临床输血学检验(技术)：5白细胞抗原系统检测

Chongqing Medical UniversityChongqing Medical University第四章第四章 白细胞抗原检测技术白细胞抗原检测技术 P74P74临床血液教研室临床血液教研室Chongqing Medical UniversityChongqing Medical University第一节第一节 HLAHLA检测技术检测技术 P78P78 1、血清学方法 2、细胞学方法 3 3、分子生物学方法、分子生物学方法 HLA检测技术由抗原检测 等位基因检测 Chongqing Medical UniversityChongqing Medical UniversityHLAHLA分型技术的应用分型技术的应用 器官和造血干细胞移植供受者组织相容性配型 血小板输注前的配型 疾病相关实验性诊断 法医鉴定和亲子鉴定等。Chongqing Medical UniversityChongqing Medical University一、血清学分型方法一、血清学分型方法 血清学分型方法是用一系列已知的抗HLA抗原的标准分型血清来检测未知淋巴细胞表面的HLA抗原型别。需要HLA抗体作为分型试剂 采用微量淋巴细胞毒试验微量淋巴细胞毒试验测定HLA-A、B、C位点上的等位基因。Chongqing Medical UniversityChongqing Medical University1.1.微量淋巴细胞毒实验微量淋巴细胞毒实验 P74P74 1964年，Terasaki建立微量淋巴细胞毒实验 仍是目前HLA抗原鉴定的标准方法 条件：有活力的T,B淋巴细胞 HLA分型标准血清（大部分是IgG）Chongqing Medical UniversityChongqing Medical University原理原理 待检淋巴细胞膜表面若具有特异HLA抗原，可与HLA特异性抗体结合形成抗原抗体复合物，在补体介导下发生细胞毒反应而被杀伤。加入适当的染料（如曙红）后，被杀伤的淋巴细胞膜通透性增加，染料进入细胞内，细胞着色；若淋巴细胞不带有HLA抗原，抗原抗体未结合，则细胞膜完整，染料不能使细胞着色。在倒置显微镜下估计着色细胞的百分比来判断抗原、抗体反应的强度。Chongqing Medical UniversityChongqing Medical UniversityChongqing Medical UniversityChongqing Medical University方法评价与注意事项方法评价与注意事项 1血清学分型技术可以检测HLA-I类抗原，但此技术用于检测HLA-II类抗原难度较大，主要因为：（1）HLA-II类抗原在未激活的T细胞上不表达，需分离纯化B淋巴细胞。（2）HLA-II类抗原多态性由双等位基因构成，很难准确判定相应等位基因产物的抗原特异性。2HLA标准分型抗血清试剂的质量是试验的关键。（1）HLA抗血清应使用单克隆抗血清。（2）抗体效价要适宜。（3）抗血清种类应覆盖本民族、本地区80%以上的HLA抗原。Chongqing Medical UniversityChongqing Medical University 3.淋巴细胞：高活性，纯度应大于90%4.试验应在2025的室温条件下进行，才能获得最佳的反应效果。5.补体来源一般采用多只健康家兔血清混合。由于兔补体（兔血清）中无天然细胞毒抗体，不会引起假阳性反应。Chongqing Medical UniversityChongqing Medical University 6加入染料之后须加入甲醛，甲醛固定能使活细胞具有更大的折光性，易于与死细胞区别。7每块反应板应设立阴性对照（阴性对照血清一般采有AB型男性、无受血史者血清）和阳性对照（阳性对照孔中加入抗人淋巴细胞球蛋白），在阴性对照结果为阴性、阳性对照结果为阳性反应时，判读结果才可靠。Chongqing Medical UniversityChongqing Medical University 8HLA血清学分型技术虽经典，但存在标本血淋巴细胞高活力和纯度难以保证，HLA抗血清试剂存在交叉反应、弱反应及额外反应等众多因素，导致HLA血清学分型错误率较高，目前血清学方法已逐渐被基因分型技术所取代。Chongqing Medical UniversityChongqing Medical University二、二、HLAHLA细胞学分型技术细胞学分型技术 P77P77 对HLA-D抗原特异性进行分型，曾利用该技术鉴定了多个HLA-D、HLA-DP抗原。但由于该分型技术细胞来源困难、操作繁琐、试验流程长，不适合常规检测，而且该方法指定抗原偏差较大，故该分型技术已逐渐被淘汰。Chongqing Medical UniversityChongqing Medical University三、三、HLAHLA的基因分型技术的基因分型技术 自1996年，以DNA为基础的HLA的基因分型技术日趋成熟，并逐渐取代血清学方法和细胞学方法。成为最准确的分型技术。HLA基因分型检测是检测个体HLA座位上的等位基因序列等位基因序列情况 HLA血清学技术和细胞分型技术是检测HLA座位上的抗原抗原情况 特点：精确，可靠，重复性好。歧义结果 低分辨分型：*后第2位（抗原分解物水平分型）高分辨分型：*后第48位（等位基因水平分型）Chongqing Medical UniversityChongqing Medical University HLA HLA的基因分型方法的种类的基因分型方法的种类 1、基于HLA基因序列不同为基础;2、基于HLA等位基因在PAGE中不同的构象而设计。Chongqing Medical UniversityChongqing Medical University1.1.