苹果糖转运蛋白TMT基因的表达及其与糖积累的关系

http: / www. ahs. ac. cn E-mail: yuanyixuebao园艺学报 2014, 41 （7）： 1317-1325 Acta Horticulturae Sinica苹果糖转运蛋白TMT基因的表达及其与糖积累 的关系马新立，秦 源，魏晓钰，马锋旺，李明军*（西北农林科技大学园艺学院，陕西杨凌712100）摘要：利用苹果基因组筛选液泡膜单糖转运蛋白TMT家族基因，通过qRT-PCR探索它们在苹果各 器官组织中的表达特性，并分析其表达与果实糖积累的关系。结果表明，在苹果中主要存在5个TMT家 族基因，均含有11个跨膜区，并具有1个长约330氨基酸的亲水l oop区位于胞质内，它们与拟南芥和葡 萄的TMTs高度同源。定量表达分析发现，它们均在苹果中表达，且MdTMTl表达量相对最高，MdTMT3 和MdTMT4表达量较低。MdTMTl在花和成熟果实中表达量最高，MdTMT2在成熟果实中表达最高。在 果实发育过程中，MdTMTl和MdTMT2的表达量与果实中总糖、还原性总糖、果糖、蔗糖含量呈极显著 正相关，说明MdTMTl和MdTMT2可能参与了苹果果实成熟期果糖和蔗糖的积累。关键词：苹果；液泡单糖转运蛋白；表达；糖；果实中图分类号：S 661.1文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）07-1317-09Sequence and Expression Analysis of Apple Tonoplast Monosaccharide Transporter TMT Genes and Their Relationship with Sugar Accumulation in FruitMA Xin-li， QIN Yuan，WEI Xiao-yu， MA Feng-wang， and LI Ming-jun*（College of Horticulture， Northwest A & F University，Yangling, Shaanxi 712100，China）Abstract： In present study， we analyzed the information of apple tonoplast monosaccharide transporter （TMT）gene family based on Malus genome database， and explored their expression characteristics by qRT-PCR and analyzed the relationship between their expression and sugar accumulation in apple. The results showed that apple had 5 transcribed MdTMT genes with 11 transmembrane domains and a hydrophilic loop located in the cytoplasm. These MdTMTs are highly homologous with Arabidopsis thaliana and Vitis vinifera TMTs. Quantitative expression analysis showed that all MdTMTs were expressed in apple with a higher expression abundance of MdTMT1 and lower expression abundance ofMdTMT3 and MdTMT4. MdTMT1 had the highest expression abundance in flower and fruit while MdTMT2 in fruit. The expression of MdTMT1 and MdTMT2 had significantly positive correlation with total sugar， reducing sugar，fructose and sucrose during fruit development，especiallyMdTMT2 . These resultssuggested that MdTMT1 andMdTMT2 may participate in the accumulation of fructose and sucrose in the收稿日期：2014-03-05；修回日期：2014-06-02基金项目：国家自然科学基金项目（31372038）* 通信作者 Author for correspondence （E-mail： limingjun）fructescence of apple.Key words: Malus x domestica； tonoplast monosaccharide transporter； expression； sugar； fruit果实中糖的种类及其比例直接关系到果实的甜度与风味，果实中的糖虽依赖于源叶的输入，但 控制糖分积累的关键步骤是位于发育的果实内部，而不是源叶输出光合产物的能力或者韧皮部运输 的效率（Ruan & Patrick，1995）。