医学分子生物学：转录组学

TranscriptomicsTranscriptomics转录组学转录组学转录产物n信使信使RNA（mRNA，messenger RNA）n非编码非编码RNA（Non-coding RNA）n核糖体核糖体RNA（rRNA，ribosomal RNA）n转移转移RNA（tRNA，transfer RNA）n非信使小非信使小RNA（snmRNA，small non-messenger RNA)n微小微小RNA（microRNA）n小干扰小干扰RNA（siRNA，small interferring RNA)n核仁小核仁小RNA（snoRNA，small nucleolar RNA)n核内小核内小RNA（snRNA，small nuclear RNA)n胞质内小胞质内小RNA（scRNA，small cytoplasmic RNA）npiwi互作互作RNA（piRNA，piwi-interacting RNA）n长非编码长非编码RNA（lncRNA，long non-coding RNA）转录组（转录组（transcriptome）指特定状态下一种细胞或组织所能指特定状态下一种细胞或组织所能转录出来的所有转录出来的所有RNA的总和。的总和。包括编码包括编码RNA，即，即mRNA和非编码和非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)转录组学（转录组学（transcriptomics）：）：是在整体水平上研究细胞编是在整体水平上研究细胞编码基因转录情况及转录调控规律的科学。研究全部码基因转录情况及转录调控规律的科学。研究全部RNA的表的表达及功能。达及功能。RNA组学（组学（RNomics）：）：是分析、鉴定是分析、鉴定非信使小非信使小RNA（small non-messenger RNA,snmRNA）在特定状态下表达）在特定状态下表达情况、功能及其与蛋白质的相互作用。情况、功能及其与蛋白质的相互作用。n转录组的特点：转录组的特点：受到内外多种因素的调节，受到内外多种因素的调节，因而是因而是动态可变动态可变的。能够揭示不同物种、不的。能够揭示不同物种、不同个体、不同细胞、不同发育阶段及不同生同个体、不同细胞、不同发育阶段及不同生理病理状态下的基因差异表达信息。理病理状态下的基因差异表达信息。1.1 单基因表达分析方法单基因表达分析方法:m 实时定量PCR（RT-PCR，real-time PCR）m Northern杂交（Northern Blotting Analysis）1.2 高通量方法高通量方法:m 微阵列（microarray）m 基因表达序列分析（SAGE，Serial analysis of gene expression)m 大规模平行信号测序系统（MPSS，Massively Parallel Signature Sequencing)一、转录组学的核心工作是分析基因表达谱1.1.1 实时定量实时定量PCRCt值：值：Real Time PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。信号达到设定的阈值时所经历的循环数。(C-代表代表Cycle，t-代表代表threshold）阈值：在扩增曲线的指数增长区域内适当位置上设定的荧阈值：在扩增曲线的指数增长区域内适当位置上设定的荧光检出界限。光检出界限。绝对定量：绝对定量：通过已知浓度的标准品制作的标准曲线对未知浓度的样品进行定量分析相对定量：相对定量：利用不同样品中目的基因的Ct值计算相对丰度，并利用管家基因的Ct值修正由于起始模板量的不同而造成的偏差。同一个样品重复同一个样品重复9696次次PCRPCR的扩增曲线的扩增曲线 CtCt值值+核酸杂交：不同来源的两条核酸单链由于具有互补序列，在一起复性时，互补序列配对，形成杂化分子。