细菌α-淀粉酶产生菌种筛选

细菌8淀粉酶产生菌种筛选来源：生物信息网一. 实验目的1. 掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微生物的完整操作步骤。2. 巩固以前所学的微生物学实验技术。3. 学习淀粉酶活性的测定方法。二. 实验原理a-淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌，广泛分布于自然界，尤 其是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。从自然界筛选菌种的具体做法，大致可以分成以下四个步骤：采样、增殖培 养、纯种分离和性能测定。1、采样：即采集含菌的样品采集含菌样品前应调查研究一下自己打算筛选的微生物在哪些地方分布最 多，然后才可着手做各项具体工作。在土壤中几乎各种微生物都可以找到，因而 土壤可说是微生物的大本营。在土壤中，数量最多的当推细菌，其次是放线菌 第三霉菌，酵母菌最少。除土壤以外，其他各类物体上都有相应的占优势生长的 微生物。例如枯枝、烂叶、腐土和朽木中纤维素分解菌较多，厨房土壤、面粉加 工厂和菜园土壤中淀粉的分解菌较多，果实、蜜饯表面酵母菌较多；蔬菜牛奶中 乳酸菌较多，油田、炼油厂附近的土壤中石油分解菌较多等。2、增殖培养（又称丰富培养）增殖培养就是在所采集的土壤等含菌样品中加入某些物质，并创造一些有利于待 分离微生物生长的其他条件，使能分解利用这类物质的微生物大量繁殖，从而便 于我们从其中分离到这类微生物。因此，增殖培养事实上是选择性培养基的一种 实际应用。3、纯种分离在生产实践中，一般都应用纯种微生物进行生产。通过上述的增殖培养只能说我 们要分离的微生物从数量上的劣势转变为优势，从而提高了筛选的效率，但是要 得到纯种微生物就必须进行纯种分离。纯种分离的方法很多，主要有：平板划线 分离法、稀释分离法、单孢子或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。4、性能测定分离得到纯种这只是选种工作的第一步。所分得的纯种是否具有生产上所要求的 性能，还必须要进行性能测定后才能决定取舍。性能测定的方法分初筛和复筛两 种。初筛一般在培养皿上根据选择性培养基的原理进行。例如要测定淀粉酶的活力可 以把斜面上各个菌株一一点种在含有淀粉的培养基表面，经过培养后测定透明圈 与菌落直径的比值大小来衡量淀粉酶活力的高低。复筛是在初筛的基础上做比较精细的测定。一般是将微生物培养在三角瓶中作摇 瓶培养，然后对培养液进行分析测定。在摇瓶培养中，微生物得到充分的空气， 在培养液中分布均匀，因此和发酵罐的条件比较接近，这样，测得的结果更具有 实际的意义。三. 实验材料1、小铁铲和无菌纸或袋。2、无菌水三角瓶（300mL的瓶装水至99mL，内有玻璃珠若干）3、无菌吸管（1mL，5 mL等）4、无菌水试管（每支4.5mL水）5、无菌培养皿6、分离培养基蛋白胨1%； NaCl 0.5%；牛肉膏0.5%；可溶性淀粉0.2%；琼脂1.5%； pH7.2 ；水定容。注：先将可溶性淀粉加少量蒸馏水调成糊状，再加到溶化好的培养基中， 调匀。7、Lugol氏碘液：碘1克，碘化钾2克，水300毫升配制时先将碘化钾溶于5-10毫升水中，再加入碘，溶解后定容。8、麸曲培养基麸皮 7 克； 玉米面 1 克；（NH4）2SO4 0.04 克（4%（NH4）2SO4 加 1mL）；NaOH 0.08 克（8%NaOH 加 lmL）；水 10mL，混合均匀，装入250-300mL三角瓶中，15磅灭菌30分钟。9、碘原液：碘2.2%； 碘化钾0.4%；加水定容。10、标准稀碘液取碘原液15mL，加碘化钾8克，水定容200mL。11、比色稀碘液取原碘液2mL，加碘化钾20mg，定容至500mL。12、0.2%可溶性淀粉液称取0.2克可溶性淀粉，先以少许蒸馏水混合，再徐徐倾入煮沸蒸馏永 中，继续煮沸2分钟，冷却，加水至100mL。13、磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液pH6.0。称取Na2HPO4-12H20 11.31克，柠檬酸 2.02克，加水定容至250mL。14、标准糊精液称取0.3克糊精，悬浮于少量水中，再倾入400mL沸水中，冷却后，加水稀 释至500mL。冰箱存放。I青岛高科技工业园海博生物技术有限公司专业提供微生物培养基 qq: 1203100478 tel:0532-80925966羸四.实验方法：1、分离纯化 采集土样 样品稀释：在无菌纸上称取样品庄，放入100mL无菌水的三角瓶中，手摇10 分钟。80C水浴15分钟，冷却。用1mL无菌吸管吸取0.5mL注入4.5mL无菌 水试管中，梯度稀释至10-6。 分离：用稀释样品的同支吸管分别依次从10-6、10-5、10-4样品稀释液中，吸 取lmL,注入无菌培养皿中，然后倒入灭菌并融化冷至50C左右的固体培养基， 小心摇动冷凝后，倒置于35C温箱中培养48小时。 检查：培养48小时后，取出平板，将皿中注入l滴Lugol氏碘液，因淀粉 遇碘变蓝色，如菌落周围有无色圈，说明该菌能分解淀粉。 纯化：从平板上选取淀粉水解圈直径与菌落直径之比较大的菌落，用接种环沾 取少量培养物至斜面上，并进行2-3次划线分离，挑取单菌落至斜面上，培养后 观察菌苔生长情况并镜检验证为纯培养。2、夫曲培养取纯化菌落斜面中加入5毫升无菌水制成菌悬液，取2毫升接种全夫曲培养 基中，搅均后，36C培养24小时。3、酶活测定 制备酶液在已成熟的夫曲三角瓶中，加水100mL，搅匀，置30C水浴30分钟，用滤 纸过滤，滤液即细菌a-淀粉酶液，待测。 在三角瓶中，加入0.2%可溶性淀粉溶液2mL，缓冲液0.5mL,在60C水 浴中10分钟平衡温度，加入3m1酶液，充分混匀，即刻记时，定时取出一滴反 应液于比色板穴中，穴中先盛有比色稀碘液，当由紫色逐渐变为棕橙色，与标谁 比色管颜色相同，即为反应终点，记录时间(t)，单位为分钟。计算：淀粉酶活力单位=(60/t) x2x0.2%xf/3 (f/t) 式中f是酶的稀释倍数。1克或1mL酶制剂或酶液于60C，在1小时内液化可溶性淀粉的克数表示淀 粉酶的活力单位克/克(或毫升)小时。注意：淀粉液应当天配制使用，不能久贮。测定液化时间应控制在23分钟内。