示，绿原酸提取到一定次数，即3次时，此时呈现出了最佳提取率，当次数继续递增，则显示对提取率影响不显著趋向，由此推之，提取次数有效最佳取值是3次。3.1.3.4超声时间对玫瑰花总黄酮提取率的影响图11超声时间对玫瑰花总黄酮提取率的影响如图11所示，当超声提取时间取值表达为30min时，针对玫瑰花总黄酮所进行的提取率环境实验得到成果，此时提取率显示为最大值，提取过程和概率达到平衡，由此推之，超声时间有效最佳取值是30min。3.2正交试验结果3.2.1金银花绿原酸正交试验结果表1 金银花绿原酸正交试验结果试验号超声时间min(A)提取时间h(B)超声功率W(C)得率%12 1 3 0.6023 2 1 0.5631 2 3 0.6342 3 1 0.5853 3 3 0.6662 2 2 0.7973 1 2 0.6881 3 2 0.7091 1 1 0.44K10.5990.5820.552K20.5760.5920.659K30.6390.6390.602R0.0630.0570.107表2金银花绿原酸提取正交试验方差分析表方差来源离均差平方和(SS)自由度(V)均方(MS)F值P值A0.00720.00334.3330.028*B0.01320.00765.3330.015*C0.05820.029290.3330.003*误差020总计0.0788注：如P0.05为*；p0.01为*依据表1以及表2可以得出玫瑰花总黄酮提取量的不同因子所发挥作用和影响进行程度排序，影响最突出是超声功率，次一级是超声时间，影响最不显著是提取时间。而对这些因子又进一步细化观察，发现超声时间（A）在影响表达上与提取时间（B）不具有显著差异性，超声功率(C)对提取工艺的影响比较显著，所以对该因素应选择最佳提取条件，通过方差分析结果得出最优提取组合为A2B2C2，换言之也就是当超声时间有效取值为15min，提取时间有效取值为60min，与此同时超声功率有效取值为180W时为最佳组合。3.2.2杭白菊总黄酮正交试验结果表3杭白菊总黄酮正交试验结果试验号料液比g/mL(A)提取时间min(B)提取温度(C)提取量%12 1 3 3.29123 2 1 2.65831 2 3 3.01242 3 1 3.47053 3 3 2.00162 2 2 3.98573 1 2 2.87081 3 2 3.18091 1 1 3.310K13.6532.9422.895K22.8342.7512.85K32.3343.1273.075R1.3190.3760.225表4杭白菊总黄酮提取正交试验方差分析表方差来源离均差平方和(SS)自由度(V)均方(MS)F值P值A1.75420.877195.5240.005*B0.1920.09521.2280.045*C0.51520.25857.4430.017*误差0.00920.004总计2.4698注：如P0.05为*；p0.01为*通过表3以及表4可以得出杭白菊总黄酮提取量的不同因子所发挥作用和影响进行程度排序，影响最突出是料液比，次一级是提取时间，影响最不显著是提取温度。而对这些因子又进一步细化观察，会发现提取时间（B）在影响表达上与提取温度（C）不具有显著差异，料液比(A)对提取工艺的影响比较显著，所以对该因素应选择最佳提取条件，通过方差分析结果得出最优提取组合为A2B2C2，换言之也就是当料液比具体取值是1:15g/mL，而提取时间具体取值是70min，与此同时提取温度具体取值是50时为最佳组合。3.2.3玫瑰花总黄酮正交试验结果表5 玫瑰花总黄酮正交试验结果试验号乙醇浓度%(A)超声次数(B)超声时间min(C)总黄酮含量%12 1 3 27.8023 2 1 26.5231 2 3 25.9042 3 1 27.6653 3 3 27.4062 2 2 28.2073 1 2 26.1581 3 2 25.5891 1 1 24.50K126.7426.7526.48K227.2126.7326.68K325.5726.3126.08R1.640.440.6表6 玫瑰花总黄酮提取正交试验方差分析表方差来源离均差平方和(SS)自由度(V)均方(MS)F值P值A9.84424.922388.250.003*B1.05620.52841.6540.023*C0.97620.48838.5090.025*误差0.02520.013总计11.9028注：如P0.05为*；p0.01为*通过表5以及表6可以得出玫瑰花总黄酮提取量的不同因子所发挥作用和影响进行程度排序，影响最突出是乙醇浓度，次一级是超声次数，影响最不显著是超声时间。