实验二细菌的接种、培养及代谢产物

实验二细菌的接种、培养及代谢产物( Bacterial Inoculetion and Artifical Culture andMetaboic products )一、细菌的人工培养(Artifical Culture of Bacteria)在适当条件下，绝大多数细菌可用人工方法培养，使 其繁殖，通过人工培养，获得纯种细菌，是进一步观 察研究各种细菌具有不同特性的基础。(一) 常用培养基的 制备1、肉汤培养基：是常用的液体培养基，也是制备某些其他培养基的基 础。材料：( 制 备 100ml 肉 汤 培 养 基 的 用 量 )(1) 培养基的成分：牛 肉 50g蛋 白 脂 1g氯 化 钠 0. 5 g磷酸氢二钾(K2HP0412H20)0. 1g蒸馏水 100m1(2)玻皿、试剂、比色管、比色架、吸管、1N与1 / 20N 的 NaOH、 三角烧瓶、 漏斗、 中试管、 酚红指示剂、 滤 纸 、 卷 筒 、 天 平 、 蒸 馏 水 。方法：(1 )将已去筋膜脂肪并经绞碎鲜牛肉50g ,加蒸馏水 100ml， 放 入 冰 箱 中 过 夜 。(2 )加热4550 C小时，并煮沸半小时，用数层 纱布或滤纸过滤， 滤液用蒸馏水补足其量为 100m1。( 3) 于滤液中加氯化钠 0.5g， 蛋白脂 1g、 磷酸氢二 钾 0. 1g， 加 热 使 之 完 全 溶 化 。(4 )测定酸碱度并调整至PH7. 6，必要时用滤纸过滤。( 5)按需要分装于试管或烧瓶内，加 棉花塞并包装后， 置高压蒸汽灭菌器内经 15 磅/ 寸 22030 分钟灭菌。( 6) 灭 菌 后 置 37C 温 箱， 孵 育 24h， 无杂 菌 生长 ， 即 可应用 。 或放冰箱备用 。2、普通琼脂培养基它是最常用的固体培养基。材料：肉汤、琼脂方法：(1) 在肉汤中加入2 %琼脂，熔化后调整PH7.6 ,必要 时用棉花纱布过滤。(2) 于琼脂 凝固前， 分装于试管或小烧瓶内， 然后 加 棉 塞并包装。(3) 放入 高压蒸汽灭菌器内，经 15 磅/寸 220 分钟灭菌(4) 取出，将试管斜摆，琼脂 凝固后 即成普通琼脂 斜面 将烧瓶内琼脂培养基在未凝固前以无菌操作注入无菌 平皿内， 凝固后 即成普通琼 脂 平板， 倾注时应严格要求无菌操作。琼脂的温度应在50 C左右为宜。如温度 过高则平皿内凝水过多。 易致污染：过低则琼 脂 凝固 而致培养基表面不平滑。(5) 将琼脂 斜面及平板放入 37C 温 箱内， 孵育 24h， 若 无 菌 生长， 即可应 用或放入 冰箱保存备用。3、半固体培养基材料：肉汤、琼脂方法：在肉 汤 中加入 0.5 的 琼脂 ，熔化后 分装 于 小试 管 中 ， 每 管 约 2m1， 加 棉 塞 及 包 装 。 然 后 放 入 高 压 蒸 汽 灭 菌 器 内 ， 经 15 磅/寸 230 分 钟 灭 菌 。 取 出 直 立 ， 待凝固后即成半固体培养基，放37C温箱24小时， 若无菌生长， 即 可应用， 或放入冰箱保存备用。4、血液琼脂培养基有些细菌营养要求较高， 在普通琼脂培养基上生长不 良， 可用血液琼脂培养基进行培养。材料：普通琼脂培养基、血液。方法：将制好的普通琼脂培养基加热熔化， 待冷至 50C 时 以 无 菌 操 作 加 入 510脱 纤维 兔血 或羊 血， 混匀， 分注于灭菌试管或平皿中， 制成血液琼脂斜面 或血液琼脂平板，放37 C温箱24小时，若无菌生长， 即可应用， 或放入冰箱保存备用。(二) 细菌的接种方法1、普通方法(1) 用灭菌接种环取细菌培养物少许。