从业人员健康体检沙门氏菌志贺氏菌检测操作程序讨论稿

从业人员健康体检沙门氏菌志贺氏菌检测操作程序讨论稿 The pony was revised in January 2021 从 业 人 员 健 康 体 检 沙 门 氏 菌、志 贺 氏 菌 检 测 操 作 程 序 一、目的 本程序用于对从业人员健康体检进行沙门氏菌、志贺氏菌检测等致病菌检测的方法，以规范操作程序，保证检测数据的有效性。二、适用范围：本方法适用于从人体粪便中沙沙门氏菌、志贺氏菌的分离、鉴定及保存的梯相关操作。三、生物安全要求 标本及相应的致病菌操作必须在 BSL-2 生物安全实验室的生物安全柜中进行。四、试剂及仪器设备 4.1 试剂 采便盒、Cary-Blair 运送培养基、亚硒酸增菌液（SF）、改良亚硒酸盐磺绿增菌肉汤（SBG）、沙门志贺培养液、木糖-赖氨酸-脱氧胆酸琼脂（XLD）、麦康凯琼脂、沙门显色培养基、结晶紫沙门培养基（YS）、三糖铁（TSI）、动力-吲哚-尿素培养基（MIU）、沙门氏菌属诊断血清、志贺氏菌属诊断血清、API20E 生化试剂条、磁珠菌种保存管 4.2 仪器设备 恒温培养箱、微生物鉴定仪 五、采样方法 5.1 标本应为新鲜的或转移至 Cary-Blair 运送培养基的粪便或肛拭子，最优标本是转移到 Cary-Blair 运送培养基的粪便拭子。肛拭子不是最佳标本，仅在病人无粪便标本时采用。5.2 粪便标本：应采集自然排出的新鲜粪便，取稀水样、粘血样、脓血样，黏液样部分。盛于清洁、干燥、无吸水性的无菌容器，避免混入尿液、水和其他物质。5.3 肛拭标本：若无法获得粪便（如排便困难或婴幼儿），也可以采用肛拭子，即无菌棉拭子用生理盐水湿润后，插入肛门内 4-5cm 处儿童约 2-3cm），同一方向轻轻旋转 2-3周。以目测能见到粪便为准。插入 Cary-Blair 运送培养基。5.4 标本采集后立即送至实验室进行检测，若室温保存，不能超过 1h；如不能立即送检，应放入 Cary-Blair 运送培养基中冷藏条件下 24 小时内送检。六、检验程序 七、操作步骤 生化符合者做血清凝集可疑菌落接种 TSI 和生化符合者做血清凝7.1 分别标记一个 XLD 平板（或 YS 平板、麦康凯平板）和 1 管 9ml 改良亚硒酸盐磺绿增菌肉汤（SBG）（或 SF 增菌液或沙门志贺培养液）。7.2 用 1 个无菌拭子取少量标本（不要使拭子粘得太多，尽量从可见血或黏液的部位收集）接种在 XLD 平板的第一区，接着把拭子放入 SBG 增菌液。再灭菌接种环在 XLD 平板的其余区进行划线接种。如果是 Cary-Blair 运送培养基的粪便拭子，则轻搅混合标本后接种增菌液与平板。7.3 所有培养基均放入 361培养，SBG 的最佳增菌时间是 1618h（建议每天下午45 时接种标本，第二天早上 810 时用增菌液划平板）。7.4 观察平板：取培养后的平板，观察有无可疑菌落。7.4.1XLD 平板可疑菌落观察：志贺菌在 XLD 平板上为粉红或无色、透明、光滑、湿润、边缘整齐、圆形菌落，直径 1-2mm，而大部分的大肠杆菌类的菌落为黄色、混浊、凸起、湿润、边缘整齐或不规则，直径 2-3mm。大多数沙门菌在 XLD 平板上中心黑色的透明、光滑、湿润、边缘整齐、圆形的菌落。（图 2）7.4.YS 平板可疑菌落观察：7.4.麦康凯平板可疑菌落观察：志贺菌在麦康凯平板上为无色至浅粉色、半透明、光滑、湿润、边缘整齐或不规则、圆形菌落，直径 2-3mm；大多数沙门菌为无色菌落，粉红色，带或不带黑心，伤寒沙门菌为无色菌落；而大部分的大肠杆菌类的菌落为粉红或红色、混浊、凸起、湿润、边缘整齐或不规则，直径 3-4mm。