库细胞中韧皮部运输效率、糖的跨膜运输能力、糖代谢酶的种类 与活性等因素决定了果实糖分的积累（Ruan & Patrick， 1995； Rolland et al.，2006）。液泡是果实细 胞中糖的主要积累场所，占成熟果实细胞体积的80%以上，液泡中糖的积累能力受定位于液泡膜的 糖转运蛋白的高度调控（Yamaki & Ino， 1992； Wormit et al.，2006）。目前己鉴定的液泡膜糖转运蛋 白主要有参与葡萄糖转运的液泡葡萄糖转运蛋白（vGT）（Wingenter et al.，2010）和液泡膜单糖转 运蛋白（TMT）（Wormit et al.，2006）亚家族。其中vGT1对葡萄糖有着高度特异性，其主要在拟 南芥花粉中表达，参与种子发芽和花的发育（Wingenter et al.，2010）。对拟南芥TMT的研究发现， 拟南芥AtTMT 1不仅对葡萄糖有着高的转运能力，对果糖也有一定的选择性（Wingenter et al.，2010）， 同时拟南芥AtTMT1也可作为蔗糖的逆向转运蛋白，转运蔗糖进入液泡（Schulz et al.，2011）。拟南 芥AtTMTl、AtTMT2的敲除能明显降低蔗糖、葡萄糖和果糖在液泡中的积累（Wingenter et al.，2010； Schulz et al.，2011）。葡萄vTMTl在果实中有较高的表达，并在果实发育过程中与葡萄糖和果糖含 量明显相关（Afoufa-Bastien et al.，2010）。苹果与葡萄、香蕉（果糖和葡萄糖含量比值接近1）等 相比，其果实中积累的糖主要是果糖（约占可溶性总糖的60%），其次是蔗糖（约20%）和葡萄糖（约10%）（魏建梅 等，2009）。目前对于苹果液泡定位糖转运蛋白尚无报道，是否苹果TMT基因 对果糖（蔗糖）有着更强的亲和力，尚不清楚。本研究中利用同源分析法从苹果基因组中筛选出苹 果TMT基因，分析它们的序列特性和启动子区顺式作用元件，研究它们在苹果不同组织中的表达 水平及其在果实发育过程中与糖积累的关系，为进一步系统了解苹果TMT基因的基本特性，研究 苹果糖的积累机制奠定基础。1材料与方法1.1材料供试材料为西北农林科技大学北园艺场5年生嘎啦苹果（Malus x domestica Borkh.Gala）， 砧木为新疆野苹果（M. sieversii）。2012年4月（花期）选取12株长势基本一致的树进行疏花，使 每株树的坐果量基本一致。于全园70%花瓣脱落时采取每株树外围阳面花瓣刚脱落的幼果，记为果 实发育的0d，此后每15 d左右（选取晴天）为1个采样时间段，直到果实成熟（约花后120 d）。 每次采样时间为16： 0017： 00。将来自3株不同树上的果实（至少9个）称量切碎混合作为1个 重复，共4个重复。另分别采刚开放的花朵、花后30 d的成熟叶片、茎尖和根。样品采后立即用液 氮速冻后存于-70 C冰箱备用。1.2苹果TMT基因的筛选在苹果基因组数据库（http： /genomics.research.iasma.it/blast/blast.html）中（Velasco et al.，2010）， 分别以拟南芥TMT1、TMT2和TMT3为模板分别对apple gene set进行Blastp搜索，搜索结果中E-Value 大于 1.00E-4的预测基因序列从数据库（http: /genomics.research.iasma.it/gb2/gbrowse/apple/）获得。 为进一步证实它是TMT家族的基因，对于长度大于1 400 bp的序列（已报道的完整 TMT最大开放阅读框均在2 100 bp以上，其它报道的糖转运蛋白也在1 400 bp以上），以其为模板在GenBank中 进行Blast，把与葡萄、水稻、拟南芥的TMT高度同源的基因确立为候选基因（5个）。在Chr. 5上 的MDP0000162377与葡萄 TMT3的两端跨膜区存在高度的同源性，但中间序列差异较大，尤其该 基因中间缺少1个长的亲水l oop，与TMT亚家族不符。为进一步确定这些预测序列的可靠性和表 达与否，分别以其为模板，对苹果EST数据库进行Blast搜索。