DXS6804基因座等位基因分型标准物的克隆制备及其群体遗传学研究

DXS6804基因座等位基因分型标准物的克隆制备及其群体遗传学研究 目的 用分子克隆技术制备DXS6804基因座等位基因分型标准物，并用于中国云南普米族人群的群体遗传学研究，解决长期困扰短串联重复序列分型上存在的准确性和标准化问题。方法 用PCR扩增出DXS6804基因座的各等位基因片段，PCR产物克隆后，DNA测序证实插入片段的大小和结构，按国际标准进行命名后，经扩大培养、扩增及再鉴定后，制备出该基因座的等位基因分型标准物，进行群体研究。结果 调查了中国云南地区普米族人群基因座的基因型分布频率，发现DXS6804基因座两个分型标准物外等位基因。结论 分子克隆技术是制备等位基因分型标准物的可靠方法，DXS6804基因座是一个适合我国法医学和群体遗传学分析的遗传标记。等位基因分型标准物；短串联重复序列；遗传多态性Study on the construction of standard DXS6804 allelic laddervia molecular cloning and its genetic polymorphismin Chinese yunnan pumi populationsABSTRACT: ObjectiveTo resolve the problem of the accuracy and standardization of STRPCR typing in forensic practice, construct DXS6804 allelic ladder by molecular clonning and apply them in a population study on the Pumi population in Yunnan, China. MethodsPCR was used to produce several different allelic fragments of the locus. After cloning the PCR products, the recombinant plasmids were sequenced. Then we denominated them and used them as template for reamplification to generate the locus standard ladder. ResultsThe sequencing results confirmed that the size and the construction of the inserts were correct. The genetic polymorphisms of this locus in Yunnan Pumi population of China were studied. Two offladder alleles of DXS6804 locus were found. ConclusionThis method is of high value for forensic DNA typing to construct standard ladders. DXS6804 is robust for genetic research and forensic application.KEY WORDS: allelic ladder; short tandem repeats; genetic polymorphism短串联重复序列(short tandem repeats, STR)是一类在人类基因组中分布广泛并且具有高度多态性的遗传标记。具有分型检测所需检材量少、尤其适合降解DNA的扩增等优点，被广泛应用于法医学个体识别和同一认定以及民事案件中的亲权鉴定12。特别是X染色体STR基因座，具有扩增片段短、等位基因多、分型方法简单、多态信息含量高的优点，更受到格外关注。而且它特别适用于法医学实践中在母方缺如(去世或失踪)情况下兄弟姐妹的亲权鉴定，另外，也可以作为性别的辅助鉴定，为法医学研究提供了一种新的工具。但是，由于目前已知的X染色体多态性遗传标记的数量较少，适用于法医学的更少，而且其研究方法还处于摸索阶段3。等位基因分型标准物(allelic ladder)是人群中常见的等位基因混合物，用来与未知样品比对确定基因型。只有具备了一套精确的、国际标准化命名的标准参照物，才有可能对STR分型结果作出正确的判型和命名,STR数据才能在各实验室之间进行交流和合作4。为此，我们应用分子克隆技术，在国内外首先制备出DXS6804基因座的等位基因分型标准物。应用自制的等位基因分型标准物，首次调查了中国云南地区普米族人群基因型分布频率，评价该基因座在法医学和群体遗传学中的应用价值。1对象与方法1.1对象1.1.1样本遵循知情同意原则，随机抽取中国云南地区100名普米族(其中女性49名)群体中无亲缘关系个体的静脉血，EDTA抗凝，-70保存。1.1.2引物引物序列查自GenBank(表1)，由奥科公司合成。1.1.3试剂2X Taq polymerase mix和DH5感受态细胞(天为时代公司)；质粒纯化试剂盒(Qiagen公司)；pGEMT Easy Vector System(美国Promega公司)；聚丙烯酰胺凝胶DNA回收试剂盒(Biospin公司)；EDTA等其余试剂均为国产分析纯。1.1.4仪器台式高速离心机(德国Hermle公司)；微量可调加样器(10、20、50、100、200、1000L)(法国Gilson公司)；三相恒压电泳仪(美国Bi aRad公司)；干热器(美国Bellco公司)；旋涡混匀器(日本Tomy kogyo公司)；超净工作台(中国扬州医疗设备厂)；低温冰箱(-30，-70)(日本Sanyo公司)；ABI3730自动测序仪(美国ABI公司)。1.2方法1.2.1制备标准分型物模板DNA通过Chelex100法5提取云南普米族群体样本DNA，PCR扩增。反应体系：总体积13L， 2Taq polymerase mix 6L，引物1L(5nmol/L)，DNA 2L，H2O 2L。反应条件见表1。用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR扩增产物，银染显色67。从群体样本的扩增产物中，选出了9个不同大小片段长度的等位基因，用聚丙烯酰胺凝胶DNA回收试剂盒纯化各个片断，制备成PCR再扩增的模板。1.2.2PCR再扩增、产物鉴定及纯化将制备好的9份DNA进行扩增，反应体系及条件如前。扩增产物进行电泳、银染后再确定其片段大小，并进行纯化。1.2.3PCR产物的克隆采用pGEMT Easy Vector System克隆试剂盒，将纯化后的PCR片段直接插入质粒的多克隆位点。重组后的质粒转化DH5感受态细胞，选择培养，再用以上的扩增方法筛选出含有正确插入片段的克隆。1.2.4重组质粒的DNA测序采用ABI3730全自动遗传分析仪，以质粒公用的M13正向引物对重组质粒的插入片段进行测序，确定插入片段的大小及组成，以国际法庭血液遗传学学会(international society of forensic haemogenetics, ISFH)推荐的命名原则进行各等位基因命名89。1.2.5重组质粒的扩大培养及保存对经测序证实的含有正确等位基因插入片段的质粒扩大培养。提取质粒后,得到该基因座的等位基因分型标准参照物的重组质粒。菌液加甘油后，-70保存。1.2.6等位基因分型标准物的制备和再鉴定以含该基因座等位基因插入片段的重组质粒DNA为模板,进行PCR扩增，反应体系及条件如前。纯化该基因座各等位基因的PCR产物，混合制备成等位基因分型标准物,通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染显色，验证所得分型标准物的可用性。将用分子克隆技术制备出的DXS6804基因座等位基因标准分型物用于云南地区普米族群体的遗传学研究。1.2.7数据分析利用SPSS12.0统计学软件计算该基因座等位基因片段的频率和基因型频率。利用2检验进行HardyWeinberg平衡吻合性检验10。根据等位基因和等位基因型频率，分别计算杂合度(H)、个人识别力(DP)、多态信息量(PIC)1112。