1.1.2 Northern杂交杂交探针标记物：放射性同位素、生物素或地高辛探针标记物：放射性同位素、生物素或地高辛杂交杂交探针探针模板模板SouthernNorthernWestern核苷酸核苷酸核苷酸核苷酸抗体抗体DNARNA蛋白质蛋白质 可检测同一基因的不同转录产物可检测同一基因的不同转录产物 可重复利用可重复利用 步骤多，操作复杂步骤多，操作复杂 灵敏度低灵敏度低Green increase of Cy3 sample transcriptsRed increase of Cy5 sample transcriptsYellow equal abundance1.2.1 微阵列微阵列微阵列技术的基本步骤微阵列技术的基本步骤n大规模表达谱或全景式表达谱（global expression profile）：是生物体（组织、细胞）在某一状态下基因表达的整体状况。n微阵列微阵列:利用光导化学合成、照相平板印刷以及固相表面化学合成等技术，在固相表面排列固定成千上万个寡核苷酸探针，并与放射性同位素或荧光物标记的来自不同细胞、组织或整个器官的mRNA反转录生成的第一链cDNA进行杂交，然后用特殊的检测系统对每个杂交点进行定量分析。ncDNA或EST芯片表达序列标签表达序列标签（Expressed Sequence Tag，EST）EST EST是指通过对是指通过对cDNA cDNA 文库文库随机随机挑取的克隆进行挑取的克隆进行大规模测序所获得的大规模测序所获得的cDNA cDNA 的的55或或33端序列，端序列，长度一般为长度一般为300 300 500 bp.500 bp.EST EST 是基因的是基因的“窗口窗口”，可代表生物体某种组，可代表生物体某种组织某一时间的一个表达基因，故被称之为织某一时间的一个表达基因，故被称之为“表达表达序列标记序列标记”可同时对大量基因，甚至整个基因组的基因表达可同时对大量基因，甚至整个基因组的基因表达进行对比分析进行对比分析快速、成熟、可靠、方便快速、成熟、可靠、方便仅针对已知基因仅针对已知基因难于进行绝对定量难于进行绝对定量无法分辨选择性拼接无法分辨选择性拼接nSAGE(Serial analysis of gene expression)的基本原理：利用锚定酶（anchoring enzyme，AE）和位标酶（tagging enzyme，TE）切割DNA分子的特定位置（一般近3端），分离SAGE标签（长约14 bp，可藉此鉴定基因组中的所有基因），并将这些标签串联起来，然后对其进行测序1.2.2 基因表达序列分析（基因表达序列分析（SAGE）nAnchoring Enzyme NlaIII,recognition site:nThe 3 terminus of adaptor A and Bare both TCCRACTAG,where a recognition site of Tagging Enzyme MmeI flanked with NlaIIIHu M,Polyak K.Nature Protocols 2006Tagging Enzyme MmeI recognition site:Hu M,Polyak K.Nature Protocols 2006主要理论依据：来自转录物内特定位置的一小段寡核苷酸序列（14bp）含有鉴定一个转录物特异性的足够信息，可作为区别转录物的标签（tag）；通过简单的方法将这些标签串联在一起，形成大量多联体（concatemer），对每个克隆到载体的多联体进行测序，并应用SAGE软件分析，可确定表达的基因种类，并可根据标签出现的频率确定基因的表达丰度（abundance）。特点：可全面提供生物体基因表达谱信息 可用来定量比较不同状态下组织或细胞的所有差异表达基因 快速有效快速有效 能够鉴定未知能够鉴定未知/新基因新基因 可以分辨某些基因的不同选择性拼接产物可以分辨某些基因的不同选择性拼接产物 对基因表达差异可提供定性和对基因表达差异可提供定性和定量分析定量分析 技术技术流程复杂，工作量大流程复杂，工作量大 标签特异性要求高（最近延长到标签特异性要求高（最近延长到21bp21bp）由于标签短很难确认新基因由于标签短很难确认新基因 某些转录产物不含有锚定酶某些转录产物不含有锚定酶nMPSS的原理：一个含有能够特异识别转录子的信息标签序列（1020 bp）与长的连续分子连接在一起，测出mRNA的一端包含一个10至20个碱基的标签序列。