对于具有高度同源EST（score 300 bp，identity 98%）的候选基因确认为在苹果转录组中表达的基因（虽 MdTMT5无EST序列，但 从苹果果实中扩增出了它的部分序列）。同时，把EST与相应的基因进行多重比较分析，对于在剪 切模式上存在差异的，再次以EST的拼接序列或EST为模板，在苹果基因组中对all gene set进行 Blastp搜索，以与EST完全一致的预测序列为新的候选基因。对于存在多个可能剪切方式的候选基 因，将其分别在GenBank中进行Blast，选取与已知TMT基因同源性最高的为待分析基因。通过筛 选，获得5个待分析的苹果TMT候选基因（表1）。1.3序列同源性、进化树、跨膜结构及启动子序列分析利用Lasergene软件（DNASTAR，USA）中。lustal V多重比较分析氨基酸序列的同源性；苹 果MdTMT与拟南芥和葡萄TMT基因的进化分析采用最大可能性法，利用http:/www.phylogeny.fr website （Dereeper et al.，2008）网站进行分析；MdTMTs 的跨膜结构采用HMMTOP法分析（http： / www.enzim.hu/hmmtop/），跨膜模型利用TMRPRES2d软件构建。1.4 TMT基因定量表达分析采用Gasic等（2004）改良C TAB-LiCl法提取苹果不同样品中的总RNA。总RNA经D Nase清 除DNA后，利用PrimescriptTM RT reagent Kit（TaKaRa）进行反转录，合成的cDNA第一链用于实 时荧光定量PCR分析5个TMT基因的表达情况。定量PCR仪为BIORAD公司IQ5型，反应试剂 为SYBR Premix ExTaqTM（TaKaRa）。”为内参基因，不同样品得到的数据经内参基因均一化 处理后，通过2-AACT法计算出待测基因相对表达量。实时荧光定量PCR分析引物见表1，其特异性 经RT-PCR、测序及溶解曲线分析鉴定。表1用于qRT-PCR分析的引物序列Table 1 Oligonucleotide sequences for primers used in qRT-PCR基因 Gene 正向序列 Forward sequence（53，）反向序列 Reverse sequence（53，）MdTMTlTCGTCTATTTCTGCGTCTTTGTC CCGCTGCGTAAATCCCAAATMdTMT2GTACCGAACGATGGTCAGTTCTTC TGACTCCGGGTTCGAAAAGGTCMdTMT3GCACCGAACGACAGTGAGTTCATT TCACTCCAGGTTCAAAAAGATCMdTMT4AGGCCTTAGTTCCACCTCTTCATCT CGGTAATGTAGTCAGCAACAGCGMdTMT5CGAAGACGGAAAGAATGAAGGAG CCAGAGCAGCAGCATGAATGAGTActinTGGACAGCGAGGACATTCAGC CTGACCCATTCCAACCATAACA1.5碳水化合物的测定可溶性糖的提取参考李合生等（2000）的方法，总可溶性糖含量用蒽酮比色法，还原糖含量测 定用3,5-二硝基水杨酸法。蔗糖、葡萄糖、果糖和山梨醇含量测定采用GC-MS技术，参考Lisec 等（2006）的方法：提取的可溶性糖干燥后加入40叫5 mg - mL-1的甲氧基胺盐酸盐后，37 C、950 r - min-1培养2 h，再加入60 pL N-甲基-N-（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（MSTFA）培养30 min。 后转到上样瓶中上机检测（岛津GC-MS-QP2010 SE）。将提取可溶性糖后的沉淀用高氯酸法提取后，采用蒽酮比色法测定620 nm下的吸光值（李合生等，2000），根据葡萄糖标准曲线计算样品中的淀粉含量（高氯酸水解淀粉后生成葡萄糖）。糖含量数据统计运用SPSS 16.0进行统计和相关分析，采用o ne-way ANOVA方法对每个变量进 行Duncan检验（P MdTMT2 MdTMT3 MdTMT4 MdTMTl MdTMT2成熟叶幼叶MatureYoungleafleaf图3 嘎啦苹果不同组织中MdTMT家族基因的相对表达量 以成熟叶片中MdTMT5的相对表达量为10。s*:-!wvll.：Fig. 3 The relative expression abundance of MdTMT families among different tissues of Gala appleMdTMT5 expression in mature leaves was designated as 10.MdTMT5；幼叶中初疗沮 MdTMT2 MdTMT5 MdTMT4 MdTMT3； 花中MdTMTl MdTMT2 MdTMT3 MdTMT5 MdTMT4；幼果中 MdTMTl MdTMT5 MdTMT3 MdTMT4 MdTMT2；成熟 果中 MdTMTl MdTMT2 MdTMT4 MdTMT3 MdTMT5；根中 MdTMTl MdTMT2 MdTMT3 MdTMT4 MdTMT5。