(2) 左手握斜面培养基下端，斜面向上，用右手小指和 无名指拔出斜面培养基棉塞，管口经火焰灭菌，将沾 有细菌的接种环伸入管内，自下而上在琼脂上蜿蜒划 线。注意勿划破培养基。(3) 接种后，管口在火焰上灭菌，塞好棉塞，接种环灭 菌。2、液体培养基接种法(1)用灭菌接种环取细菌培养物少许。(2)以 无 菌 操 作 将 沾 有 细 菌 的 接 种 环 伸 入 肉 汤 管 中 ，将 环上细菌轻轻研磨于接近液面的管壁上，然后将试管 稍倾斜，使细菌混于液体中即可。3、半固体培养基接种法左手持半固体培养基，右手持接种针，火焰灭菌冷却 后，挑取细菌，垂直刺入半固体中心，至近管底部， 然后沿穿刺线退出。塞回棉塞，接种针重新灭菌。接 种完毕，于37 C培养18 24h,观察生长情况。4、平板划线接种法本法要求通过划线将标本中混杂的细菌在平板表面分 散开，并在其生长繁殖形成菌落。以达到分离培养的 目的。其操作方法是：(1)右手将接种环按灭菌操作法沾取少许标本或培养 物，左手拿平板略开盖，将标本涂于平板表面之一侧 边缘，运 用腕力作连续划线(但不要重叠，切 勿划破琼 脂 )，约占平板面积 14。(2)先旋转平板约 7090 度，将接种环火焰灭菌，冷 却后通过第一次划线取 23 次。再作同样连续划线又 占 平 板 面 积 约 1 4。(3) 重复上述操作，划完整个平板。(4)将平板倒放于37C温箱内，18 24h,观察各菌落 情况。(三) 细菌的培养方法欲使细菌生长繁殖， 除了适宜的培养基外， 尚需适当 的温度， 及一定的环境条件， 例如有的细菌生长需要 氧 ， 有 的 则 需 要 在 无 氧 环 境 下 才 能 生 长 ， 因 此 培 养 细 菌时通常用以下几种方法：需氧培养法：将已接种的试管或平板培养基置37C温箱中培养18-24h。2、厌氧培养法：将细菌生长环境中的空气排出或用其 它理化方法使细菌与氧隔离，造成无氧环境。 （具体 方法见后）3、二氧化碳（CO2 ）培养法：使细菌生长环境保持有 5-10%CO2，这样有助于某些细菌生长。（具体方法见 后）（四）细菌在培养基中的生长情况 在液体培养基的生长情况表面生长： 液体清晰， 细菌生长在液面形成菌膜。混浊生长： 液体均匀混浊， 或有少量沉淀。沉淀生长：液体清晰，细菌生长在管底，形成沉淀。 在固体培养基上的生长情况在琼脂斜面上长成菌苔在平板上形成肉眼可见的细菌集团， 即菌落。观察菌落的大小、形状、边缘、表面、颜色、溶血等 情况。3、在 半固体培养基上的生长情况：有 鞭毛的细菌，由 于能运动，在半固体培养基内沿穿刺线弥漫生长，原 来的穿刺线不清。无鞭毛的细菌，因不能运动，接种 后仍沿穿刺线生长，穿刺线与周围界限清楚。二、细菌的代谢产物( MetabolicProductsofBateria)细菌在新陈代谢过程中，除使自身得以生长繁殖外， 往往还能产生一些代谢产物。一般细菌的代谢产物大 致分为三类：一为可供鉴别细菌的代谢产物；二为与 细菌致病性有关的代谢产物；三为可供治疗用的代谢 产物。一)细菌的糖发酵试验 不同的细菌具有不同的糖酶以分解相应糖类，而且分 解各种糖类后的终末产物也不一致，有的产酸，有的 还产生气体，籍此可以作为鉴别细菌的一种依据，对 肠道细菌鉴定尤为常用。材料： 培养基：葡萄糖发酵管、乳糖发酵管；大肠杆菌、伤寒杆菌。方法：一种细菌接种一种糖发酵管后，再取该菌接种 另一种糖发酵管（注意一支管只能接种一种菌）。接 种后做好标记，集中放37 C孵育，次日观察结果。结果：在未接种 细菌前， 培养管应澄清、紫色、小倒立管内 无气泡。 接种 细菌后 观察结 果时， 应先确定细菌是否 生 长 ， 生 长 时 则 培 养 基 变 混 浊 。 