每一标签序列在样品中的频率（拷贝数）代表了与该标签序列相应的基因表达水平。基因表达水平是以计算mRNA拷贝数为基础，是一个数字表达系统。只要将病理和对照样品分别进行测定，即可进行严格的统计检验，能测定表达水平较低、差异较小的基因，而且不必预先知道基因的序列。1.2.3大规模平行信号测序系统大规模平行信号测序系统(MPSS)SAGE和和MPSS可鉴定未知可鉴定未知/新基因表达信息。新基因表达信息。可实现基因表达谱芯片很难检测某些特定时段可实现基因表达谱芯片很难检测某些特定时段表达或表达水平较低的基因或未知基因的表达。表达或表达水平较低的基因或未知基因的表达。n转录组分析可以提供特定条件下（生理、转录组分析可以提供特定条件下（生理、病理、诱导刺激等）基因表达的信息，通过使病理、诱导刺激等）基因表达的信息，通过使用基因碱基序列数据和比较已知及未知功能的用基因碱基序列数据和比较已知及未知功能的基因，推断相应未知基因的功能，揭示特定调基因，推断相应未知基因的功能，揭示特定调节基因的作用机制。节基因的作用机制。n通过这种基于基因表达谱的分子标签，通过这种基于基因表达谱的分子标签，不仅可以辨别细胞的表型归属，还可以用于疾不仅可以辨别细胞的表型归属，还可以用于疾病的诊断。病的诊断。1.3 转录组分析的作用转录组分析的作用n早期筛查 n疑难病症的诊治n对类似病症分型，进行针对性治疗国外有一临床病人表现出典型的白血病症状，但形态国外有一临床病人表现出典型的白血病症状，但形态学检测不典型，根据相关检查，诊断为学检测不典型，根据相关检查，诊断为AML（acute myeloid leukaemia,急性骨髓白血病），治疗几个月后未急性骨髓白血病），治疗几个月后未见好转。后来用见好转。后来用DNA芯片与病人骨髓的芯片与病人骨髓的mRNA杂交，结杂交，结果显示果显示AML和和ALL(acute lymphoblastic leukaemia急性成急性成淋巴细胞白血病淋巴细胞白血病)基因都表达较低，而在数据分析中发现，基因都表达较低，而在数据分析中发现，编码原肌球蛋白的基因表达极高，从而确诊为编码原肌球蛋白的基因表达极高，从而确诊为肺泡弹状肌肺泡弹状肌肉瘤肉瘤，改变治疗方案，病情出现缓解，改变治疗方案，病情出现缓解。人类基因组序列特点：人类基因组序列特点：2.52.5万个基因，与蛋白质合成有关的万个基因，与蛋白质合成有关的序列占整个基因组的序列占整个基因组的2%2%左右，其余左右，其余98%98%的基因组序列没有得的基因组序列没有得到注释。到注释。如果如果一个基因编码一个蛋白质的话，这么少的蛋白质如何一个基因编码一个蛋白质的话，这么少的蛋白质如何维持人体那么复杂而多变的生命现象？维持人体那么复杂而多变的生命现象？如果如果一个基因可以表达出多种蛋白，生物又是如何做到这一个基因可以表达出多种蛋白，生物又是如何做到这一点的？一点的？不不编码蛋白质的编码蛋白质的9898的基因组有何功能？的基因组有何功能？二、RNA组学研究全部非信使小RNA（snmRNA）n小分子小分子RNA是生物体内一类重要的特殊分子，是生物体内一类重要的特殊分子，诱导基因沉默，参与细胞生长、发育、基因诱导基因沉默，参与细胞生长、发育、基因转录和翻译等诸多生命活动的调控过程。转录和翻译等诸多生命活动的调控过程。nRNA组学研究范畴：组学研究范畴：小分子小分子RNA，包括：，包括：snRNA、snoRNA、scRNA、siRNA、miRNA等等等等352.1 miRNA（microRNA）是一大家族小分子非编码单链RNA，长度约2025个碱基，由一段具有发夹环结构，长度为7090个碱基的单链RNA前体(pre-miRNA)经Dicer酶剪切后形成。