而对这些因子又进一步细化观察，发现超声次数（B）在影响表达上与超声时间（C）不具有显著差异性，在所有因子表达中乙醇浓度（A）起到了最突出和显著的影响，所以对该因素应选择最佳提取条件，通过方差分析结果得出最优提取组合为A2B2C2，换言之也就是乙醇浓度有效取值为70%，超声次数有效取值为3次，超声时间有效取值为30min时为最佳组合。3.2三种花茶最佳工艺提取物抑菌活性的对比3.2.1三种花茶对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌抑菌圈大小比较表7 三种花茶最佳工艺提取物抑菌圈大小比较抑菌圈大小（单位mm）大肠杆菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌金银花绿原酸11.31+0.2110.02+0.158.71+0.04玫瑰花总黄酮10.07+0.3110.88+0.257.39+0.17杭白菊总黄酮8.56+0.296.31+0.077.01+0.19表8 三种花茶最佳工艺提取物抑菌圈方差分析表Levene统计df1df2P值大肠杆菌0.150260.864*金黄色葡萄球菌1.086260.396*枯草芽孢杆菌1.195260.366*离均差平方和(SS)自由度(V)均方(MS)F值P值大肠杆菌组之间11.38025.69076.1050组内0.44960.075总计11.8298金黄色葡萄球菌组之间35.389217.694590.4660组内0.18060.030总计35.5688枯草芽孢杆菌组之间4.77722.388107.5860组内0.13360.022总计4.9108注：如P0.05为*；p0.01为*综合表7到表8的数据，从三种不同花茶中提取的成分不已提取液，对实验所涉及的三种细菌都表现出了程度不一的抑制效果，显示出对大肠杆菌具备最显著灭杀功效的是金银花绿原酸，在历次实验中抑菌圈表现浮动在11.10mm到11.52mm之间；显示出对金黄色葡萄球菌具备最显著灭杀功效的是玫瑰花总黄酮，在历次实验中抑菌圈表现浮动在10.63mm到11.13mm之间；显示出对枯草芽孢杆菌具备最显著灭杀功效的是，在历次实验中抑菌圈表现浮动在8.67mm到8.75mm之间。3.2.2三种花茶提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄糖球菌、枯草芽孢杆菌最小抑菌浓度(MIC/mg/mL)的检测结果。表 9 三种花茶最佳工艺提取物最小抑菌浓度最小抑菌浓度(MIC/mg/mL)大肠杆菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌金银花绿原酸0.7811.5630.391玫瑰花总黄酮1.5633.1250.781杭白菊总黄酮1.5636.2500.781由表9可知显示出对大肠杆菌具备最显著灭杀功效的是金银花绿原酸，具体的MIC数值表达是0.781mg/mL；与此同时，显示出对金黄色葡萄球菌具备最显著灭杀功效的同样也是金银花绿原酸，具体的MIC数值表达是1.563mg/mL；在实验中显示出对枯草芽孢杆菌具体最显著灭杀功效的是金银花绿原酸，具体的MIC均为0.391mg/mL。综上所述，从三种不同花茶中所得到的提取液，对实验所涉及的三种细菌都表现出了程度不一的抑制效果，但抑制表达最突出的均为金银花绿原酸。3.2.3三种花茶提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄糖球菌、枯草芽孢杆菌最小抑菌浓度(MBC/mg/mL)的检测结果。表10 三种花茶最佳工艺提取物最小杀菌浓度最小杀菌浓度(MBC/mg/mL)大肠杆菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌金银花绿原酸3.1256.2501.563玫瑰花总黄酮6.25012.5003.125杭白菊总黄酮6.25012.5001.563由表10可知对大肠杆菌杀灭作用最强的是金银花绿原酸，具体的MBC数值表达为3.125mg/mL；与此同时，显示出对金黄色葡萄球菌具备最显著灭杀效果也同样为金银花绿原酸，它的MBC为6.250mg/mL；对枯草芽孢杆菌杀灭作用最强的是金银花绿原酸和杭白菊总黄酮，它们的MBC均为1.563mg/mL。由此可知三种花茶提取物对供试菌均有一定的杀菌作用。4讨论花茶是当今非常受欢迎的保健茶，使用方式多为泡煮。许多花茶中的的有效抑菌如绿原酸、总黄酮等成分对自然界中许多病原微生物具有广泛的抑制和杀灭作用。