若 能 发 酵 培 养 基 中 所 含的糖而产酸， 则该培养基变黄色， 记录结果以“+” 号 表 示 之 。 如 该 菌 发 酵 糖 时 产 酸 兼 产 气 ， 则 培 养 基 除 变 黄 色 外 ， 其 中 倒 立 之 小 玻 璃 管 有 气 泡 （ 见 图 3）， 此时以“”号记录之。如不发酵时，培养基不变色， 则用“-”号记录之。培养基种类乳糖葡萄糖结果举例细菌大肠杆菌伤寒杆菌 记录你组的实验结果。（二）靛基质产生试验有些细菌能分解培养基中蛋白胨内的色氨酸形成靛基 质（又称吲哚），靛基质为无色，不能直接观察，当 加靛基质试剂（欧氏柯氏试剂）时，试剂中的对二甲 基氨基苯甲醛与靛基质结合而成红色的玫瑰靛基质， 则可为肉眼识别。方法：取大肠杆菌蛋白胨水培养物及伤寒杆菌蛋白胨水培养 物 各 一 管 ， 沿 管 壁 徐 徐 加 入 靛 基 质 试 剂 （ 约 0. 3ml ） 如在试剂与培养物接触面之间有玫瑰红色出现者为阳 性。结果：大肠杆菌靛基质试验阳性，而伤寒杆菌为阴性。（三）甲基红试验许多细菌如大肠杆菌等，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙 酮酸再被分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等。这样使培 养 基 的 p H 降 至 4. 5 以 下 ，这 时 加 入 甲 基 红 试 剂 便 呈 红 色。甲 基 红 为 指 示 剂 ，变 色 范 围 为 pH4. 4（ 红 色 ）6. 2（ 黄 色）。若细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一 步转化为其它物质（如醇、醛、酮、气体和水等）， 则 培 养 基 的 酸 碱 度 仍 在 p H 6. 2 以 上 ， 故 加 入 甲 基 红 指 示剂呈黄色。红色为阳性反应，黄色为阴性反应。材料：葡萄糖蛋白胨水；大肠杆菌、产气杆菌；甲基红试剂、毛细吸管。方法：分别接种大肠杆菌及产气杆菌于两支葡萄糖蛋白胨水中，置37 C孵育1824 小时 ， 滴 加甲 基红 试剂 数滴 ， 立 即观 察结 果。（四）V P （ Voges-Proslauer ）试验某 些 细 菌 能 分 解 葡 萄 糖 ， 产 生 丙 酮 酸 ， 再 将 丙 酮 酸 脱 羧 变 为 中 性 的 乙 酰 甲 基 甲 醇 。 乙 酰 甲 基 甲 醇 在 碱 性 环 境 下 ， 被 空 气 中 的 氧 氧 化 为 二 乙 酰 ， 二 乙 酰 与 蛋 白 胨 水中的精氨酸所含的胍基起反应，生成红色的化合物即 为 VP 试 验 阳 性 。 若 培 养 基 中 胍 基 不 多 ， 可 加 入 少 量 含 胍 基 的 化 合 物( 如 肌 酸 、肌 酐 等 )以 加 速 反 应化学反应式材料：葡萄糖蛋白胨水； 大肠杆菌、产气杆菌； 李 ( Leifs o n ) 氏 试 剂 。将大肠杆菌、产气杆菌分别接种于 2 支葡萄糖蛋 白胨水。2、37C孵育48小时后，分别加入等量李氏（Leifson） 试剂，摇匀后不加塞，静置 30 分钟观察结果，出现红 色者为阳性反应。（五）枸椽酸盐利用试验在 枸 椽 酸 盐 培 养 基 中 ， 枸 椽 酸 钠 为 碳 的 唯 一 来 源 ， 磷 酸二氢铵为氨的唯一来源。有的细菌如产气杆菌等， 可 利 用 枸 椽 酸 盐 作 为 碳 源 ， 能 在 此 培 养 基 上 生 长 ， 并 分解枸椽酸盐而最后产生碳酸， 使培养基变碱性， 这 样 培 养 基 中 的 澳 麝 香 草 酚 蓝 指 标 由 绿 色 变 深 蓝 色 ， 即 为枸椽酸盐利用试验阳性。