在不同组织中，MdTMT表达的变化模式，MdTMTl是花 成熟果 幼果 根 成熟叶 幼叶；MdTMT2是成熟果 花 幼果 根 幼叶 成熟叶；MdTMT3是花 幼果 根 成熟果 幼叶 成熟叶；MdTMT4是幼果 花 成熟果 幼叶 根 成熟 叶；MdTMT5是幼果 花 幼叶 根 成熟果 成熟叶。2.3苹果果实发育过程中的糖积累与MdTMTs表达的关系MdTMTl的表达从花后030 d无明显变化，在45 d有轻微增加，之后在花后60 d显著增加， 是花后0d的近4倍，在花后75 d达到最高峰后至果实成熟表现出轻微的下降趋势（图4）。MdTMT2 表现出与MdTMTl相似的变化趋势和幅度，不同点在于MdTMT2在花后4575 d呈线性增加趋势， 之后至果实成熟无明显变化。MdTMT3在幼果期有着较高的表达丰度，花后60 d表现出显著下调， 之后至果实成熟无明显变化。MdTMT4在果实发育过程中表达量变化较小，在花后15 d和30 d的 幼果中最高，其次是花后0 d和45 d，在花后60 d至成熟期无明显变化。MdTMT5在花后显著上调， 花后15 d与0 d相比增加了 3.6倍，并在花后30 d达到最高峰（花后0d的4.1倍），之后开始快速 下调，在花后75122 d维持较低水平（图4）。图4 嘎啦苹果果实发育过程中MdTMT相对表达量的变化每个基因分别以花后0d相对表达量为10。Fig. 4 Changes of relative expression abundance of MdTMT during fruit development of Gala apple The expression in 0 DAA-fruit was designated as 10.在嘎啦苹果果实发育过程中，淀粉含量在花后开始稳定增加，在花后60 d和75 d间达到 最高值，之后显著下降，在花后105 d后下降到75 d的近1/5。花后030 d可溶性总糖和还原糖含 量的变化不大，30 d后可溶性总糖开始直线增加，至果实成熟比花后30 d增加3.4倍。还原糖含量 在花后45 d后也开始明显稳步增加，在果实成熟期达到花后45 d的2.2倍（图5）。在单体糖中， 果糖在苹果花后连续性增加，尤其花后45 d后增加幅度更大，并在105 d达到最大，与花后0d相 比增加了 3.2倍；葡萄糖在苹果果实发育过程中变化不大，在花后15 d和30 d相对较高；蔗糖在花 后开始连续增加，在花后105 d果实成熟后基本保持不变；山梨醇含量在整个果实发育过程中基本 维持在一个较低的水平，含量没有明显变化（图5）。图5 嘎啦苹果果实发育过程中碳水化合物含量的变化Fig. 5 Changes of carbohydrate concentration during fruit development of Gala apple相关性分析（表3）表明，在苹果果实发育过程中，MdTMTl和MdTMT2的表达水平与果实中 生物总糖、还原糖、果糖和蔗糖含量呈极显著正相关，且dTMT2的相关性高于MdTMTl； MdTMT4 和MdTMT5与这些指标呈显著负相关。这表明MdTMTl和MdTMT2在苹果果实糖积累中可能有较 为重要的作用。表3苹果果实发育过程中MdTMT相对表达量与糖的相关系数Table 3 Correlation coefficient between relative expression abundance ofMdTMT and sugar concentrationduring fruit development of apple基因淀粉总糖还原糖果糖葡萄糖蔗糖山梨醇GeneStarchTotal soluble sugarReducing sugarFruGluSucSorMdTMTl0.061 0.837* 0.885* 0.886* 0.014 0.874* -0.696*MdTMT2-0.196 0.921* 0.957* 0.936* 0.166 0.918* -0.771*MdTMT30.166 -0.470 -0.486 -0.483 0.499 -0.417 0.085MdTMT40.213 -0.838* -0.872* -0.889* 0.196 -0.831* 0.560MdTMT50.238 -0.729* -0.761* -0.766* 0.340 -0.700* 0.376*表示相关性达到0.01显著水平；*表示相关性达到0.05显著水平。