基于基于HLAHLA基因序列不同为基础基因序列不同为基础 PCR-SBT（PCR-直接测序分型）PCR-SSO（PCR序列特异性寡核苷酸探针）PCR-RFLP（PCR限制性片段长度多态性）PCR-SSP（PCR序列特异性引物）基因芯片技术Chongqing Medical UniversityChongqing Medical UniversityQiagen/Olerup SSP低分辨试剂低分辨试剂 Chongqing Medical UniversityChongqing Medical UniversityQiagen/Olerup SSP高分辨试剂高分辨试剂Chongqing Medical UniversityChongqing Medical University采用美国美国One LambdaOne Lambda公公司司PCR-SSPPCR-SSP ABDRDQ ABDRDQ配配型试剂盒型试剂盒肾移植供受者双方进行肾移植供受者双方进行HLA基因分型基因分型Chongqing Medical UniversityChongqing Medical University Qiagen/Olerup SBT 测序分型试剂测序分型试剂 Chongqing Medical UniversityChongqing Medical University 2.2.基于基于HLAHLA等位基因在等位基因在PAGEPAGE中不同构象而设计中不同构象而设计 PCR指纹技术 PCR-SSCP：PCR单链构象多态性 RSCA：参比链介导的构象分析Chongqing Medical UniversityChongqing Medical UniversityHLA分子生物学检测方法评价分子生物学检测方法评价 HLA基因分型法与血清学及细胞学分型方法比较，具有分辨率高、错误率少、样本需要量少、样本可长期保存、分型试剂可大量制备且来源不受限制、试验结果精确、可靠、重复性好等优点。Chongqing Medical UniversityChongqing Medical UniversityHLA高分辨分型中歧义结果高分辨分型中歧义结果 HLA具有极为复杂的多基因性和高度多态性。随着HLA等位基因的增多，同一位点不同等位基因之间的碱基差异序列较少，导致大量等位基因碱基序列高度同源，基因检测时可得到歧义的分型结果，不能明确指定某一基因型，特别是在高分辨率分型时。Chongqing Medical UniversityChongqing Medical University HLA抗原可引起免疫应答产生HLA抗体。HLA抗体在临床上具有重要意义，可诱发移植的超急性排斥反应、发热性非溶血性输血反应、血小板输注无效等。第二节第二节 HLAHLA抗体检测抗体检测Chongqing Medical UniversityChongqing Medical University群体反应性抗体（PRA）群体反应性抗体（panel reactive antibody，PRA）是指器官移植受者体内存在的抗HLA抗体。也可因妊娠、反复输血等而产生，与移植物排斥反应及受者存活率密切相关。PRA测定是筛选各种组织器官移植致敏受者和了解患者术后体内抗体水平简便易行的方法。Chongqing Medical UniversityChongqing Medical UniversityPRAPRA抗体检测方法抗体检测方法 1、补体依赖的淋巴细胞毒方法 2、ELISA 3、流式细胞术Chongqing Medical UniversityChongqing Medical University1.1.补体依赖的淋巴细胞毒方法补体依赖的淋巴细胞毒方法CDCCDC 适用：HLA-I，II类抗体，包括IgG，IgM 包括：淋巴细胞毒交叉配合试验 One Lambda细胞板方法 特点：灵敏度低，只能检测补体结合的抗体，不能检测非补体依赖的抗体，不能区分HLA特异性抗体和非特异性抗体。Chongqing Medical UniversityChongqing Medical University肾移植前群体反应性抗体肾移植前群体反应性抗体PRAPRA检测检测 淋巴细胞毒试验原理：将病人的血清与数十份含不同HLA抗原的淋巴细胞作细胞毒抗体测定来系统了解移植前患者的抗体水平，判断移植的可能性及与供者有阳性交叉的百分比。结果判断：通常将PRA值分为非致敏（10%），轻度致敏（10%-50%），高致敏（50%）。Chongqing Medical UniversityChongqing Medical University2.ELASA2.ELASA方法方法 特点：更敏感，特异性好，可检测HLA特异性抗体，可检测补体依赖或者非依赖的HLA抗体，可定量。应用：微量ELASA筛选HLA-I，II类抗体Chongqing Medical UniversityChongqing Medical UniversityChongqing Medical UniversityChongqing Medical UniversityChongqing Medical UniversityChongqing Medical UniversityChongqing Medical UniversityChongqing Medical University3 3 流式细胞术流式细胞术 普通流式细胞术普通流式细胞术 免疫磁珠流式细胞仪：免疫磁珠流式细胞仪：基于FCM和免疫标记技术的结合，以微球磁珠为靶细胞。Chongqing Medical UniversityChongqing Medical UniversityLuminex100/200Luminex100/200液相芯片液相芯片Chongqing Medical UniversityChongqing Medical UniversityChongqing Medical UniversityChongqing Medical UniversityLuminexLuminex检测技术用于检测技术用于HLAHLA抗体检测抗体检测 原理原理：以包被抗原的微球作为靶细胞，每种微球包被一种抗原，多种微球可以在同一体系内反应。当加入待检血清与微球在室温下孵育时，若待检血清中存在HLA抗体，则与包被不同HLA抗原的微球结合，形成抗原抗体复合物，洗涤后再加入荧光标记的抗人IgG抗体孵育，形成抗原-抗体-荧光标记抗体复合物，洗涤后经Luminex仪测定微球上的荧光值并通过识别颜色区分微球的类型，根据微球的荧光值大小和反应特性判断HLA抗体的强度和特异性。Chongqing Medical UniversityChongqing Medical UniversityLuminex-Luminex-新型生物技术平台新型生物技术平台