若细菌不能利用枸椽酸盐 为 碳 源 ， 在 此 培 养 基 上 就 不 生 长 ， 培 养 基 则 不 变 色 ， 则为枸椽酸盐利用试验阴性。材料：枸椽酸盐培养基；大 肠 杆 菌 、 产 气 杆 菌 。分 别 接 种 大 肠 杆 菌 、产 气 杆 菌 于 2 支 枸 椽 酸 盐 培 养 基37 C孵育24-48小时，观察结果，若有菌苔出现，培 养基变为深蓝色则为阳性。（六）硫化氢产生试验某些细菌能分解培养基中胱氨酸等含硫氨基酸， 生成 硫 化 氢 ， 硫 化 氢 遇 铅 盐 （ 或 铁 盐 如 硫 酸 亚 铁 ） 则 形 成 黑褐色硫化铅或硫化亚铁的沉淀物。黑色沉淀愈多， 表示生成的硫化氢量亦愈多。材料：醋酸铅培养基。菌种：大肠杆菌、变形杆菌琼脂斜面 1824 小时培养 物。方法：分别穿刺接种大肠杆菌、变形杆菌至两管醋酸铅培养 基中，37 C孵育24小时后观察，穿刺线部位呈黑褐色 者 为 阳 性 ， 不 变 色 者 为 阴 性 。（七）细菌菌落的色素及溶血现象观察有些细菌能产生色素， 有些细菌能产生溶血素， 当接 种于普通平板或血平板培养基上可形成有色菌落或在 菌落周围形成溶血环。菌落的色素和溶血环可作为鉴 别某些细菌的根据。1、观 察金黄色葡萄球菌在普通平板上产生的色素。该 色素只局限于菌落，属脂溶性色素。2、观 察绿脓杆菌在普通斜面上产生的色素。该色素可 扩散至菌苔周围的培养基中，属水溶性色素。3、观察金黄色葡萄球菌在血平板上出现的溶血环。附录一、胨水培养基取 蛋 白 胨 1 克 ，氯 化 钠 0. 5 克 ，溶 于 蒸 馏 水 100 ml 中调整酸碱度至pH7.6 ,分装小试管，高压蒸汽15磅灭菌 20 分 钟 。二、单糖发酵管培养基 在 100 ml 蛋白胨水中加入 1.6%溴甲酚紫酒精液指示 剂 0.1ml 及各种单糖 0.5-1 克，溶解后分装试管，内置 一玻璃小倒管。每试管约 2-3ml 培养基（以使小倒管 完全浸没为度），高压蒸汽 8 磅灭菌 20 分钟。取出后 在各种糖管上分别以不同颜色作标记，以资区别。如 红色代表葡萄糖，黄色代表乳糖，蓝色代表麦芽糖， 白色代表甘露醇，黑色代表蔗糖等。三、葡萄糖蛋白胨水培养基取 葡 萄 糖 0. 5 克 ，蛋 白 胨 0. 5 克 ，磷 酸 氢 二 钾 0. 5 克 溶 于 1 0 0 ml 蒸 馏 水 中 ，矫 正 p H 至 7. 2 ，高 压 灭 菌 后 备 用 。四、醋酸铅培养基将制好的普通琼脂培养基 100ml， 加热溶化，冷至60 C ,加入备好的无菌硫代硫酸钠及醋酸铅水溶液（硫 代硫酸钠及醋酸各 0.25 克，分别用 1ml 水溶化，高压 蒸汽灭菌）。摇匀后,无菌分装于小试管,每管约 1.5ml。 经 37C 孵育 24 小时, 无菌者可应用。五、枸椽酸盐琼脂培养基取枸椽酸钠 0.23 克, 磷酸二氢铵 0.1 克, 硫酸镁 0.02 克, 磷酸氢二钾 0.1 克, 氯化钠 0.5 克, 琼脂 2 克, 蒸馏水 100ml 加热熔化, 矫正 pH 为 6.8, 加入 0.5% 溴麝香草酚蓝酒精溶液 2ml, 混匀, 分装试管, 高压 灭菌。灭菌后趁热取出置成斜面。六、靛基质试剂（Ehrlich氏试剂）取 对 二 甲 基 氨 基 苯 甲 醛 2 克 ，溶 于 95%酒 精 190ml 中 再 加 入 浓 盐 酸 40ml 混 匀。七、甲基红试剂取甲基红0.02克，95%酒精60ml，混合溶解后加入蒸 馏 水 至 100ml。八、李 （ Leifson） 氏 试剂取硫酸铜溶于 10ml 蒸馏水中，然后加入浓氨水 40ml 混匀， 再加入 10%NaOH 溶液至 1000ml。