7.4.SBG 肉汤增菌：SBG 增菌 1618 小时后，划线接种 XLE 平板或沙门显色平板，放入 361培养 1824h。沙门显色平板可疑菌落观察：典型的沙门菌在沙门显色平板上为紫色的菌落，直径 2-3mm。7.4.4 建议的初步筛查方案（初步生化特征见表 1）：表 沙门菌、伤寒沙门菌、志贺菌及常见肠道菌的初步生化特征 大部分 沙门菌 伤寒沙门菌 志贺氏菌 大肠杆菌 枸橼酸杆菌 变形杆菌 TSI（斜面）K（红色）K（红色）K（红色）A（黄色）A（黄色）K（红色）TSI（底面）A（黄色）A（黄色）A（黄色）A（黄色）A（黄色）A（黄色）TSI（H2S）+（黑色）小部分-+（黑色）+（黑色）TSI（产气）+（气泡）-+（气泡）+（气泡）+（气泡）MIU（动+（弥漫+（弥漫-（沿接+（弥漫+（弥漫+（弥漫 力）生长）生长）种线生长）生长）生长）生长）MIU（吲哚）-（黄色 圆环）-（黄色 圆环）-（黄色 圆环）+（加试剂变红色）+（加试剂变红色）-（黄色 圆环）MIU（尿素）-（黄色）-（黄色）-（黄色）-（黄色）-（黄色）+（红色）A：粪便（或肛拭子）SBG 或 SF 增菌 XLD 分离 接种 TSI 和 MIU B：粪便（或肛拭子）SBG 或 SF 增菌 YS 分离 接种 TSI 和 MIU C：粪便（或肛拭子）SBG 或 SF 增菌 XLD 和麦康凯分离 接种 TSI 和 MIU D：粪便（或肛拭子）SBG 或 SF 增菌 YS 和沙门显色分离 接种 TSI 和 MIU E：粪便（或肛拭子）SBG 或 SF 增菌 XLD 和沙门显色分离 接种 TSI 和 MIU 7.5 生化初步鉴定 每个平板挑取35 个分离较好的单个可疑菌落，分别接种到三糖铁（TSI）和动力-吲哚-尿素培养基（MIU），361培养 1824h。沙门菌和志贺菌的生化特征见表2。7.6 系统生化试验 沙门菌和志贺菌初步鉴定阳性菌经转种营养琼脂单，取单个菌落进行系统生化鉴定（可以使用 APE20E 或全自动生化鉴定系统进行）。7.7 血清学试验 7.7.1 志贺菌血清学试验 7.7.1.1 挑取生化反应实筛符合志贺菌的营养琼脂斜面，首先用四种多价血清做玻片凝集反应(4 种多价包括：A 群 1、2 型；B 群和 D 群)。凝集者则用 B 群多价、D 群和A1、A2、血清分别凝集。7.7.1.2 若多价血清不凝集，可能为 C 群或 A 群的 312 型，应进行 C 群的四种多价和 A 群另三种多价血清做玻片凝集。7.7.2 沙门菌血清学试验 7.7.2.1 挑取生化反应实筛符合沙门菌的营养琼脂斜面，首先用 A-F 群 O 多价血清做玻片凝集反应。7.7.2.2 若凝集可按常见 O 因子检出频率，按照 O4O10O9O7O8O19O2O11 顺序凝集。7.7.2.3H 抗原凝集 7.7.3 所有凝集阳性的菌落，都要同时用生理盐水做凝集试验，只有不出现自凝时，才可以报告阳性结果。8 结果报告 8.1 在初步生化鉴定符合后，可以先将可疑菌落进行革兰氏染色，最后综合生化及血清学结果，可以报告检出（或未检出）沙门菌（或志贺菌）。8.2 对于从业人员体检结果已经纳入检验软件管理的单位，可以直接在检验软件中录入相应结果。8.3 其他单位可以设计专门的报告格式反馈给送检单位或送检科室，检验报告中应至少包括姓名，性别，年龄，体检编号，检测结果。8.4 检测结果为阴性，可以报告为未检出肠道沙门菌和志贺菌；检测结果为阳性，根据检测情况报告具体的型别。8.5 检验部门应该保留所有受检样品的基本信息，检测到阳性标本，应该保存详细的检测记录，根据需要提供给送检单位或科室，以及上级业务单位。9 菌株的保存 对于生化及血清学结果符合沙门菌或志贺菌的菌株用磁珠保存管保存菌种，放入-或-保存，按照相关要求上送菌株。