临床色谱质谱检验技术：色谱质谱技术的其他常见应用（一）

第六章 色谱质谱技术的其他常见应用2016.05.03临床色谱质谱检验技术本章教学要求色谱技术在临床实验室中的应用临床色谱质谱检验技术主要内容小结与思考目的回顾之前所学色谱质谱知识，与实践相结合；熟悉和了解色谱质谱技术在临床实验室中的其他常见应用情况。第六章教学要求第六章教学要求目标熟悉：电感耦合等离子体质谱技术应用于元素分析 三重四级杆技术应用于遗传代谢性疾病检测了解：高效液相色谱技术应用于氨基酸检测 液相色谱技术应用于血药浓度检测 毛细管电泳技术应用与地中海贫血检测 基质辅助激光解析-飞行时间质谱技术应用于微生物鉴定 第六章教学要求教学形式及学时教学形成：理论教学学时：3高效液相色谱技术应用于氨基酸检测电感耦合等离子体质谱技术应用于元素分析三重四级杆技术应用于遗传代谢性疾病检测临床色谱质谱检验技术色谱技术在临床实验室中的应用回顾什么是色谱分析？色谱分析的分类有哪些？常见样品制备技术有哪些？色谱分析 色谱分析是一种分离技术色谱分析的主要目的是对混合物中的目标物进行分离和定量气相色谱液相色谱 回顾气相色谱仪器的构成五个基本组成系统：气路系统、进样系统、分离系统、检测系统和数据处理系统。气相色谱仪器的构成液相色谱仪器的构成五个基本组成系统：高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和数据处理系统。液相色谱仪器的构成高效输液系统进样系统分离系统检测系统样品制备技术常见样品制备技术 液液萃取稀释固相萃取离心过滤蛋白沉淀衍生化方法学验证的内容方法验证准确度精密度线性范围可报告范围基质效应基质特异性稳定性干扰验证携带效应色谱技术在临床实验室中的应用除了气相色谱质谱联用技术、液相色谱质谱联用技术之外，色谱技术在临床上还有其他的常见应用。液相色谱技术应用于氨基酸检测液相色谱技术应用于血药浓度检测高效毛细管电泳技术应用于地中海贫血检测色谱技术在临床实验室中的应用样品处理方法建立色谱方法建立信息及文献检索样品采集样品制备数据处理分析测定氨基酸：是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质。氨基酸含有一个碱性氨基和一个酸性羧基，氨基一般连在-碳上。组成蛋白质的20种氨基酸除甘氨酸外，都有一个不对称碳原子，即-碳原子。信息及文献检索-碳原子有四个不同取代基：氨基、羧基、氢原子和R基团，不同氨基酸的R基团不同。每种氨基酸有D-构型和L-构型，天然蛋白质中的氨基酸都是L-构型。信息及文献检索氨基酸在溶液中受溶液pH的影响存在着下列平衡：pHpI偶极离子净电荷为零在电场中不移动，此时溶液的pH值称为等电点（pI）信息及文献检索分析测定方法样品制备包括采集、离心、存储和除蛋白。采集：确保被试者没有服用任何影响氨基酸测定的药物，同时采血在早晨空腹的情况下进行，以免饮食因素对结果产生影响。离心和存储：采集后的标本，应尽快离心，离心后放在低于-18的条件下存储。（为了防止蛋白水解，离心之后不宜立即除去蛋白）除蛋白：常见有酸沉淀、有机溶液沉淀、超滤、高速离心和透析等。样品制备除蛋白：酸沉淀：主要使用磺基水杨酸（SSA）沉淀蛋白有机溶液沉淀超滤和高速离心透析样品制备蛋白质和多肽中氨基酸的分析：酸水解 较多采用盐酸水解（6mol/L HCL，110，2024h），加入保护剂，减少氨基酸的损失（天冬酰胺和谷氨酰胺变成天冬氨酸和谷氨酸，半胱氨酸变成为胱氨酸）碱水解 多用于色氨酸的测定，主要使用氢氧化钠或氢氧化钾酶水解 用于化学水解敏感的氨基酸的测定，如天冬酰胺和谷氨酰胺，需较长的反应时间微波消解样品制备衍生化离子交换色谱法衍生化离子交换色谱法（柱后衍生）分析原理：基于阳离子交换树脂分离-柱后茚三酮衍生化分光光度检测方法。所有的氨基酸在低pH值的条件下（pH为2.2）都带有正电荷，在阳离子交换树脂上均被吸附。其中吸附程度：碱性氨基酸结合力最强、其次为芳香族氨基酸、中性氨基酸、酸性氨基酸结合力最弱。被洗脱下来的氨基酸与茚三酮反应液在加热的条件下反应。天冬氨酸的pI值为2.98衍生化离子交换色谱法茚三酮反应原理 脯氨酸与茚三酮反应：波长440nm检测其它氨基酸与茚三酮反应：波长570nm检测NOO-+OOOHOH+NCOOHHOOOHOH+RCHCOOHNH2OHHOO+RCHO+CO2+NH3OOOHOHOHOOHOOON+NH3+O-衍生化离子交换色谱法茚三酮+伯胺型氨基酸兰紫色化合物+仲胺型氨基酸CHRNH2CO O HNH3CO2RCHOOOHOHOOOHOHOOOONOOHHONH3OOOHOHHNC O O HOONOOO HO H伯胺型仲胺型茚三酮还原形茚三酮兰紫色化合物黄绿色化合物黄绿色化合物衍生化离子交换色谱法衍生化高效液相色谱法(柱前衍生)柱前衍生化高效液相色谱法分析氨基酸具有分析时间较短、方法灵活多样、灵敏度高的优点，已经逐渐取代衍生化离子交换色谱法在许多领域中的应用。