* Correlation is significant at the 0.01 level. * Correlation is significant at the 0.05 level.3讨论TMT作为植物糖转运蛋白的1个亚家族，定位于液泡膜，负责将糖从胞质转运进入液泡膜。以 拟南芥的TMT为模板，在苹果基因组中发现了18个预测基因，但对这些基因的跨膜区进行分析发 现，除本研究中筛选的这5个基因之外，其它的跨膜区均小于6,且氨基酸序列小于450氨基酸， 与报道的拟南芥（Wormit et al.，2006）、葡萄（Afoufa-Bastien et al.，2010）等植物预测的TMT跨 膜区为11，氨基酸长度大于700不一致。同时通过苹果EST库的检索发现，本研究中筛选的这5 个MdTMT中有4个（除MdTMT5外）存在序列一致的EST序列，表明它们是在苹果中转录的TMT 基因。在这5个 MdTMT中，MdTMTl与AtTMTl和VvTMTl高度同源，MdTMT2和MdTMT3高度 相似，且与AtTMT2 和 VvTMT2 同源，而MdTMT4 和 MdTMT5 与 AtTMT3 和 VvTMT3 同源。AtTMTl 和AtTMT2在拟南芥中表达丰度较高，尤其在花粉中表达最高(Wormit et al., 2006)，它们是液泡 膜上负责糖转运的关键蛋白，在拟南芥中主要负责葡萄糖(Wormit et al.，2006)、蔗糖(Schulz et al.， 2011)等在液泡中的积累，它不仅与正常条件下这些糖在液泡中的积累有关，而且参与了低温、干 旱等逆境条件下胞内糖的分配和积累(Wormit et al.，2006)VvTMTl和VvTMT2也主要在葡萄的果 实中高度表达，与果实发育过程中糖的积累正相关(Afoufa-Bastien et al.，2010)，同时Conde等(2006) 报道葡萄愈伤组织中VvTMTl的表达受外源葡萄糖的诱导。本研究表明，苹果MdTMT基因中， MdTMTl的表达丰度最高，其次是MdTMT2,二者不仅在果实中高度表达且表达与果实糖的积累极 显著正相关，这表明MdTMTl和MdTMT2可能与果实糖的积累有关。然而与MdTMT2同源性高达 90.6%的MdTMT3的表达却与苹果果实糖的积累负相关，这表明在苹果中MdTMT3可能起着不同于 MdTMT2的功能。与拟南芥AtTMT3相似，MdTMT4和MdTMT5在苹果中的表达丰度较低，在各个 组织中均有表达，在果实糖积累中不起关键调控功能。魏建梅等(2009)在金冠苹果中的报道，嘎啦苹果果实中果糖和蔗糖的积累主要发生 在成熟期，而葡萄糖含量在幼果期有一个明显的大量积累，之后果实发育过程中其含量基本保持不 变。在苹果中，幼果期葡萄糖主要依赖于蔗糖的裂解，果糖依赖于蔗糖的裂解和山梨醇的氧化脱氢， 理论葡萄糖和果糖的浓度比值小于1：4 (苹果中运输的糖主要是山梨醇，它是蔗糖的3倍之多。1 分子山梨醇生成1分子果糖，1分子蔗糖能生成1分子果糖和1分子的葡萄糖与UDPG)(Chourey & Beruter，1985)，但幼果期葡萄糖的积累效率明显高于果糖。在成熟期，淀粉和细胞壁纤维素的裂 解产物均是葡萄糖，与幼果相比，葡萄糖和果糖的理论比值增加，但果糖在液泡中的积累主要发生 在成熟期(Yamaki & Ino, 1992)。因此，葡萄糖和果糖向液泡的转运过程中不可能是用共同的转运 蛋白。此外，苹果果糖在果实液泡中的积累与葡萄糖并不同步，而与蔗糖同步，在苹果成熟期有较 强转运果糖和蔗糖进入液泡的能力。果糖的大量积累有两种可能性，一种是苹果拥有的TMT同源基 因中有对果糖高度专一的，它与转运葡萄糖的TMTs在表达上有着不同的时空差异；另一种可能性 是存在TMT之外的对果糖专一的其它基因。本试验中，在果实中高度表达的MdTMTl和MdTMT2 的表达丰度与果实果糖和蔗糖含量显著正相关，表明二者可能参与了果糖和蔗糖的积累，具有运输 二者的可能性；而MdTMT3主要在果实发育前期表达，与葡萄糖的积累趋势相符，暗示着其可能与 葡萄糖转运与积累有关。苹果果实中大量积累果糖，而果糖的含量是影响果实甜度和风味的重要因素之一，找到苹果中 对果糖特异的糖转运蛋白具有十分重要的意义。本试验结果暗示在苹果中MdTMTl和MdTMT2可 能对果糖和蔗糖有较高的底物亲和性，主要负责果实成熟期糖在液泡中的积累，其功能的进一步研 究将为苹果等果实糖相关品质形成奠定基础，这不仅对于认识果实中糖的积累转运机制，理解苹果 等果实高果糖含量有重要的理论意义，而且对于通过生物技术和栽培措施改良植物糖的积累水平， 进而提高果实品质具有潜在的应用价值。ReferencesAfoufa-Bastien D， Medici A， Jeauffre J，Coutos-Thevenot P， Lemoine R， Atanassova R， Laloi M. 2010. 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