其活性形式是miRISC（miRNA-诱导的沉默复合物），调控基因的表达。其长度一般为2025个碱基；在不同生物体中普遍存在；其序列在不同生物中具有一定的保守性；具有明显的表达阶段特异性和组织特异性；miRNA 基因以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中，大多位于基因间隔区。miRNA的特点：小干扰小干扰RNA：是外源核酸分子入侵后由胞浆内的RNA核酸酶(Dicer)加工产生，其前体形式是长约21-30个核苷酸且3末端有2个核苷酸突出的双链RNA分子。具有特定长度(2123个碱基)和特定序列的小片段RNA。其活性形式是siRISC（siRNA-诱导的沉默复合物），与特异的靶mRNA完全互补结合，导致靶mRNA降解，阻断翻译过程。可作为宿主细胞的防卫机制保护基因组免于外源核酸分子的侵入。2.2 siRNA（small interferring RNA），。它 30bp 双链RNA（dsRNA）水解生成21-23nt siRNA 5335 RISC形成 识别特异序列并使其降解前体前体内源或外源长双链内源或外源长双链RNA诱导诱导产生产生发夹环结构的转录产物发夹环结构的转录产物结构结构双链分子双链分子单链分子单链分子功能功能降解降解mRNAmRNA阻遏其翻译阻遏其翻译靶靶mRNA 结合结合需完全互补需完全互补生物学效应生物学效应抑制转座子活性和病毒感染抑制转座子活性和病毒感染发育过程的调节发育过程的调节siRNA 和miRNA的差异比较保守性保守性保守保守不保守不保守miRNAmiRNA与与siRNAsiRNA作用机制的比较作用机制的比较siRNA也可经由多种不同转染（transfection）技术导入细胞内，并对特定基因产生具专一性的基因敲降（knockdown）效果，这使siRNA成为研究基因功能与药物目标的一项重要工具。也参与一些与RNAi相关的反应途径，例如抗病毒机制或是染色质结构的改变。由siRNA介导的基因表达抑制作用被称为RNA干涉(RNA interference，RNAi)。2.3 RNAi（RNA interference）RNAi 研 究 史1980年代，Rich Jorgensen 在矮牵牛花中发现转基因沉默1995年，researchers Guo 和Kemphues 注入反义RNA及正义链RNA都能抑制线虫par-1 基因的表达；1998年，Fire等注入双链RNA到线虫中发现比注入单链更有效，随后发展了通过RNAi进行线虫基因敲除的策略。随后，显微注射，基因枪，基因工程手段诱导RNAi也成为果蝇研究中的反向遗传学工具。2001年Elbashir等 Nature上首次报道通过21个核苷酸的siRNA成功地在哺乳动物培养细胞中诱导特异性基因沉默。随后，在小鼠等多种细胞中也取得了成功。v 功能基因组学 基因表达调控，基因功能研究v 基因治疗 候选治剂，药物靶位点鉴定v 转录调控机理研究RNAi技术的应用技术的应用计算机分析法：计算机分析法：利用计算机软件从已知基因组序列中寻找基因间利用计算机软件从已知基因组序列中寻找基因间区中的区中的snmRNA序列，然后模拟其高级结构，设计引物扩增其序列序列，然后模拟其高级结构，设计引物扩增其序列和克隆，或人工合成其序列，测定其功能。和克隆，或人工合成其序列，测定其功能。基因克隆法：基因克隆法：从特定组织中提取总从特定组织中提取总RNA，收集小的，收集小的RNA部分，转部分，转录为录为cDNA并进行并进行PCR及杂交（用来除去高丰度、已知的小及杂交（用来除去高丰度、已知的小RNA）。）。剩余剩余RNA进行测序及功能鉴定。进行测序及功能鉴定。蛋白质蛋白质-RNA分离法：分离法：分离蛋白质分离蛋白质-RNA复合物，除去蛋白质，复合物，除去蛋白质，纯化纯化RNA分子，反转录成分子，反转录成cDNA，克隆，测序，结果分析。，克隆，测序，结果分析。2.4 2.4 克隆克隆snmRNA的方法的方法