柱前衍生化高效液相色谱法一般采用C18键合硅胶为固定相、极性溶剂/弱酸盐缓冲液为流动相。HPLC中广泛使用的衍生化试剂主要有邻苯二甲醛（OPA）、9-芴基甲氧基羰酰氯（FMOC）、异硫氰酸苯酯（PITC）、6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯（AQC）、二甲氨基奈磺酰氯（dansyl-Cl）、2，4-二硝基氟苯（FDNB）、等。衍生化高效液相色谱法方法邻苯二醛（OPA）和9-芴甲基氯甲酸甲酯（FMOC）法异硫氰酸苯酯（PITC）法、6-氨基喹啉N羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯（AQC）法衍生方式柱前柱前柱前衍生化条件30s室温1h55水浴10min色谱柱C18C18C18检测器激发波长340nm，发射波长450nm（伯胺），激发波长260nm，发射波长305nm（仲胺）紫外检测器254nm激发波长235nm，发射波长395nm评价线性范围广，可实现衍生化自动化同时测定伯氨酸和仲氨酸；衍生物稳定；衍生化时间长，条件要求高同时测定伯氨酸和仲氨酸；灵敏度高，但线性范围窄衍生化高效液相色谱法反应原理OPA衍生化方法：试剂不发荧光，不会干扰测定；不能和仲氨酸（脯氨酸）反应；与胱氨酸的衍生物产生的荧光强度较低且不稳定。FMOC衍生化方法：能与仲氨酸反应；衍生副产物干扰测定；需用戊烷将反应多余的衍生化试剂萃取出衍生化高效液相色谱法OPA-FMOC（邻苯二甲醛-9-芴基甲氧基羰酰氯）法：1、样品处理：取血浆样品1.00mL，加入4倍于样品体积的无水乙醇，在旋转混合器上充分混合，置4冰箱中30min，然后于0和15000r/min条件下离心20min，取上清液用0.45m微孔滤膜过滤，滤液用于氨基酸的分析；2、柱前衍生：使用pH=10.5硼酸盐缓冲液加上OPA和FMOC，常温下衍生；3、色谱条件：Hypersil ODS色谱柱，4.0125mm，5m；流动相（A）：10mmol/LNa2HPO4-NaH2PO4，pH=7.2缓冲液（PB），含0.5%四氢呋喃（THF）；流动相（B）：PB-甲醇-乙腈（体积比50：35：15）；流速：1.0mL/min；梯度洗脱；柱温40；检测波长：0min时，激发波长340nm，发射波长450nm，检测一级氨基酸（伯胺）的OPA衍生物；20.5min后，将波长切换至激发波长260nm，发射波长305nm，检测二级氨基酸（仲胺）的FMOC衍生物。衍生化高效液相色谱法PITC（异硫氰酸苯酯）法：1、样品采集与处理：由前臂静脉取血1.0mL，血样取出后放置15min，以4000r/min离心10min，分离血清，置于-20冰箱中冷冻保存。血清样品在室温解冻后，取出200L，加入乙腈400L，涡旋30s，以12000r/min离心10min，取上清液移置另一试管中，于60下用氮气吹干溶剂，残留物加入100L水复溶，备用。2、柱前衍生：使用三乙胺乙腈溶液加上PITC和正己烷，常温1h衍生；3、色谱条件：Shim-pack VP-ODS，4.6250mm，5m；流动相（A）：甲醇-乙腈-水（体积比1：3：1）；流动相（B）：0.1mol/L醋酸缓冲盐；流速：1.0mL/min；梯度洗脱；柱温35。检测波长：254nm。衍生化高效液相色谱法AQC（6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯）法：1、样品处理：从-80冰箱内取出样本后，在室温解冻，取出200L，加入400L乙腈萃取，涡旋30s，静置10min，4和12000r/min离心15min，取上清液置Ep管中，40氮气吹干，加水200L复溶后，涡旋30s，备用。2、柱前衍生：使用pH=8.8硼酸缓冲液加上AQC试剂，55水浴加热10min衍生；3、色谱条件：Inertsil C18，4.6250mm，5m；流动相（A）：甲醇-乙腈-水（体积比1：3：1）；流动相（B）：0.1mol/L醋酸缓冲盐；流速：1.0mL/min；梯度洗脱；柱温35；检测波长：激发波长235nm，发射波长395nm。衍生化高效液相色谱法临床色谱质谱检验技术小结与思考了解高效液相色谱技术应用于氨基酸检测了解衍生化离子交换色谱法中，氨基酸与茚三酮反应原理