近些年，涉及到绿原酸的研究中多关注其抑菌功效且已经通过诸多实验得到有效验证，另外对总黄酮在面对诸多细菌时能起到的抑菌效果也得到了诸多实验的证实，二者都可以对微生物深层次的细胞膜起效，对其流动性能够产生影响，甚而起到破坏效用从而让膜内物质向细胞外渗出22，绿原酸和总黄酮是具有多种生物活性功能的天然化合物，被广泛应用于各行各业，具有潜在的活性研究价值和应用前景。5结论本实验采用正交试验优化单因素试验对超声辅助提取三种花茶的有效成分绿原酸与总黄酮工艺进行优化，目的是研究最适提取方法，制备花茶有效成分提取液，用于体外抑菌活性研究。以不同花茶具有的较多有效成分如从金银花中通过各种工艺进行绿原酸提取，或者从杭白菊和玫瑰中通过复杂流程进行总黄酮提取，对其中不同情况下所产生的提取率作为指标，先进行了单因素实证试验并展开分析，之后又进行正交实验，从而确定三种常见花茶有效成分的最适提取条件。实验结果显示，针对金银花绿原酸进行提取过程中最适条件具体分别是超声时间有效取值是15min，料液比有效取值是1:30(g/mL)，提取时间60min，超声功率180W。杭白菊总黄酮的最佳提取条件为料液比1:15(g/mL)，提取时间70min，提取温度50。玫瑰花总黄酮的最佳提取条件为乙醇浓度70%，料液比1:25(g/mL)，超声次数3次，超声时间30min。表明单因素及正交试验优化的花茶有效成分提取工艺稳定可行。本文还进行了针对三种不同较常见菌种的抑菌实验，先后用绿原酸提取液和总黄酮提取液展开了对大肠杆菌所进行的抑制实验，之后又针对金黄色葡萄球菌展开了抑制实验，以及最后对预先培养好的枯草芽孢杆菌进行了抑制实验，试验方法采用了一般性的滤纸片法，结果表明二者均能对三种不同细菌都表现出了程度不一的抑制效果，其中的作用机制经过仔细分析和探究后认为金银花中所具有的活性物质起了作用，对细菌核酸起到一定功效，从而最终表现出抑菌反馈。在抑菌效果测试中，效用最显著的是金银花绿原酸，详细来说，大肠杆菌MIC具体数值表达是0.781mg/mL；MBC具体数值表达是3.125mg/mL；与此同时，金黄色葡萄球菌MIC具体数值表达是1.563mg/mL，MBC具体数值表达是6.250mg/mL；最后涉及到的枯草芽孢杆菌时显示有两种提取液得到了一样的MBC，除了前面提及绿原酸，还包括了杭白菊总黄酮，MBC具体数值表达都是1.563mg/mL。对实验过程中三个菌种的活性进行观察，发现枯草芽孢杆菌具有最强的活性表达，大肠杆菌活性表达稍微差一点，而金黄色葡萄球菌具有最差的活性表达，由于其有很强的抑菌性, 因此绿原酸与总黄酮可逐渐被用作天然抑菌剂的开发，对花茶抗菌药用价值具有积极意义。参考文献1 陈文贵. 清热解毒金银花N. 大众卫生报,2015-07-02(006).2 Park KI,Park H,Nagappan A,et al.Polyphenofic compounds from KoreanLonicera japonicaThunb.induces apoptosis via AKT and caspase cascade activation in A549 cellsJ.Oncology Letters,2017 (13):2521-303 Sato Y,Itagaki S,Kurokawa T,et al.In vitro and in vivo antioxidant properties of chlorogenic acid and caffeic acid J.Int J Pharm,2011(403): 136-1384 胡居吾,韩晓丹,付建平,王慧宾,李雄辉.三种绿原酸提取物的抑菌和抗氧化效果比较J.天然产物研究与开发,2017,29(11):1928-1933.5 周莲. 金银花叶中绿原酸的提取、纯化及抑菌性质研究D.重庆工商大学,2014.6 中华人民共和国药典委员会编中华人民共和国药典（2015年版一部）M北京：中国医药科技出版社,2015:310-311.7 杨鹏飞,何春雨,黄申,毛多斌. 杭白菊化学成分的研究J.中成药,2019,41(12):2924-2928.8 曾元儿.中国药典M.中山:中山大学出版社,2010:292.9 武晓英,李博,吴丽华,曹贵东,乔宏萍.玫瑰花提取物对砷胁迫下酵母细胞凋亡抑制的研究J. 激光生物学报,2020,29(4):325-332.10 LIU Yan, ZHI De-juan,WANG Xin, FEI Dong-qing,ZHANG Zhan-xin,WU Zheng-rong,LI Yang,CHEN Peng,LI Hong-yu. 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